2第二章-微生物生態(tài)學研究方法

第二章、微生物生態(tài)學研究的基本方法一、微生物生態(tài)學研究的傳統(tǒng)方法直接測定（代表性）：光學/電子顯微鏡，計數(shù)器培養(yǎng)方法：平板菌落計數(shù)法、最大或然值法土壤、污泥：深度范圍水體：直接采集、過濾濃縮空氣：無菌下濾紙過濾生物體：無菌溶液洗滌保存、分析

最大或然值法（mostpossiblenumber,MPN法，稀釋法）：將樣品用無菌生理鹽水進行系列稀釋，取一定稀釋度的稀釋液接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間，觀察各種稀釋度的生長情況。據(jù)生長管數(shù)統(tǒng)計微生物數(shù)量。用于好氧/厭氧異樣菌總量，硝化反硝化菌總量、硫酸鹽還原菌總量等的測定。代謝活力的測定（同位素標記、酶活力、ATP、葉綠素、呼吸作用和光合作用）數(shù)學方法（人工模擬實驗）

1、DNA指紋圖譜技術：分子標記（SSR、ISSR、RAPD、AFLP、PCR/T-RFLP）、DGGE(變性梯度凝膠電泳)、TGGE(溫度梯度凝膠電泳)、單鏈構象多態(tài)性分析（PCR-SSCP）、重復片段PCR基因指紋分析（rep-PCR）。2、rRNA基因序列的測定3、核酸探針和雜交技術研究微生物的多樣性4、其他方法：實時熒光定量PCR法，DNA微陣列（芯片）技術、PFLA圖譜分析、Biolog微平板鑒定系統(tǒng)、熒光原位雜交技術二、微生物生態(tài)學的分子生物學研究方法標記類型SSRAFLPISSRRAPDRFLPSNP可檢測基因座位數(shù)1-220-1001-101-101-32DNA質(zhì)量中高高低低高高遺傳特點共顯性共顯性/顯性共顯性/顯性多數(shù)共顯性共顯性遺傳共顯性多態(tài)性高較高較高較高中等高技術難度低中等低低高高同位素使用不用常用不用不用常用不用可靠性高高高低/中等高高實驗成本中等較高較低較低高高常用分子標記技術特征比較Thecomparetionofmolecularmarkers微生物群落結構和多樣性是微生物生態(tài)學研究的熱點內(nèi)容。群落結構決定了生態(tài)功能的特性和強弱。群落結構的高穩(wěn)定性是實現(xiàn)生態(tài)功能的重要因素。群落結構變化是標記環(huán)境變化的重要方面。通過對環(huán)境微生物群落結構和多樣性進行解析并研究其動態(tài)變化，可以為調(diào)節(jié)群落功能和發(fā)現(xiàn)新的重要微生物功能類群提供可靠的依據(jù)。20世紀70年代以前：傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法，依靠形態(tài)學、培養(yǎng)特征、生理生化特性的比較進行分類鑒定和計數(shù)，認識是不全面和有選擇性的，方法的分辨水平低。微生物群落結構和多樣性研究方法：在70和80年代：對微生物化學成分的分析，建立了一些微生物分類和定量的方法（生物標記物方法），對環(huán)境微生物群落結構及多樣性的認識進入到較客觀的層次上。在80和90年代：現(xiàn)代分子生物學技術以DNA為目標物，通過rRNA基因測序技術和基因指紋圖譜等方法，比較精確地揭示了微生物種類和遺傳的多樣性，并給出了關于群落結構的直觀信息。雖然可以檢測環(huán)境中的活細胞，并且對微生物生態(tài)學的發(fā)展起了很重要的作用。采用配比簡單的營養(yǎng)基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環(huán)境與原生境的偏差使得可培養(yǎng)的種類大大減少（不到1%

）。Amann

等人報道在自然環(huán)境樣品中可培養(yǎng)的微生物占總的微生物數(shù)量的比例范圍從0.001%（海水）到0.3%（土壤）。

不能全面地反映微生物區(qū)系組成狀況，煩瑣、耗時。1、傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法2、群落水平生理學指紋方法(CLPP)微生物所含的酶與其豐度或活性是密切相關的。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基質(zhì)，則這種酶-底物可作為此群落的生物標記分子之一。由Garlan和Mills于1991年提出的群落水平生理學指紋方法(CLPP)，通過檢測微生物樣品對底物利用模式來反映種群組成的酶活性的分析方法。具體而言，CLPP就是通過檢測微生物樣品對多種不同的單一碳源的利用能力，來確定哪些基質(zhì)可以作為能源，從而產(chǎn)生對基質(zhì)利用的生理代謝指紋。BIOLOG鑒定系統(tǒng)自動化、快速可鑒定細菌有1140多種、酵母菌267種、目前已經(jīng)可用于絲狀真菌。每個孔中含有不同的底物菌懸液或無菌水僅能鑒定快速生長的微生物，誤差較大（pH），擁有的標準數(shù)據(jù)庫還不完善在96孔細菌培養(yǎng)板上檢測微生物對不同發(fā)酵性碳源（95種）利用情況。干膜上都含有培養(yǎng)基和氧化還原染料四唑微生物利用碳源進行呼吸時（產(chǎn)生的NADH），會將四唑從無色還原成紫色。3、生物標記物法（Biomakers

）生物標記物通常是微生物細胞的生化組成成分，其總量通常與相應生物量呈正相關。特定的標記物標志著特定的微生物，一些生物標記物的組成模式(種類、數(shù)量和相對比例)可作為指紋估價微生物群落結構。首先使用一種合適的提取劑直接把生物標記物從環(huán)境中提取出來，然后對提取物進行純化，后用合適的儀器加以定量測定。優(yōu)點：不需要把微生物的細胞從環(huán)境樣中分離，能克服由于培養(yǎng)而導致的微生物種群變化，具有一定的客觀性。醌指紋法(QuinonesProfiling)呼吸醌廣泛存在于微生物細胞膜中，在電子傳遞鏈中起重要作用，主要有泛醌(ubiquinone輔酶Q)和甲基萘醌(menaquinone維生素K)。醌可以依據(jù)側鏈含異戊二烯單元的數(shù)目和側鏈上使雙鍵飽和的氫原子數(shù)進一步區(qū)分。每一種微生物都含有一種占優(yōu)勢的醌，而且不同的微生物含有不同種類和分子結構的醌。因此，醌的多樣性可定量表征微生物的多樣性，醌譜圖（即醌指紋）的變化可表征群落結構的變化。醌指紋法具有簡單快速的特點。磷脂是構成生物細胞膜的主要成分，約占細胞干重的5%。在細胞死亡時，細胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代謝掉，因此它只在活細胞中存在，十分適合于微生物群落的動態(tài)監(jiān)測。磷脂脂肪酸（phospholipidfattyacid,PLFA）、甲基脂肪酸酯（Fattyacidmethylester,FAME）譜圖分析脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經(jīng)被作為微生物分類的依據(jù)。甲基脂肪酸酯是細胞膜磷脂水解產(chǎn)物，氣相色譜分析系統(tǒng)分析出全細胞的FAME譜圖。脂肪酸譜圖法分類水平較低，不能鑒定到種。另外，不同微生物種屬之間脂肪酸組成有重疊，外來生物污染也限制了脂肪酸譜圖法對種群結構解析的可靠性。磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂脂肪酸部分提取出來，然后用氣相色譜分析，得出PLFA譜圖。4.ERIC(腸桿菌基因間保守重復序列)-PCR指紋圖譜技術DiGiovanni等用ERIC-PCR分析6種純菌組成的混合菌的組成，獲得了高重復性的指紋圖譜，比常規(guī)RAPD-PCR相比更能反映菌群的組成特征。在微生物群落中，各細菌數(shù)量占1-10%時，其特征性ERIC-PCR主條帶就可以在指紋圖中表現(xiàn)出來。ERIC-PCR指紋圖中，每一條帶可以是來自若干種不同微生物的基因組DNA片段，條帶的數(shù)目反映微生物類群的多少，條帶的亮度反映該類群微生物種群數(shù)量的高低。分析不同環(huán)境樣品中微生物混合DNA的ERIC-PCR指紋圖譜的差異，就可比較不同生態(tài)系統(tǒng)微生物群落的差異，或者同一個群落在不同功能狀態(tài)下的結構變化。E1:5'-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3'E2:5'-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3'ERIC-PCR引物20pmol/μl

5.以PCR為基礎的rRNA及rDNA的分析方法用于微生物群落結構分析的基因組DNA的序列包括：核糖體操縱子基因序列(rDNA)、已知功能基因的序列、重復序列和隨機基因組序列等。最常用的標記序列是核糖體操縱子基因(rDNA)。rRNA(rDNA)在細胞中相對穩(wěn)定，同時含有保守序列及高可變序列，是微生物系統(tǒng)分類的一個重要指標。Diversityestimationbasedonmolecularmarkers實驗原理16SrDNA是基因組的“biomarker”–核糖體RNA是蛋白質(zhì)合成必需的，16SrDNA廣泛存在于所有原核生物的基因組中。

–16SrDNA的序列中包括保守區(qū)和可變區(qū)。

–序列變化比較緩慢，與物種的形成速度相適應，而且一般不發(fā)生水平轉移。

–GeneBank和RDPⅡ（RibosomalDatabaseProject

）數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)登錄了超過97,128個經(jīng)過比對和注釋的16SrDNA序列，可供進行比對。16SribosomalRNAPresentinalllifemolecularchronometertaxonomy(largedatabase)evolutiononeactivebacterialcell:~104copies~15

rRNAgenes(i.e.,rDNA)(Mycobacteriumtuberculosis,Mycoplasma

pneumoniae,

Sulfolobus

solfataricuswith1copy,Clostridiumparadoxum

with15copies)~1500nt(enoughinformation)fourdifferentdomainsconservedregions(novariationamongalllife)variableregions(V1-V9)Source:Louis,B.,GeneIV,1997環(huán)境16SrDNA文庫的構建與組成分析技術1990年，Giovannoni等首先用這一方法分析馬尾藻海海面上浮游微生物的多樣性。16SrDNA文庫中的藍藻種類與培養(yǎng)出來的藍藻很不一致；發(fā)現(xiàn)了一個新的且在該環(huán)境中占優(yōu)勢的微生物類群；與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的方法相比，更全面得揭示了微生物多樣性；這一方法目前已經(jīng)廣泛運用于土壤、海洋、湖泊、腸道等多種生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性的調(diào)查，揭示了環(huán)境當中前所未知的微生物的多樣性。構建環(huán)境16SrDNA文庫的方法用環(huán)境基因組總DNA進行16SrDNAPCR擴增：把環(huán)境中幾乎所有微生物基因組上的16SrDNA擴增并收集到一起。universalprimers:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(Esherichiacolibases8to27)和5’-TACCTTGTTACGACTT-3’(E.colibases1507to1492)“TA克隆”：把每一個16SrDNA分子放到文庫中的每一個克隆里。陽性克隆篩選的過程：1.Amp抗性，挑選出含有質(zhì)粒的克隆2.藍白斑篩選，挑出帶有插入片段的克隆3.PCR篩選，挑出帶有正確長度插入片段的克隆ARDRA分型與測序各OTU含有的克隆數(shù)量克隆文庫的統(tǒng)計分析TerminalRestrictionFragmentLengthPolymorphism(T-RFLP)16SrDNAFragment

Size(basepairs)ABCRelativeIntensityLiuetal.,1997,AEM變性梯度凝膠電泳（DGGE）變性梯度凝膠電泳（Denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE）最初是Lerman

等人于20世紀80年代初期發(fā)明的，起初主要用來檢測DNA片段中的點突變。Muyzer

等人在1993年首次將其應用于微生物群落結構研究。后來又發(fā)展出其衍生技術，溫度梯度凝膠電泳（Temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）。此后十年間，該技術被廣泛用于微生物分子生態(tài)學研究的各個領域，目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結構的主要分子生物學方法之一。原理雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長度的DNA片段能夠被區(qū)分開，但同樣長度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，不能被區(qū)分。DGGE/TGGE技術在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區(qū)分開來。一個特定的DNA片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(meltingdomain,MD)和解鏈行為(meltingbehavior)。一個幾百個堿基對的DNA片段一般有幾個解鏈區(qū)域，每個解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對組成。當變性劑濃度逐漸增加各區(qū)域依次發(fā)生解鏈。顯示的是一個234bp長的DNA片段的解鏈區(qū)域，橫坐標是該DNA片段的序列，依次從第一個堿基到第234個堿基；縱坐標是解鏈溫度。該DNA片段共有3個解鏈區(qū)域。MD1是解鏈溫度最低的一個解鏈區(qū)域，MD3是溫度最高的一個解鏈區(qū)域。不同的雙鏈DNA片段因為其序列組成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈溫度也是不一樣的。當它們進行DGGE時，一開始變性劑濃度比較小，不能使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時DNA片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。一旦DNA片段遷移到一定位置，其變性劑濃度使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，部分解鏈的DNA片段在膠中的遷移速率會急劇降低。因此，不同的DNA片段會在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開來。然而，當變性劑濃度達到DNA片段最高的解鏈區(qū)域溫度時，DNA片段會完全解鏈，此時它們又能在膠中繼續(xù)遷移，這些片段就不能被區(qū)分開來。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夾子，一般30-50個堿基對）可以解決這個問題。含有GC夾子的DNA片段解鏈溫度很高，可以防止DNA片段在DGGE膠中完全解鏈。當加了GC夾子后，DNA片段中每個堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。當用DGGE/TGGE技術來研究微生物群落結構時，要結合PCR（polymerasechainreaction）擴增技術，用PCR擴增的16SrDNA

產(chǎn)物來反映微生物群落結構組成。通常根據(jù)16SrRNA

基因中比較保守的堿基序列設計通用引物，其中一個引物的5’-端含有一段GC夾子，用來擴增微生物群落基因組總DNA，擴增產(chǎn)物用于DGGE/TGGE分析。由于DGGE/TGGE一般只能分析500bp

以下的DNA片斷，所以一般選擇擴增16SrRNA基因的V3區(qū)或V6-V8區(qū)。40%60%DenaturantCABCBADenaturingGradientGelElectrophoresisPCR11f1512r1392r968fgc16SrDNA熒光原位雜交（FluorescenceInSituHybridization）利用熒光標記的寡聚核苷酸探針標記16SrRNA或23SrRNA，然后進行原位雜交探測，可以在原位狀態(tài)下探測特定生物細胞，并可提供部分關于形態(tài)、空間分布等方面的信息。通過FISH技術可以解決在固定群落中微生物的分布問題。原始的生物膜和絮狀污泥用多聚甲醛固定在凝膠包被的玻璃上，固定并已穿孔的細胞與熒光標記的寡核苷酸探針雜交，DNA探針就會與細胞中互補的DNA或RNA雜交；然后在熒光顯微鏡下就可以觀察到發(fā)光的細胞，偶聯(lián)的FISH在激光共聚焦顯微鏡下可以實現(xiàn)標記細胞在微生物菌落三維結構中的定位。常用熒光原位雜交探針一覽表探針名稱系統(tǒng)類群序列SequenceTm（°C）Hyb/WashTemp（°C）[salt]（MNaCl）UNIVuniversalacgggcggtgtgtrcgwattaccgcggckgctg626437(0.5)ARCHArchaeagtgctcccccgccaattcct7343(0.5)BACTBacteria(EUB338)gctgcctcccgtaggagt6437(0.5)EUKEucaryagggcatcacagacctgtagaaagggcaggga585437(0.5)HiGCHighG+CGram+ccygatatctgcgca4537(0.5)LoGCLowG+CGram+tgtagcccargtcata5537(0.5)CFBFlavobacteriatcagtrccagtgtggggg5837(0.5)AlphaAlpha-proteoscgragttagccggggc5737(0.5)BetaBeta-proteostcactgctacacgyg5637(0.5)GammaGamma-proteoscttttgcarcccact4137(0.5)DeltaDelta-proteosgcttkcawgmagagg4737(0.5)SRB2Sulfate-reducerscgygcgccrctytact5737(0.5)PseudoPseudomonassp.ccttcctcccaactt5237(0.5)GSulfGreenSulfurcttttargggatttcctctg5437(0.5)EuryEuryarchaeotacttgcccrgcccttgacctaccgtngyccr585242(0.5)CrenCrenarchaeotaccagrcttgccccccgct7242(0.5)FISH常用熒光素熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)顏色AMCA351450藍FITC異硫氰酸鹽熒光素492528綠FluoXTM52(262)羰基-N-羥基丁二酰亞胺熒光素488520綠(TRITC)四甲基羅丹明異硫氰酸鹽熒光素557576紅TexasRed德克薩斯紅578600紅Cy3TM550570橙/紅Cy5TM651674紅外10m

Desulfotomaculum

(DFMI227a

)

48.063.04%

Methanosaeta

(MX825)

49.172.63%20mBacteria

(EUB338I/II/III)

48.063.04%

Archaea

(ARC915)

49.172.63%Fluorescenceinsituhybridization(FISH)MicrobialcommunitydeterminedbyFluorescentIn-SituHybridization(FISH)

universal

gammaprobe

universal

specificprobe1

specificprobe2基于16SrRNA基因的分類微陣列－－

高通量的分析微生物群落結構，成為檢測復雜環(huán)境微生物群落結構的重要工具。lab-on-a-chip：這種lab-on-a-chip被設計成可以分離各種微生物細胞、裂解后純化DNA或mRNA，這個研究領域對于更深理解微生物的群落結構具有重要影響。分析復雜環(huán)境微生物群落結構的方法的最近進展：未培養(yǎng)微生物資源的開發(fā)：任何微生物培養(yǎng)技術和培養(yǎng)基都不能完全再現(xiàn)全部微生物的自然生存環(huán)境，使用免培養(yǎng)技術和基因組技術，直接分離土壤系統(tǒng)中群落水平的未培養(yǎng)微生物DNA樣品并建立相應的生態(tài)基因組庫，通過高通量篩選技術進行大規(guī)模的新的重要功能基因的研究，鑒定參與污染物降解與轉化、各種抗酸、抗鹽、抗?jié)?、抗旱及抗（耐）重金屬毒害等抗逆特殊功能基因。我國科學加已經(jīng)建立了深海樣品、云南騰沖熱泉，青海藏牦牛瘤胃、造紙廠廢水排污口和傳統(tǒng)堆肥未培養(yǎng)微生物的生態(tài)基因文庫，獲得了一批具有特殊性質(zhì)和應用前景的淀粉酶、蛋白酶和脂酶編碼基因。生物圈種類豐富多樣的微生物分離培養(yǎng)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)宏基因組篩選獲得產(chǎn)物通過構建宏基因組表達文庫，通過基于序列或酶活力篩選文庫獲得目的基因。缺陷：超高通量的篩選或者需具有選擇標記的分析方法。進展：底物誘導基因表達篩選substrate-inducedgeneexpressionscreen(SIGEX)。構建

GFP表達載體，通過

fluorescence-activatedcellsorting(FACS)來篩庫.宏基因組DNA克隆到gfp上游，首先排除組成表達的克隆，不發(fā)熒光的克隆在底物上生長，來篩選誘導表達gfp的克隆，這種篩選方法利用代謝基因被底物誘導表達的特性。Screeningmetagenomicexpressionlibraries針對未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)技術研究微生物不可培養(yǎng)的原因

培養(yǎng)條件

營養(yǎng)限制

失去生態(tài)位

模擬原位生態(tài)條件的培養(yǎng)技術主體為一個墊圈，兩側用0.22um的濾膜封住，允許環(huán)境中的化學物質(zhì)通過，但不允許細胞通過。在魚缸底部倒上一層海底沉積物，其上放置擴散室，加入天然海水至剛好漫過擴散室，使海水不斷循環(huán)。Isolating“Uncultivable”MicroorganismsinPureCultureinaSimulatedNaturalEnvironment,T.Kaeberlein,K.Lewis,*S.S.Epstein*?,SCIENCEVOL29610MAY2002Accessingtheuncultivatedmicrobialmajoritythroughcultivation-ba