腸道病毒71型基因組分析和sars冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的鑒定與分析

1/1腸道病毒71型基因組分析和sars冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的鑒定與分析中文摘要本文對(duì)腸道病毒71型(SHZH03毒株)進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定，利用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)了腸道病毒71型外殼蛋白vP2，對(duì)SAILS冠狀病毒的核蛋白(N)和突起子糖蛋白(s)進(jìn)行了鑒定與分析，研究結(jié)果如下：

1．腸道病毒71型(SHZH03毒株)全基因組序列測(cè)定對(duì)腸道病毒71型(eaterovirus71，EV71)國(guó)(深圳)分離株SHZH03基因組建立了覆蓋全基因組的8個(gè)首尾重疊的克隆，并在此基礎(chǔ)上對(duì)全基因組昧包括多聚腺苷酸尾)的7406個(gè)堿基進(jìn)行了核苷酸序列的測(cè)定和分析。

結(jié)果表明，SHZH03株基因組具有典型的腸道病毒71型的基因組結(jié)構(gòu)，在編碼區(qū)沒(méi)有核苷酸的缺失和插入；在5’UTR和3’UTR區(qū)，SHZH03在核苷酸序列和長(zhǎng)度上和其它EV71有差異，存在缺失和插入。

核苷酸同源性比較結(jié)果表明，在P1區(qū)，SHZH03株與臺(tái)灣流行株(TW2086、TW2272)的同源性較高，為87．9～92．5％；與新加坡流行株SIN5666、SIN5865以及標(biāo)準(zhǔn)株MS和BtCr的同源性則為80．4～82．3％，而與CoxsaldevirusAl6的同源性最低，為63+6％。

氨基酸同源性比較結(jié)果表明，在P1區(qū)SHZH03株與CoxsakievirusA16的同源性最低(79．8％)，但在p2和P3區(qū)，SHZH03株與CoxsakievirusAl6的同源性最高(98．3％和96．8％)。

P1區(qū)的遺傳進(jìn)化分析表明，SHZH03株和臺(tái)灣98年流行的EV71毒株的親緣關(guān)系較近，而與標(biāo)準(zhǔn)株BrCr和MS的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

外殼蛋白基因vPl的遺傳進(jìn)化分析表明，SHZH03和SHZH98以及臺(tái)灣1998年Ev71流行時(shí)的8個(gè)毒株屬于同一組(dusted。

這些結(jié)果提示了我國(guó)深圳地區(qū)流行的腸道病毒71型有可能來(lái)源于臺(tái)灣1998年的Ev71大規(guī)模流行時(shí)的毒株，對(duì)于我國(guó)EV71的基因分型、分子流行病學(xué)研究、EV71流行規(guī)律和疾病的治療與預(yù)防都有借鑒意義。

2．腸道病毒7l型外殼蛋白VP2在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)從細(xì)胞培養(yǎng)物中提取EV71病毒基因組RNA，再利用RTPCR技術(shù)，擴(kuò)增出EV71外殼蛋白基因VP2，連接于T載體，經(jīng)測(cè)序證實(shí)目的基因VP2的序列正確：

構(gòu)建酵母分泌型表達(dá)質(zhì)粒peIC9KfVP2，經(jīng)序列測(cè)定證實(shí)afactor信號(hào)肽和VP2的序列和閱讀框正確后，經(jīng)SacI酶切使之線性化，用電轉(zhuǎn)化法將目的基因轉(zhuǎn)化并整合到宿主菌GSl15基因組中；經(jīng)G418加壓篩選多拷貝整合菌株、轉(zhuǎn)化子表型篩選和PCR分析鑒定后以及甲醇誘導(dǎo)，在Pichiapastoris酵母中實(shí)現(xiàn)了VP2的高效分泌性表達(dá)。

經(jīng)飽和硫酸胺分級(jí)沉淀法初步純化后，重組蛋白VP2的純度可達(dá)90％以上。