DB12T 647-2016 大白菜品種純度SSR分子標(biāo)記檢測方法

67.050B

31

DB12天津 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB12/T

647—2016大白菜品種純度

分子標(biāo)記檢測方法Methods

of

identifying

purity

of

Chinese

by

using

2016-09-27

發(fā)布 2016-11-01

實施天津市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會發(fā)布DB12/T

647—2016 本標(biāo)準(zhǔn)按照

GB/T

—

給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)村工作委員會提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所、天津市蔬菜研究中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙新、王超楠、蘭青闊、王成、劉莉莉、朱珠、李梅、陳銳、徐石勇。本標(biāo)準(zhǔn)

年

9

月首次發(fā)布。DB12/T

647—2016

SSR

1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大白菜品種純度分子標(biāo)記檢測方法的術(shù)語和定義、檢測方法、純度計算方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于大白菜單交種的純度檢測。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

3543.2 農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程

扦樣GB/T

6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1品種純度

purity品種純度指種子在SSR分子標(biāo)記帶型方面典型一致的程度，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測樣品種子粒數(shù)的百分率表示，以反映某品種特征特性的一致性程度。3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

chain

reaction（PCR）一種在體外通過酶促反應(yīng)擴增特異片段的技術(shù)。3.3簡單重復(fù)序列

sequence

repeat（SSR）由幾個核苷酸（個）為重復(fù)單位聚集而成的長達(dá)幾十個至幾百個（一般為）的串聯(lián)重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星序列或短串聯(lián)重復(fù)序列，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。3.4分子標(biāo)記

以蛋白質(zhì)、核酸分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)，檢測生物在遺傳上的差異。4原理SSRPCR技術(shù)將多態(tài)的擴增出來，通過電泳檢測擴增產(chǎn)物，利用電泳圖譜進行大白菜品種純度檢測。DB12/T

647—20165儀器設(shè)備及試劑5.1 儀器設(shè)備PCR儀；測序電泳槽；水平電泳槽；高壓電泳儀（3000

V，400

，400

W）；萬分之一電子天-鍋；計等。5.2 試劑乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）；鹽酸（HCl，36%）；十二烷基硫酸鈉（SDS）；氯化鈉（NaCl）；氫氧化鈉（NaOH）；硼酸；去離子甲酰胺；溴酚藍(lán)；二甲苯青TEMED過硫酸銨；冰醋酸；硝酸銀；甲醛溶液（37%）；

DNA聚合酶（含Mg的10×PCR緩沖液）；四SSRGold

ViewGB/T6682規(guī)定的一級水等。除特殊說明外，所用試劑均為分析純試劑。5.3 溶液配制相關(guān)溶液配制方法見附錄A。6 方法步驟6.1 取樣按照GB/T

3543.2規(guī)定方法扦樣，從送檢樣品中隨機取10

g種子，分別隨機取其親本種子106.2 單粒種子的

DNA

提取6.2.1 樣品預(yù)處理在玻璃培養(yǎng)皿底部墊上一層厚度適宜的棉花，用自來水浸濕后均勻地撒上種子，再于表面覆蓋一1635℃光照培養(yǎng)，8小時備用。也可采用經(jīng)驗證的、等效的培養(yǎng)條件。6.2.2 DNA

取單株幼苗子葉，放入

mL離心管中，在液氮中研碎，放入

離心管中。將DNA提取液預(yù)熱到65

65

30

離心管中加入

μL

24:1氯仿-10

g離心

μL轉(zhuǎn)入另一支1.5

mL離心管，加入400

μL

℃預(yù)冷無水乙醇沉淀DNA。10

g離心1

，棄上清液，加入500

μL乙醇—乙酸銨溶液，6000

g5

收集沉淀。加入

μL

TE（pH8.0DNA0.8

%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。使用紫外-可見成像系統(tǒng)觀察DNA電泳條帶的完整性。6.3分子標(biāo)記篩選用30對核心引物進行PCR10份DNA互補性好的引物作為純度檢測的SSR分子標(biāo)記。6.4 PCR

DB12/T

647—20166.4.1 反應(yīng)體系總體積20

μL，包括

μL超純水、2

μL含Mg的10×PCR緩沖液、

μL

dNTPs（2.5

）、3.2

μL

SSR

2

μL

Taq

DNA2.5

U/μL2

μL

DNA（30~50

ng/μL6.4.2 反應(yīng)程序94

℃預(yù)變性5

；94

℃變性1

，58

℃退火45

s，72

℃延伸45

s3572

℃延伸7

；

℃保存?zhèn)溆谩?.5 變性聚丙烯酰氨凝膠電泳按照附錄C規(guī)定的方法，進行4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳檢測擴增產(chǎn)物。7 純度計算以篩選出來的分子標(biāo)記為引物擴增送檢樣品的DNA，通過帶型統(tǒng)計，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測樣品種子粒數(shù)的百分率表示純度，計算公式如下： 純度%

100%檢測樣品種子粒數(shù)DB12/T

647—2016附錄A（規(guī)范性附錄）溶液配制A.1 DNA提取液含有

Tris-HCl（pH

8.0250

NaCl，25

EDTA，0.5%SDS汽滅菌后使用。A.2引物稀釋按照引物合成單的說明先配制100

的儲存液，取適量儲存液稀釋40倍，配制濃度為mmol/L的使用液。A.3 6×變性上樣緩沖液去離子甲酰胺49

mL，0.5

的EDTA溶液（

）1mL，溴酚藍(lán)0.125

g，二甲苯青0.125

g。A.4 10×電泳緩沖液Tris

108g，硼酸55

g，

EDTA（pH

8.0）溶液37

，定容至1000

mL。A.540%丙烯胺膠丙烯酰胺

g，甲叉雙丙烯酰胺10

g，定容至500

。A.64.5%丙烯胺膠尿素

g，10×電泳緩沖液100

，40%丙烯酰胺膠112.5

mL，定容至1000

mL。A.7 1%親和硅烷20

μL親和硅烷，20

μL冰醋酸，加無水乙醇至2

mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。A.8 2%剝離硅烷1

mL剝離硅烷，49

mL三氯甲烷。A.9 10%過硫酸銨0.1

g過硫酸銨溶于1

超純水中?，F(xiàn)用現(xiàn)配。A.10 固定液DB12/T

647—2016200

mL冰醋酸，定容至

mL。A.11 染色液4

g硝酸銀，定容至2000

。A.12 顯影液2000

蒸餾水中加入40

g氫氧化鈉和10

甲醛。3’）01BC-1F:

R:

02BC-2F:

R:

03BC-3F:

CTTCCACAGGAGGAGACTGCR:

04BC-4F:

R:

05BC-5F:

R:

06BC-6F:

R:

07BC-7F:

R:

TGCGGTTTGAGCAGTAGTTG08BC-8F:

R:

09BC-9F:

R:

10BC-10F:

R:

11BC-11F:

R:

12BC-12F:

TCCCTCGTGACAAATCTCAAR:

13BC-13F:

R:

14BC-14F:

R:

15BC-15F:

R:

16BC-16F:

R:

17BC-17F:

R:

DB12/T

647—2016附

錄 B（規(guī)范性附錄）30

對核心引物3’）18BC-18F:

R:

19BC-19F:

R:

20BC-20F:

R:

21BC-21F:

R:

22BC-22F:

R:

23BC-23F:

R:

24BC-24F:

R:

25BC-25F:

AACGGATCTGACTTGGCATCR:

26BC-26F:

R:

27BC-27F:

R:

28BC-28F:

R:

29BC-29F:

R:

ACCCACATAGCATGAGAGCC30BC-30F:

R:

DB12/T

DB12/T

647—2016DB12/T

647—2016（規(guī)范性附錄）制膠過程C.1 凝膠制作將玻璃板洗凈，用無水乙醇擦兩遍，晾干。在長板上涂1%親和硅烷，在短板上涂2%玻璃硅烷。4.5%丙烯酰胺膠80

mL

80

μL和10%過硫酸銨

μL生。灌膠結(jié)束后，將梳子齒向外，輕輕的插入膠中，使其聚合1

h以上。C.2 預(yù)電泳待膠凝固后，拔出梳子，將電泳槽組裝好，80

W恒功率下預(yù)電泳15

。C.3 變性在20

μL

PCR產(chǎn)物中加入4

μL

6×變性上樣緩沖液，混勻后，在PCR儀上運行變性程序：95

℃變性5

，4

℃冷卻

。C.4 電泳用洗耳球吹洗加樣槽