微流控芯片快速測(cè)定鹽酸二甲雙胍片中鹽酸二甲雙胍的含量

微芯片毛細(xì)管電泳快速測(cè)定鹽酸二甲雙胍溫飛容，蘇子豪，翟海云*，劉珊珊，余曉(廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣東廣州510006)摘要：建立了微芯片毛細(xì)管電泳非接觸電導(dǎo)檢測(cè)法快速測(cè)定片劑中鹽酸二甲雙胍含量的方法。探討緩沖液類型、濃度，添加劑種類、濃度及分離電壓、進(jìn)樣時(shí)間等因素對(duì)分離檢測(cè)的影響。實(shí)驗(yàn)采用2.0mmolL-1檸檬酸-5%乙醇-0.1mmolL-1SDS為緩沖溶液，分離電壓1.3kV，在1min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了鹽酸二甲雙胍的快速分離測(cè)定。在10.0~110.0μgmL-1范圍內(nèi)，峰高與濃度呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為1.0μgmL-1（S/N=3），RSD=2.1%，加標(biāo)回收率為94.5~103%。片劑中輔料在該條件下不干擾測(cè)定，可成功測(cè)定鹽酸二甲雙胍片中的鹽酸二甲雙胍含量。關(guān)鍵詞：微芯片毛細(xì)管電泳；非接觸電導(dǎo)檢測(cè)；鹽酸二甲雙胍片；鹽酸二甲雙胍RapidDeterminationofMetforminHydrochloridebyMicrochipCapillaryElectrophoresiswithContactlessconductivitydetectionWENFei-rong,SUZi-hao,ZHAIHai-Yun*,LIUShan-shan,YUXiao(DepartmentofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)Abstract：Amethodwasstudiedfortherapiddeterminationofmetforminhydrochlorideinmetforminhydrochloridetabletsbymicrochipcapillaryelectrophoresiswithcontactlessconductivitydetection.Effectsofthetypeandconcentrationofbufferandadditive,separationvoltageandinjectiontimeontheseparationanddetectionwereinvestigated.Metforminhydrochloridewasseparatedanddetectedinthebuffersolutionof2.0mmolL-1citricacidwith5%ethanoland0.1mmolL-1SDSataseparationvoltageof1.3kVwithin1min.Thepeakheightshowedagoodlinearrelationshipwiththeconcentrationofmetforminhydrochloriderangedfrom10.0μgmL-1to110.0μgmL-1,thelimitofdetectionreached1.0μgmL-1(S/N=3),theRSDwas2.1%andtherecoverieswere94.5%~103%.Themethodwasusedfordetectionofmetforminhydrochlorideinmetforminhydrochloridetabletssuccessfullyforthedressinginthetabletsdidn’tinterferedetermination.Keywords：MicrochipcapillaryelectrophoresisContactlessconductivitydetectionMetforminhydrochloridetabletsMetforminhydrochloride鹽酸二甲雙胍(Metforminhydrochloride)，是超重或肥胖II型糖尿病患者的降血糖藥，其水溶性好，不易在體內(nèi)蓄積，致乳酸中毒發(fā)生率低，是目前廣泛使用的雙胍類降糖藥，故建立準(zhǔn)確、靈敏、快速、簡(jiǎn)單的鹽酸二甲雙胍含量分析方法在臨床醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)、肥胖病治療研究等方面有重要意義。收稿日期：2013-3-29；修回日期：2013-11-7基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21005021)作者介紹:溫飛容(1991年－)，女，在讀藥物分析專業(yè)本科生；聯(lián)系人：翟海云(1975年－)，女，博士，副教授。E-mail:zhaihaiyun@126.com中國(guó)藥典采用高效液相色譜法測(cè)定鹽酸二甲雙胍的含量[1]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)鹽酸二甲雙胍的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[2-6]和分光光度法[7-8]、此外還有電化學(xué)法[9-10]、毛細(xì)管電泳法[11]等。液相色譜相關(guān)報(bào)道最多，但其分析時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，成本高，樣品處理繁瑣，柱子易被污染，流動(dòng)相多為有毒溶劑。分光光度法專屬性不強(qiáng)，易受共存組分的干擾。電化學(xué)法在應(yīng)用過(guò)程中，所需樣品量較多，重現(xiàn)性較差，易造成測(cè)定誤差。毛細(xì)管電泳法方法較簡(jiǎn)便，但檢測(cè)時(shí)間仍需5min，需進(jìn)一步提高分析速度。在弱酸性條件下，鹽酸二甲雙胍因質(zhì)子化而帶正電，可采用電導(dǎo)法檢測(cè)，本文采用為微芯片毛細(xì)管電泳電導(dǎo)檢測(cè)法對(duì)之進(jìn)行分析，成功地實(shí)現(xiàn)了片劑中鹽酸二甲雙胍的快速檢測(cè)。1試驗(yàn)部分1.1儀器與試劑PMMA十字通道芯片(微通道上寬30μm，下寬100μm，深30μm，進(jìn)樣通道為十字結(jié)構(gòu)，分離通道長(zhǎng)44mm，有效分離長(zhǎng)度43mm，由大連理工大學(xué)微系統(tǒng)研究中心提供)；微型壓電陶瓷高壓電源[12]，非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器[13-15]；微流控芯片分析儀CCD-08B（中山大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)藥儀器與應(yīng)用研究所）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏儀市英峪予華儀器廠）；DA-3A超聲波提取器（順德樂(lè)從靈通電子廠）；PCL-711B型A/D卡（臺(tái)灣EVOC公司）；數(shù)據(jù)工作站（中山大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)藥儀器與應(yīng)用研究所），數(shù)據(jù)記錄與處理在普通P4微機(jī)上完成。鹽酸二甲雙胍對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所）；鹽酸二甲雙胍片（深圳市中聯(lián)制藥有限公司出品，批號(hào)0907178）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。1.2對(duì)照品和樣品溶液的制備稱取鹽酸二甲雙胍對(duì)照品0.0100g，用超純水溶解并定溶于10mL容量瓶，制得1.0mgmL-1的儲(chǔ)備液，4℃下保存。各種濃度的對(duì)照品溶液可在臨用時(shí)由儲(chǔ)備液稀釋得到。取鹽酸二甲雙胍片20片，小心剝除糖衣，稱重，求得平均片重。將已剝除糖衣的鹽酸二甲雙胍片20片研細(xì)，稱取0.1000g，加20mL水，超聲溶解10min，過(guò)濾，取殘?jiān)尤?0mL水，再次超聲溶解10min，過(guò)濾，合并兩次的濾液，用水定容于100mL容量瓶中，得供試樣品溶液，儲(chǔ)于4℃冰箱。進(jìn)樣前，所有溶液都要用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾。1.3試驗(yàn)方法新芯片使用前用0.1molL-1HNO3溶液沖洗并浸泡30min。每次實(shí)驗(yàn)使用芯片前，用0.1molL-1HNO3溶液沖洗并浸泡30min，再用蒸餾水沖洗10min，十字通道依次用0.1molL-1NaOH溶液活化20min，再用蒸餾水沖洗10min和緩沖液平衡20min。每天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用0.1molL-1HNO3溶液沖洗通道，再用水充滿通道，以防止通道堵塞。進(jìn)樣電壓100~500V，分離電壓500~4000V；非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器選擇激發(fā)電壓60V(Vp-p)和激發(fā)頻率60kHz。實(shí)驗(yàn)在濕度較低的(低于60%)條件下進(jìn)行2結(jié)果與討論2.1緩沖液的選擇鹽酸二甲雙胍在弱酸性條件下可質(zhì)子化而帶上正電荷，與電滲方向一致，能實(shí)現(xiàn)快速分離。本實(shí)驗(yàn)比較了MES-His、醋酸-醋酸鈉、NaH2PO4-H3PO4、乳酸、檸檬酸、醋酸、檸檬酸-檸檬酸鈉幾種酸性緩沖液體系對(duì)分離檢測(cè)效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MES-His、醋酸、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系中，鹽酸二甲雙胍不出峰。在醋酸-醋酸鈉緩沖體系中，基線不穩(wěn)定，進(jìn)樣濃度低時(shí)峰形較好，但進(jìn)樣濃度高時(shí)峰形較差，出峰較慢。在H3PO4-NaH2PO4緩沖體系中，基線噪音大，二甲雙胍出峰晚，峰形差。在乳酸緩沖體系中，基線噪音大，產(chǎn)生未知峰，出峰慢。在檸檬酸緩沖體系中，基線穩(wěn)定，鹽酸二甲雙胍峰形相對(duì)較好，檢測(cè)靈敏度較高，與系統(tǒng)峰分離度大，適于分離檢測(cè)，故選擇檸檬酸作為緩沖體系。實(shí)驗(yàn)比較了不同濃度的檸檬酸(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmolL-1)對(duì)分離檢測(cè)效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著檸檬酸濃度的增加，鹽酸二甲雙胍的峰高逐漸降低；當(dāng)檸檬酸濃度超過(guò)2.0mmolL-1時(shí)，拖尾因子逐漸增大。綜合檸檬酸濃度對(duì)峰高和拖尾因子的影響，選擇2.0mmolL-1檸檬酸為分離介質(zhì)。2.2有機(jī)添加劑的影響實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為有機(jī)添加劑，考察加入不同比例乙醇(1%~10%，體積比)的體系對(duì)分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著乙醇比例的增加，電滲流降低，鹽酸二甲雙胍的出峰時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，加入1%~5%含量的乙醇時(shí)，二甲雙胍的半峰寬逐漸減??；當(dāng)乙醇比例為5%~10%時(shí)，二甲雙胍的半峰寬先增大后逐漸減小。故實(shí)驗(yàn)選擇添加5%的乙醇。在添加5%乙醇的基礎(chǔ)上，比較加入不同比例β-CD時(shí)對(duì)分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-CD的加入對(duì)峰形和分離度沒(méi)有改善作用。在添加5%乙醇的基礎(chǔ)上，又比較了加入不同濃度SDS對(duì)分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1mmolL-1SDS的加入使分離度增大。實(shí)驗(yàn)選擇含5%乙醇和0.1mmolL-1SDS的2.0mmolL-1檸檬酸為分離介質(zhì)。2.3進(jìn)樣時(shí)間的選擇實(shí)驗(yàn)比較了進(jìn)樣時(shí)間為5.0~20.0s對(duì)分離檢測(cè)的影響。結(jié)果表明，隨著進(jìn)樣時(shí)間的增加，峰高逐漸增加，當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間超過(guò)10.0s后，峰高增大的幅度逐漸降低，且隨著進(jìn)樣時(shí)間的進(jìn)一步增加，諸多不利因素如樣品區(qū)帶擴(kuò)散等導(dǎo)致峰形變差。綜合峰形和分離度等考慮選擇10.0s為進(jìn)樣時(shí)間。2.4分離電壓增大電場(chǎng)強(qiáng)度可以提高組分的遷移速度，從而縮短遷移時(shí)間和減少區(qū)帶擴(kuò)散，故增加分離電壓是提高組分分離效率的重要手段。實(shí)驗(yàn)比較了分離電壓為0.8~2.0kV時(shí)對(duì)峰形的影響。結(jié)果顯示，隨著分離電壓的提高，半峰寬逐漸減小；從1.3kV開(kāi)始，半峰寬變化不大，但分離度逐漸變小。實(shí)驗(yàn)選擇半峰寬較小、分離度較好的1.3kV為分離電壓。2.5電泳條件、線性范圍和檢出限綜合以上優(yōu)化選擇的結(jié)果，在緩沖液為5%乙醇-0.1mmol/LSDS的2.0mmolL-1檸檬酸，進(jìn)樣時(shí)間為10.0s，分離電壓為1.3kV的條件下實(shí)現(xiàn)了對(duì)鹽酸二甲雙胍的分離檢測(cè)，其微芯片毛細(xì)管電泳圖譜見(jiàn)圖1(a)。在10.0~110.0μgmL-1范圍內(nèi)，鹽酸二甲雙胍的峰高(Y)與濃度(ρ:μgmL-1)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=78.8ρ+550(r=0.9989)，檢出限為1.0μgmL-1(S/N=3)。在優(yōu)化條件下，以鹽酸二甲雙胍50.0μgmL-1對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次測(cè)定相應(yīng)的峰高，峰高的RSD為2.1%(n=6)。理論塔板數(shù)為2509m-1。1-系統(tǒng)峰；2-鹽酸二甲雙胍圖1鹽酸二甲雙胍對(duì)照品(a)和樣品(b)的芯片毛細(xì)管電泳圖Fig.1Electropherogramsofmetforminhydrochloridestandard(a)andsample(b)solutions2.6樣品分析取片劑樣品溶液適當(dāng)稀釋，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣3次，在優(yōu)化條件下分離測(cè)定，其芯片毛細(xì)管電泳圖譜見(jiàn)圖1(b)。取3次測(cè)得的峰高的平均值，代入線性回歸方程計(jì)算出每片鹽酸二甲雙胍片中鹽酸二甲雙胍的含量為0.257g片-1(標(biāo)示量為0.25g片-1)，為標(biāo)示量的103%。將對(duì)照品溶液與樣品溶液按不同比例混合，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)加入回收率結(jié)果如表1所示。表1回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.1Resultsofrecoverytest樣品含量ρ/(μgmL-1)加標(biāo)量ρ/(μgmL-1)測(cè)得總量ρ/(μgmL-1)回收率/%RSD/%41.220.061.81079.094.50.8041.260.099.697.30.633.結(jié)論采用微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測(cè)方法在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下1min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)鹽酸二甲雙胍片中主成分鹽酸二甲雙胍的快速分離檢測(cè)。在該條件下，鹽酸二甲雙胍峰形較好，出峰快，分離效果好，輔料在選定的條件下不干擾測(cè)定。此法操作簡(jiǎn)單，試劑試樣消耗少，分析成本低，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是制劑質(zhì)量控制中一種極具發(fā)展?jié)摿Φ姆治龇椒ā⒖嘉墨I(xiàn)[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì),中華人民共和國(guó)藥典[S](二部).北京,化學(xué)工業(yè)出版社.2010,624.[2]韓菊云.高效液相法測(cè)定鹽酸二甲雙胍中二甲雙胍的含量[J].中國(guó)基層醫(yī)藥,2003,10(11):1179.[3]孫凌云.HPLC法測(cè)定鹽酸二甲雙胍片的含量和有關(guān)物質(zhì)[J].安徽醫(yī)藥,2010,14(4):408-410[4]潘潔,金小平,黃仲義,等.HPLC測(cè)定鹽酸二甲雙胍緩釋片的血藥濃度[J].華西藥學(xué)雜志,2006,21(5):487-489.[5]方利明,魏敏吉.RP-HPLC法測(cè)定格列雙胍膠囊中鹽酸二甲雙胍的含量[J].藥物分析雜志,2004,24(5):555-557.[6]李藝,王紅,張良珂,等.HPLC法測(cè)定鹽酸二甲雙胍緩釋片中鹽酸二甲雙胍的含量[J].中國(guó)藥房,2011,22(24):2296-2297.[7]杜力巍,楊衛(wèi)東.紫外分光光度法測(cè)定鹽酸二甲雙胍緩釋片含量[J].河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2004,22(1):21-22.[8]吳芳,陳連劍