高中生物同步備課系列【備學(xué)案】3.1 重組DNA技術(shù)的基本工具 導(dǎo)學(xué)案（教師版）-人教2019版選擇性必修3

第3章基因工程第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具導(dǎo)學(xué)案【生命觀念】闡明重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具的作用?！究茖W(xué)探究】進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定?！旧鐣?zé)任】認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新?！窘虒W(xué)重點】1.重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具的作用。2.DNA的粗提取與鑒定?！窘虒W(xué)難點】1.基因工程載體需要具備的條件。2.DNA的粗提取與鑒定?；蚬こ淌侵赴凑杖藗兊脑竿?，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。（1）原理：基因重組。（2）操作水平：分子水平。（3）操作環(huán)境：生物體外。一、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”1.來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。2.作用：識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。3.作用部位：磷酸二酯鍵，限制酶只切割兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。4.限制酶的命名：用生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌（Escherichiacoli)的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶，則進(jìn)一步表示成EcoRI?！舅伎肌磕隳芨鶕?jù)所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制。限制酶就是它的一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。5.識別序列：大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。限制酶所識別的序列的特點是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。6.切割結(jié)果：DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式——黏性末端和平末端。（1）實例1—EcoRⅠ限制酶：EcoRⅠ識別序列為GAATTC，EcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵，形成黏性末端。（2）實例2——SmaⅠ限制酶：SmaⅠ識別序列為CCCGGG，SmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵，形成平末端。【例1】寫出下列限制酶切割形成的黏性末端二、DNA連接酶——“分子縫合針”1.作用：將兩個DNA片段連接起來，恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵。注意：不是連接氫鍵（氫鍵的形成不需要酶的催化）。2.分類：種類E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體功能特性只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來，不能連接具有平末端的DNA片段既可以連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對較低）相同點恢復(fù)的都是磷酸二酯鍵【思考】DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？種類DNA聚合酶DNA連接酶不同點作用實質(zhì)催化單個核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵作用結(jié)果催化形成與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈，形成新的雙鏈DNA分子催化具有互補(bǔ)黏性末端或平末端的DNA片段連接起來，形成重組DNA分子模板需要不需要相同點①化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)②都是催化形成磷酸二酯鍵3.DNA連接酶、DNA聚合酶、限制酶、解旋酶的比較種類作用底物作用部位形成產(chǎn)物DNA連接酶DNA分子片段磷酸二酯鍵重組DNA分子DNA聚合酶脫氧核苷酸磷酸二酯鍵新的DNA分子限制酶DNA分子磷酸二酯鍵含黏性末端或平末端的DNA片段解旋酶DNA分子氫鍵單鏈DNA三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”1.作用：將外源基因送入受體細(xì)胞。2.種類：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒等。它們的來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差別。最常用的載體——質(zhì)粒：一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。3.作為載體需具備的條件（1）有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段（基因）插入其中。（2）能在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。（3）常有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。【例2】選用下圖載體將目的基因?qū)爰?xì)菌中并將含有目的基因的細(xì)菌篩選出來。（1）在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素B，則應(yīng)該選擇的限制酶為①或②。（2）在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素A，則應(yīng)該選擇的限制酶為①。【思考·討論·重組DNA分子】1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對？如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對，可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？不能，因為基因的長度一般在100個堿基對以上?！咎骄俊嵺`·DNA的粗提取與鑒定】1.實驗原理：（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。（2）DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。（3）在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色。2.實驗設(shè)計思路：DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法去除其他成分，對DNA進(jìn)行提取。3.方法步驟（1）研磨洋蔥：稱取約30g洋蔥切碎，放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。也可以選擇香蕉、菠菜、菜花和豬肝等作為實驗材料，提取DNA的方法可能稍有不同。（2）過濾獲取含DNA的上清液：在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。（3）冷卻酒精析出DNA：在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2～3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。（4）DNA的鑒定：取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCl溶液中。然后，向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜诜兴屑訜?min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化?！窘Y(jié)果分析與評價】1.你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何？觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍(lán)色說明實驗基本成功；如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實驗操作過程中出現(xiàn)了失誤等。2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質(zhì)嗎？本實驗粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。3.與其他同學(xué)提取的DNA進(jìn)行比較，看看實驗結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因。本實驗可以采取分組的方式進(jìn)行。可以選取不同的實驗材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法，對同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實驗結(jié)果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試劑顯色的深淺等，看看哪種實驗材料、哪種提取方法的效果更好。【課堂作業(yè)】1.限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶，以下說法正確的是（B）A.DNA連接酶連接的是兩條鏈堿基對之間的氫鍵B.限制酶只能切割雙鏈DNA片段，不能切割煙草花葉病毒的核酸C.E.coliDNA連接酶既能連接黏性末端，也能連接平末端D.限制酶主要從原核生物中分離純化而來，所以也能剪切自身的DNA2.下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯誤的是（D）A.DNA析出過程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂B.預(yù)冷的乙醇溶液可用來粗提取DNAC.用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行水浴加熱D.鑒定DNA時，應(yīng)將絲狀物直接加入到二苯胺試劑中進(jìn)行沸水浴3.圖1為某種質(zhì)粒結(jié)構(gòu)簡圖，圖2表示某外源DNA上的目的基因，小箭頭所指分別為限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位點。下列有關(guān)敘述錯誤的是（B

）A.在基因工程中若只用一種限制