蛋白質定性定量分析培訓教材

2024/9/271蛋白質的定性定量分析第二章2024/9/272蛋白質的含量測定凱氏定氮法：1883年丹麥化學家Kjeldhl建立，經(jīng)后人改良后形成的一種定量測定蛋白質最為精確、敏感的方法。原理：蛋白質的含氮量為16％，只要測出樣品中氮的含量，即可計算出蛋白質的含量樣品中蛋白質的含量＝N×6.252024/9/273凱氏定氮的基本流程：1、消化：生物樣品與濃硫酸共煮，樣品蛋白質被無機化，其中氮元素轉變?yōu)榱蛩徜@。Pr＋H2SO4CO2＋H2O＋(NH4)2SO4(NH4)2SO4+2NaOHNH4OH+H2SO4NH4OH+HClNH4Cl+H2O2024/9/2752024/9/2762024/9/277凱氏法的評價：優(yōu)點：缺點：1、適用于一切形態(tài)的樣品；2、不用比色，對混濁不透明的樣品也可進行分析；3、結果的精、準度較高。1、樣品中含有非蛋白態(tài)氮時影響分析結果；2、組成蛋白質的氨基酸可影響分析結果；3、操作復雜，對操作者的要求高。2024/9/278Lowry法Lowry法原理：是在雙縮脲法和Folin酚法的基礎上建立的一種新的蛋白質定量方法。蛋白質在堿性條件下與銅離子反應生成紫紅色絡合物。然后再與Folin試劑反應生物深藍色。顏色與蛋白質含量成正比，符合朗伯－比爾定律。2024/9/279方法評價優(yōu)點1、可對多個樣品同時進行分析，操作簡便；2、結合Folin酚法，提高了分析的靈敏度；3、結合雙縮脲法，避免了Folin酚法的局限。缺點1、比色測定，要求顯色后溶液透明，且樣品必需可溶；2、酚方式劑在堿性溶液中穩(wěn)定性差，顯色后需盡快比色；3、干擾反應的因素較多。2024/9/271000.20.40.60.81.0mg/mlA0.80.60.40.22024/9/27112024/9/2712紫外吸收法原理：蛋白質在紫外區(qū)有兩個吸收峰，其一為280nm，由芳香氨基酸上共軛雙鍵引起，芳香氨基酸在各種蛋白質的的含量差別不大，測蛋白質溶液在280nm處的吸收值可計算出樣品中蛋白質的含量。蛋白質第二紫外吸收峰在240nm以下，215nm最大，此峰是肽鍵引起?？赏ㄟ^215nm與225nm的差值計算出蛋白質的含量。2024/9/2713考馬斯亮藍G-250染色法原理：考馬斯亮藍在一定濃度的乙醇和酸性溶液中呈現(xiàn)紅色，與蛋白質結合后變?yōu)樗{色，最大吸收峰從465nm移到596nm。優(yōu)點：（1）操作簡便；（2）敏感度較高（3）顏色穩(wěn)定（4）對干擾劑不敏感。缺點：（1）染料與蛋白質的實際狀況復雜，色素與樣品中的蛋白質不一定以當量相結合；（2）要求樣品完全溶解；（3）樣品不能回收使用。2024/9/2714蛋白質相對分子量的測定SDS－PAGE法測蛋白質的相對分子量：帶電顆粒在電場中的遷移主要受三個因素的作用，即場強、顆粒本身的電荷及分子形狀。因此一般電泳無法直接測定蛋白質的分子量。加入變性劑SDS后，蛋白質變性肽鏈伸展且蛋白質所帶電荷被SDS的負電荷覆蓋，在相同的電場下，蛋白質的遷移率只與蛋白質的分子量相關。2024/9/2715lgMr=lgK-bm=K1-bm2024/9/2716SDS法測定分子量的操作：1、標準蛋白質樣品的制備：按商品說明書使用。2、待測樣品的制備：取待測蛋白質樣品0.5mg，加入0.01mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)1ml溶解。與標準蛋白質一起加入等體積的樣品緩沖液，混勻，沸水浴加熱3分鐘后上樣。3、電泳分離及染色：2024/9/27174、計算相對遷移率：Rf=蛋白樣品移動距離(cm)指示染料移動距離(cm)2024/9/27182024/9/27192024/9/2720凝膠過濾測蛋白質分子量：測定大分子的分子量是凝膠過濾的應用之一。將已知分子質量的標準物質，在同一凝膠柱上以相同條件進行過濾層析，由于加入凝膠柱的物質分子質量不同，洗脫體積也不同?？筛鶕?jù)洗脫體積求出柱的分配常數(shù)Kav，而Kav與蛋白質分子質量之間又存在線性關系，利用這一關系可繪制出Kav與分子質量的標準曲線。2024/9/27212024/9/2722Ve＝K1－K2logMr2024/9/27232024/9/27242024/9/2725方法的局限性：1、在pH6～8的范圍內，直線關系比較好，在極端pH時因蛋白質變性而引起偏離；2、分子量與分配系數(shù)Kav有關，當?shù)鞍踪|的軸比較大時，會引起測定偏離；3、糖蛋白的含糖量大于5％時，測得的分子量比真實分子量大。2024/9/27262024/9/2727沉降速度法S＝＝＝沉降速度離心力dx/dtω2x1dtω2dxxm=SRTD(1-υρ)2024/9/2728沉降平衡法m=2RTln(C1/C2)(1-υρ)ω2(X22-X12)2024/9/2729等電聚焦測定蛋白質的等電點等電點分析：電泳結束后三氯乙酸固定并除去凝膠中的載體兩性電解質，考馬斯亮藍R－250染色，漂洗顯帶后測定蛋白質等電點。1、利用已知等電點標準蛋白質的等電點為縱坐標，距正極的距離為橫坐標作圖得標準曲線，在此標準曲線上根據(jù)待測樣品的位置求出其等電點；2024/9/27302、利用微電極直接測定凝膠表面的pH而得知樣品的等電點；3、將凝膠切成等距離(5nm)的小塊，浸于水中，用精密試紙測定pH。以凝膠塊距正極的距離為橫坐標，pH為縱坐標作用圖得出膠的pH梯度曲線。根據(jù)待測樣品在凝膠中的位置而得出蛋白質樣品的等電點。2024/9/2731其它蛋白質定性定量分析技術蛋白質的電泳染色定量分析特定蛋白質在總蛋白中所點比例的分析：最早應用于血漿蛋白電泳分離后白蛋白和球蛋白的比例測定。其方法有二，其一是將染色后的蛋白區(qū)帶剪下，用適當?shù)娜軇┨崛『蟊壬珳y定；其二用反射掃描儀處理后，計算各峰面積比而得出各成分的相對含量。與已知含量的標準蛋白一起電泳染色掃描后與標準蛋白比較，得出樣品蛋白的含量。2024/9/273220