2025屆新教材高考生物一輪復(fù)習(xí)知識能力提升12限制酶種類的確定及目的基因的檢測與鑒定含解析

PAGE10-限制酶種類的確定及目的基因的檢測與鑒定一、確定所用限制酶種類的方法1．依據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類(1)應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，以便將目的基因“切出”，如圖甲可選擇PstⅠ。(2)不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，以防破壞目的基因，如圖甲不能選擇SmaⅠ。(3)為避開目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可運(yùn)用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn)，如上圖)，而且這種切點(diǎn)不至于破壞全部的“標(biāo)記基因”以及啟動子和終止子。2．依據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類(1)所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一樣，以確保具有相同的黏性末端。(2)質(zhì)粒作為載體必需具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，應(yīng)至少含有一個完好的標(biāo)記基因，如圖中限制酶pstⅠ因其會破壞標(biāo)記基因而不宜選擇。(3)所選限制酶切點(diǎn)不應(yīng)位于復(fù)制原點(diǎn)處以防破壞復(fù)制原點(diǎn)，假如所選酶的切點(diǎn)不止一個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制原點(diǎn)區(qū)，則切割重組后的片段進(jìn)入受體細(xì)胞后不能自主復(fù)制。(4)所選限制酶，其切點(diǎn)應(yīng)位于啟動子與終止子之間，如圖中HindⅢ會破壞啟動子，EcoRⅠ會破壞終止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可讓目的基因嵌入啟動子與終止子之間。3．依據(jù)Ti質(zhì)粒的T-DNA片段選擇限制酶若質(zhì)粒上標(biāo)出T-DNA片段，則所選限制酶切點(diǎn)應(yīng)位于T-DNA片段中，從而有利于將目的基因嵌入到T-DNA片段上——因?yàn)門i質(zhì)粒的T-DNA片段最易轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，如用兩種限制酶XbaⅠ和SacⅠ(兩種酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，獲得含目的基因的片段。若利用該片段構(gòu)建基因表達(dá)載體，則下圖中甲、乙、丁，Ti質(zhì)粒均不宜選擇，而丙Ti質(zhì)粒宜選取?！镜淅?】圖(a)中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列與切割位點(diǎn)，圖(b)為某種表達(dá)載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點(diǎn)是唯一的)。依據(jù)基因工程的有關(guān)學(xué)問，回答下列問題：(1)經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被________酶切后的產(chǎn)物連接，理由是________________________________________________________________________________。(2)若某人利用圖(b)所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖(c)所示。這三種重組子中，不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有________，不能表達(dá)的緣由是_______________________________________________________________。(3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有________________和______________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是____________。解析：(1)分析圖(a)可知，限制酶Sau3AⅠ與BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，故經(jīng)這兩種酶切割得到的產(chǎn)物可以用DNA連接酶進(jìn)行連接。(2)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，為保證目的基因能在宿主細(xì)胞中勝利表達(dá)，目的基因應(yīng)插入在啟動子和終止子之間，據(jù)此可推斷甲、丙均不符合要求，目的基因均不能表達(dá)。(3)常見的DNA連接酶有E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。答案：(1)Sau3AⅠ兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端(2)甲、丙甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄(3)E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶目的基因插入表達(dá)載體的不同狀況的分析(2024·新余模擬)分析有關(guān)基因工程的資料，回答問題。如圖為構(gòu)建某重組質(zhì)粒的過程示意圖。lacZ基因可使細(xì)菌利用加入培育基的物質(zhì)X-gal，從而使菌落顯現(xiàn)出藍(lán)色，若無該基因，菌落則成白色。圖中甲～戊DNA片段只注明白黏性末端處的堿基種類，其他堿基的種類未作注明。(1)若酶M特異性識別的DNA堿基序列是，則酶N特異性識別的DNA堿基序列是____________。(2)過程②是將全部片段混合在一起，用________酶拼接可得到不同的重組DNA。(3)(多選)假如只考慮2個片段的組合，那么甲、乙、丁三個片段中能夠形成環(huán)狀DNA的片段組合是________。A．甲和乙 B．甲和甲C．甲和丁 D．乙和乙E．乙和丁 F．丁和丁(4)為了篩選含重組質(zhì)粒的受體菌，應(yīng)在通用培育基中額外加入______________，培育一段時(shí)間，選擇出________色的菌落進(jìn)一步培育。原來質(zhì)粒中，限制酶M和N的酶切位點(diǎn)________。A．M位于青霉素抗性基因中，N位于lacZ基因中B．N位于青霉素抗性基因中，M位于lacZ基因中C．M和N都位于青霉素抗性基因中D．M和N都位于lacZ基因中(5)上述目的基因能夠在受體細(xì)菌中表達(dá)，其緣由是不同生物________。A．共用一套DNA B．共用一套RNAC．共用一套蛋白質(zhì) D．共用一套密碼子解析：①質(zhì)粒經(jīng)過酶M和酶N的切割形成甲、乙片段，依據(jù)甲、乙片段的黏性末端可知，兩種限制酶的識別序列分別是、，酶M特異性識別的DNA堿基序列是，則酶N特異性識別的DNA堿基序列是。(2)DNA連接酶可以將具有相同黏性末端的DNA片段連接起來。(3)甲、乙、丁都有兩個黏性末端，且都相同，因此假如只考慮2個片段的組合，那么甲、乙、丁三種片段中隨意兩個連接都能夠連接形成環(huán)狀DNA。(4)為了篩選含重組質(zhì)粒的受體菌，應(yīng)在通用培育基中額外加入青霉素和X-gal，培育一段時(shí)間，選擇出白色的菌落進(jìn)一步培育。這表明青霉素抗性基因沒有被破壞，lacZ基因已經(jīng)被破壞，因此，在原來質(zhì)粒中，限制酶M和N的酶切位點(diǎn)都位于lacZ基因中。(5)上述目的基因能夠在受體細(xì)菌中表達(dá)，其緣由是不同生物共用一套密碼子。答案：(1)(2)DNA連接(3)ABCDEF(4)青霉素和X-gal白D(5)D二、目的基因的檢測與鑒定(1)在目的基因檢測中，標(biāo)記基因與DNA分子雜交技術(shù)所起的作用。①載體上相關(guān)標(biāo)記基因的作用原理。載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒有反抗相關(guān)抗生素的實(shí)力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠反抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培育體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞，倘如在選擇培育基中不能存活，則表明無質(zhì)粒轉(zhuǎn)入，當(dāng)然不會有“目的基因”轉(zhuǎn)入，能存活時(shí)必含該載體，其作用原理如下圖所示：②用DNA分子雜交技術(shù)檢測受體細(xì)胞的質(zhì)粒上是否含目的基因。經(jīng)上述步驟篩選得到的受體細(xì)胞，只是含特定的標(biāo)記基因的質(zhì)粒，然而該質(zhì)粒上是否勝利嵌入了目的基因還不能確定，故仍需運(yùn)用“目的基因”作探針，利用DNA分子雜交技術(shù)，檢測受體細(xì)胞的質(zhì)粒上是否含目的基因。(2)運(yùn)用目的基因作探針，運(yùn)用分子雜交技術(shù)檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出特定mRNA。(3)采納抗原—抗體雜交技術(shù)，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)(作抗原)與相應(yīng)抗體雜交，依據(jù)是否出現(xiàn)雜交帶確認(rèn)目的基因是否表達(dá)出了特定的蛋白質(zhì)。(4)采納抗蟲、抗病毒等個體接種試驗(yàn)進(jìn)行目的基因勝利表達(dá)的個體生物學(xué)水平的檢測?！镜淅?】(2024·江蘇卷)圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。請回答下列問題：(1)EcoRV酶切位點(diǎn)為eq\b\lc\(\a\vs4\al\co1(…GAT↓ATC…,…CTA↑TAG…))，EcoRV酶切出來的線性載體P1為________末端。(2)用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個堿基為____________的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重組質(zhì)粒P3。(3)為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落，采納含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長狀況如下表(“＋”代表生長，“－”代表不生長)。依據(jù)表中結(jié)果推斷，應(yīng)選擇的菌落是________(填表中字母)類，另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入狀況分別是__________________、________________。菌落類型平板類型ABC無抗生素＋＋－氨芐青霉素＋＋－四環(huán)素＋－－氨芐青霉素＋四環(huán)素＋－－(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對引物是________。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，緣由是________________________。解析：(1)依據(jù)題意分析，EcoRV酶識別的序列是－GATATC－，并且兩條鏈都在中間的T與A之間進(jìn)行切割，因此其切出來的線性載體P1為平末端。(2)依題意并據(jù)圖分析，目的基因兩側(cè)為黏性末端，且露出的堿基為A，則在載體P1的兩端須要各加一個含有堿基T的脫氧核苷酸，以便形成具有黏性末端的載體P2，再用DNA連接酶將P2與目的基因連接起來形成重組質(zhì)粒P3。(3)依據(jù)以上分析可知，限制酶(EcoRV酶)切割后破壞了四環(huán)素抗性基因，但是沒有破壞氨芐青霉素抗性基因，因此含有重組質(zhì)粒P3的菌落在含有四環(huán)素的培育基中應(yīng)當(dāng)不能生長，而在含有氨芐青霉素的培育基中能生長，結(jié)合表格分析可知，應(yīng)當(dāng)選擇B類菌落。依據(jù)表格分析，A類菌落在氨芐青霉素和四環(huán)素的培育基中都能夠生長，說明其導(dǎo)入的是P0；C類菌落在任何抗生素的培育基中都不能生長，說明其沒有導(dǎo)入任何質(zhì)粒。(4)據(jù)圖分析，依據(jù)目的基因插入的位置和PCR技術(shù)的原理分析，PCR鑒定時(shí)應(yīng)當(dāng)選擇的一對引物是乙和丙；依據(jù)題意和圖形分析，某同學(xué)用圖中的另外一對引物(甲、乙)從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp的片段，說明其目的基因發(fā)生了反向連接。答案：(1)平(2)胸腺嘧啶(T)DNA連接(3)BA類菌落含有P0C類菌落未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒(4)乙丙目的基因反向連接(1)基因工程的核心是構(gòu)建基因表達(dá)載體。重組基因表達(dá)載體中的標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含目的基因的細(xì)胞篩選出來。(2)重組質(zhì)粒形成與否須要鑒定和篩選，方法是將重組質(zhì)粒的DNA分子導(dǎo)入相應(yīng)的受體細(xì)胞中，通過在含有對應(yīng)抗性物質(zhì)的培育基進(jìn)行培育，視察相應(yīng)受體細(xì)胞的生長、繁殖狀況進(jìn)行推斷。1．(2024·都勻質(zhì)檢)下圖是利用工程菌(大腸桿菌)生產(chǎn)人生長激素的試驗(yàn)流程。所用的pBR322質(zhì)粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ的切點(diǎn)各一個，且三種酶切割形成的末端各不相同，而Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因。請回答以下相關(guān)問題：(1)過程①所用到的組織細(xì)胞是________________，過程④所用的酶是________。⑤過程常用________溶液處理大腸桿菌。(2)經(jīng)②過程得到的互補(bǔ)DNA片段，稱為________。(3)假如用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ對圖中質(zhì)粒進(jìn)行切割，用一種酶、兩種酶和三種酶分別切割時(shí)形成的DNA片段種類與用一種酶和兩種酶分別切割時(shí)形成的DNA片段種類________(填“相同”或“不同”)，這些種類的DNA片段中含有完整氨芐青霉素抗性基因的DNA片段和四環(huán)素抗性基因的DNA片段分別有________種和________種。(4)假如只用限制酶PstⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，完成過程④、⑤后(受體大腸桿菌不含Ampr、Tetr)，將三角瓶內(nèi)的大腸桿菌先接種到甲培育基上，形成菌落后用無菌牙簽挑取培育基甲上的單個菌落，分別接種到乙和丙兩個培育基的相同位置上，一段時(shí)間后，菌落的生長狀況如圖乙、丙所示。接種到甲培育基上的目的是篩選____________的大腸桿菌；接種到培育基乙上的大腸桿菌菌落，能存活的大腸桿菌體內(nèi)導(dǎo)入的是________________________。含有目的基因的大腸桿菌在培育基乙和丙上的生存狀況是_______________________________________________________________________。(5)將大腸桿菌培育在含氨芐青霉素、四環(huán)素培育基上的過程，屬于基因工程基本操作中的____________________________________________________________________________步驟。該基因工程中的pBR322質(zhì)粒徹底水解的產(chǎn)物是__________________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)過程①獲得的是人生長激素mRNA，所以組織細(xì)胞取自人垂體組織細(xì)胞；過程④構(gòu)建基因表達(dá)載體的酶是DNA連接酶；過程⑤將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌前，常用CaCl2溶液處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細(xì)胞。(2)②過程是人的生長素mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過程。(3)PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三種酶的切點(diǎn)分別用1、2、3表示，一種酶酶切時(shí)，一共可以得到3種相同長度的片段；兩種酶酶切時(shí)，可得到1－2，2－1，2－3，3－2，1－3，3－1六種片段；三種酶酶切時(shí)，可得到1－2，2－3，3－1三種片段，與前面重復(fù)，因此用一種酶、兩種酶和三種酶分別切割時(shí)形成的DNA片段種類與用一種酶和兩種酶分別切割時(shí)形成的DNA片段種類相同。這些種類的DNA片段中含有完整氨芐青霉素抗性基因的DNA片段和四環(huán)素抗性基因的DNA片段分別有3種和3種。(4)在甲中能生長的是具有四環(huán)素抗性的細(xì)菌，含有四環(huán)素抗性基因；在乙培育基中能生長的是具有四環(huán)素和氨芐青霉素抗性的細(xì)菌，所以導(dǎo)入的是完整的pBR322質(zhì)?；蚝蠥mpr、Tetr的質(zhì)粒。與丙相比，乙培育基中少了兩個菌落，說明丙培育基中這兩個菌落中的大腸桿菌勝利導(dǎo)入了重組質(zhì)粒，而且目的基因插入質(zhì)粒后，破壞了氨芐青霉素抗性基因，使含有目的基因的大腸桿菌不能在含有氨芐青霉素的乙培育基上生長，但四環(huán)素抗性基因是完好的，則含有目的基因的大腸桿菌能在含有四環(huán)素的丙培育基上生長。(5)將大腸桿菌培育在含氨芐青霉素、四環(huán)素培育基上的過程，屬于基因工程中的篩選含目的基因的受體細(xì)胞步驟。該基因工程中的pBR322質(zhì)粒的化學(xué)本質(zhì)是DNA，其徹底水解的產(chǎn)物是磷酸、脫氧核糖和四種含氮堿基。答案：(1)人垂體組織細(xì)胞DNA連接酶CaCl2(2)cDNA(3)相同33(4)含四環(huán)素抗性基因完整的pBR322質(zhì)粒(或含有Ampr、Tetr的質(zhì)粒)在丙中能存活，在乙中不能存活(5)篩選含目的基因的受體細(xì)胞磷酸、脫氧核糖、四種含氮堿基2．(2024·安順模擬)雙乙酰是啤酒中的主要風(fēng)味物質(zhì)，當(dāng)啤酒中雙乙酰的濃度超過肯定值時(shí)，就會產(chǎn)生餿酸味。為此，科學(xué)家構(gòu)建了低雙乙酰啤酒酵母工程菌。請回答下列問題：(1)下圖為重組質(zhì)粒(PICG)的構(gòu)建示意圖。①將目的基因CUPⅠ從DNA分子切割下來所需的酶主要是從________中分別純化而來。②為獲得大量的目的基因GSHⅠ，可運(yùn)用________技術(shù)，利用該技術(shù)的前提是______________________以便合成引物，該技術(shù)須要的酶是_____________________________________________。③由上圖可知，用___