生物制品中DNase殘留檢測－核酸熒光底物法編制說明

5/54《生物制品中DNase殘留檢測－核酸熒光底物法》征求意見稿編制說明一、工作簡況（一）任務(wù)來源按照《中國食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理辦法（試行）》的有關(guān)規(guī)定和要求，由國家藥品監(jiān)督管理局疫苗及生物制品質(zhì)量監(jiān)測與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、武漢瀚海新酶生物科技有限公司提出《生物制品中DNase殘留檢測－核酸熒光底物法》立項(xiàng)申請，中國食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)于2024年4月組織專家按程序?qū)徸h后予以立項(xiàng)。（二）目的、意義及必要性脫氧核糖核酸酶（DNase）是一種可以將聚核苷酸鏈的磷酸二酯鍵切斷從而降解DNA分子的水解酶。DNase普遍存在于環(huán)境和許多生物材料中，且具有極強(qiáng)的活性，微量的DNase污染可以造成大量DNA的降解，對實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)工藝造成顯著影響。DNA藥物及質(zhì)粒等生物制品生產(chǎn)過程中，也存在大量DNase的殘留和污染的可能性，包括生物樣品中含有的內(nèi)源性DNase，存在于環(huán)境中的水，緩沖液，耗材表面以及環(huán)境微生物和人等外源性DNase。殘留DNase作為雜質(zhì)，如果跟隨藥物或生物制品進(jìn)入人體內(nèi)，有可能引發(fā)高強(qiáng)度的免疫原性等反應(yīng)，引起較嚴(yán)重的安全性風(fēng)險(xiǎn)。因此需要對生物制品的外來物料、耗材和環(huán)境等的DNase殘留進(jìn)行準(zhǔn)確分析檢測，使之控制在安全范圍內(nèi)?！吨腥A人民共和國藥典2020年版》中就《人用疫苗總論》《人用重組單克隆抗體制品總論》《人用基因治療制品總論》及《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》均提到了在該類型生物制品的研發(fā)及生產(chǎn)過程中需要對工藝雜質(zhì)中包含DNase的殘留進(jìn)行控制；此外，歐洲藥品監(jiān)督管理局表明基因治療產(chǎn)品方面應(yīng)制定檢驗(yàn)方法，并設(shè)定上限，以檢測細(xì)胞來源污染物的殘留水平。然而目前國內(nèi)外暫沒有通用標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定疫苗和生物制品中核酸酶殘留量上限及其對應(yīng)的檢測方法。核酸水解凝膠電泳法和紫外分光光度計(jì)法常被用于檢測DNase的殘留，然而核酸水解凝膠電泳法受實(shí)驗(yàn)人員的主觀判斷影響較大，無法準(zhǔn)確定量，且操作時(shí)間長，測定通量較低；核酸水解紫外分光光度法定量限僅為0.01U/μL，不適合微量核酸酶殘留的活性檢測；高效液相色譜法和電化學(xué)法則受限于儀器設(shè)備。相比之下，核酸熒光底物法靈敏度高、檢測速度快且能實(shí)現(xiàn)核酸酶活性的定量檢測，該方法在海外已用于檢測分子生物學(xué)環(huán)境及試劑中核酸酶殘留量，如日本W(wǎng)AKO公司分子級別的無核酸酶化學(xué)品采用該方法作為質(zhì)量認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)之一，德國Sartorius也將該方法作為無核酸酶耗材的質(zhì)量認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)。2023年4月，為進(jìn)一步提升《中國藥典》生物制品標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性，更好地保障生物制品質(zhì)量，國家藥典委員會(huì)設(shè)立了核酸酶殘留量檢測方法研究的課題，并在《關(guān)于征求核酸酶殘留量檢測方法驗(yàn)證意見的函》中提出了核酸酶殘留量測定法（核酸熒光底物法）的草案。（三）團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)起草單位和主要起草人本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：武漢瀚海新酶生物科技有限公司、國家藥品監(jiān)督管理局疫苗及生物制品質(zhì)量監(jiān)測與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中生復(fù)諾健生物科技（上海）有限公司、江蘇申基生物科技有限公司、蘇州艾博生物科技有限公司、北京引正基因科技有限公司、深圳市晉百慧生物有限公司、惠正奇醫(yī)藥（廣州）有限公司、廣州正達(dá)醫(yī)藥科技有限公司、百奧泰生物制藥股份有限公司、深圳深信生物科技有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊廣宇、耿玉杰、李梁、嚴(yán)壯、陸家海、葉宇翔、武飛飛、竺添、沈明云、顧文藝、于磊、黃賢明、梅雄、李文華。（四）主要工作起草階段：（1）2024年4月19日，完成《生物制品中DNase殘留檢測－核酸熒光底物法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)。（2）2024年4月，成立標(biāo)準(zhǔn)制定工作組。按照團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的制修訂程序組織參編單位共同成立標(biāo)準(zhǔn)制定工作組。（3）2024年4月-5月，完成第一稿。結(jié)合收集到的資料和起草小組專家深厚的專業(yè)知識(shí)，完成標(biāo)準(zhǔn)草案的第一稿。（4）2024年8月，進(jìn)入草案的修訂完善階段。經(jīng)過多輪深入研討，并廣泛咨詢行業(yè)內(nèi)的資深專家以及國家標(biāo)準(zhǔn)制定的資深專家。在聽取各方意見和充分論證的基礎(chǔ)上，對標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行修訂和完善，確保草案的準(zhǔn)確性、完整性和一致性。在標(biāo)準(zhǔn)草案基礎(chǔ)上，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組對標(biāo)準(zhǔn)框架和主要技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行了再次討論與修改，并進(jìn)一步規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)文本格式，形成標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿與編制說明。二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)的制定符合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的原則，本著先進(jìn)性、科學(xué)性、合理性和可操作性的原則，以及標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)、統(tǒng)一性、協(xié)調(diào)性、適用性、一致性和規(guī)范性原則來進(jìn)行本標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。本標(biāo)準(zhǔn)起草過程中，主要按GB/T1.1－2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》進(jìn)行編寫。本標(biāo)準(zhǔn)制定過程中，引用或參考了以下標(biāo)準(zhǔn)或文件：[1]LeeKJ,LeeWS,HwangA,etal.Simpleandrapiddetectionofbacteriausinganuclease-responsiveDNAprobe[J].Analyst,2017,143.[2]EisenbeisJ,SaffarzadehM,PeiskerH,etal.TheStaphylococcusaureusextracellularadherenceproteinEapisaDNAbindingproteincapableofblockingneutrophilextracellulartrapformation[J].Frontiersincellularandinfectionmicrobiology,2018,8:235.[3]VanderGuchtM,AktanMK,HendrixH,etal.qDNaseassay:Aquantitativemethodforreal-timeassessmentofDNaseactivityoncoatedsurfaces[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2021,534:1003-1006.（二）確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)本項(xiàng)目基于各起草單位前期已利用核酸熒光底物法技術(shù)開發(fā)了脫氧核糖核酸酶殘留量檢測技術(shù)的基礎(chǔ)，結(jié)合國內(nèi)、外相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，形成適用于生物制品中DNase殘留檢測－核酸熒光底物法，可以彌補(bǔ)國內(nèi)目前該領(lǐng)域在法規(guī)層面和技術(shù)層面的空白，對推動(dòng)我國核酸酶殘留檢測技術(shù)的發(fā)展以及其在疫苗和生物制品方面的發(fā)展和應(yīng)用具有重要作用。本標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容如下：1.方法學(xué)原理試樣與核酸熒光底物一起孵育，試樣中殘留的DNase催化核酸熒光底物分解，降解產(chǎn)物在對應(yīng)波長的激發(fā)下會(huì)發(fā)出熒光，通過熒光檢測器檢測，外標(biāo)法定量，測定DNase的含量。2.分析步驟(1)環(huán)境要求所有試驗(yàn)操作均應(yīng)在潔凈的無外源DNase環(huán)境中進(jìn)行。所有試驗(yàn)操作均應(yīng)使用潔凈的無外源DNase耗材。(2)試驗(yàn)溶液的制備核酸熒光底物溶液、樣本稀釋溶液、液體樣品待測液制備、標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備等。(3)酶促反應(yīng)供試品、標(biāo)準(zhǔn)品、對照品。3.結(jié)果分析定性分析、定量分析、定量限及重復(fù)性。三、與現(xiàn)行法律法規(guī)、強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)和其他有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系，采用國際標(biāo)準(zhǔn)的程度及水平簡要說明本標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行法律法規(guī)、強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)和其他有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。本標(biāo)準(zhǔn)制定