第10章紫外-可見分光光度法2012

第十章紫外—可見分光光度法1主要學(xué)習(xí)1.紫外-可見分光光度法用于測定什么樣的物質(zhì)？2.該方法的吸光質(zhì)點是什么？3.什么類型的物質(zhì)能夠產(chǎn)生紫外-可見吸收？4.定性、定量的依據(jù)是什么？5.紫外-可見分光光度計的主要結(jié)構(gòu)如何？2前言定義：光譜區(qū)：200~800nm。對象：廣泛用于無機和有機物質(zhì)的定性和定量測定。3特點分子光譜靈敏度較高（一般10－4～10－6g/ml）準(zhǔn)確度好（一般0.5％）操作簡便、快速應(yīng)用廣泛4(一)分子吸收光譜的形成1.過程：分子的價層電子--------吸收外來輻射------產(chǎn)生電子能級躍遷-----分子吸收譜。第一節(jié)紫外—可見光譜法的原理和概念

一、電子躍遷類型5分子的總能量可以認(rèn)為是這三種能量的總和：

其中

Ee最大：1-20eV;

Ev次之：0.05-1eV;

Er最?。?/p>

0.05eV2、能級組成6有機分子能級躍遷可能的躍遷類型有機分子包括:成鍵軌道、；反鍵軌道

*、*非鍵軌道n

C

H

H

Ooooo

=

=

o=n(二)電子躍遷類型7各軌道能級高低順序：

n

*

*；可能的躍遷類型：

-

*；

-

*；n-*；n-*81.

-

*：C-H共價鍵，如CH4（125nm）；C-C鍵，如C2H6(135nm)，處于真空紫外區(qū)；

2.

n-*：含有孤對電子的分子，如H2O(167nm)；CH3OH(184nm)；CH3Cl(173nm);(CH3)2S(229nm)；CH3NH2(215nm)；可見，大多數(shù)波長仍小于200nm，處于近紫外區(qū)。以上躍遷都與成鍵和反鍵軌道有關(guān)，躍遷能量較高，這些躍遷所產(chǎn)生的吸收譜多位于真空紫外區(qū)，因而在此不加討論。而

-

*和n-*兩種躍遷的能量小，相應(yīng)波長出現(xiàn)在近紫外區(qū)甚至可見光區(qū)，且對光的吸收強烈，是我們研究的重點。9

-

*和n-*兩種躍遷3.

*躍遷吸收峰一般處于近紫外光區(qū)，在200nm左右。其特征是摩爾吸光系數(shù)大，一般

max

104，為強吸收帶。

如：乙烯（蒸氣）的

max為165nm。丁二烯的

max為217nm。1011

-

*和n-*兩種躍遷n

*躍遷

這類躍遷發(fā)生在近紫外光區(qū)。它是簡單的生色團如羰基、硝基等中的孤對電子向反鍵軌道躍遷。其特點是譜帶強度弱，摩爾吸光系數(shù)小，通常小于100。125.電荷遷移躍遷當(dāng)電磁輻射照射化合物時，電子從給予體向與接受體相聯(lián)系的軌道上躍遷。電荷遷移躍遷實質(zhì)是一個內(nèi)氧化—還原的過程。電荷遷移吸收帶的譜帶較寬，吸收強度較大，摩爾吸光系數(shù)

max可大于104。無機化合物的躍遷類型136.配位場躍遷（即d-d躍遷和f-f躍遷）在配體存在下，過渡元素的d或f軌道發(fā)生能級分裂，電子在能級分裂的軌道上躍遷。特點：摩爾吸光系數(shù)較小，一般εmax<102，位于可見光區(qū)。14二、紫外可見吸收光譜的常用概念1.吸收光譜*(absorptionspectrum)又稱吸收曲線：

A-λ曲線，如圖10-3所示：2.吸收峰*：(λmax)

曲線上吸光度最大的地方。對應(yīng)的波長稱最大吸收波長。15163.谷*：(λmin)

峰與峰之間吸光度最小的地方。對應(yīng)的波長稱最小吸收波長。4.肩峰*(shoulderpeak)：

在一個吸收峰旁邊產(chǎn)生的一個曲折。5.末端吸收*(endabsorption)：

只在圖譜短波端呈現(xiàn)強吸收而不成峰形的部分。300400500600350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2AbsorbanceCr2O72-、MnO4-的吸收光譜35017

6.生色團*

從廣義來說，所謂生色團，是指分子中可以吸收光子而產(chǎn)生電子躍遷的原子基團。但是，人們通常將能吸收紫外、可見光的原子團或結(jié)構(gòu)系統(tǒng)定義為生色團。

187.助色團*

助色團是指帶有非鍵電子對的基團，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它們本身不能吸收大于200nm的光，當(dāng)它們與生色團相連時，會使生色團的吸收峰向長波方向移動，并且增加其吸光度。198.紅移*

(redshift)：亦稱長移，是由于化合物的結(jié)構(gòu)改變使吸收峰向長波方向移動的現(xiàn)象。如發(fā)生共軛作用、引入助色團，以及溶劑改變等。209.藍移*（紫移）(blueshift)：亦稱短移，是化合物的結(jié)構(gòu)改變時或受溶劑影響使吸收峰向短波方向移動的現(xiàn)象。2110.增色效應(yīng)和減色效應(yīng)*：

由于化合物結(jié)構(gòu)改變或其他原因，使吸收強度增加稱增色效應(yīng)或濃色效應(yīng)；使吸收強度減弱稱減色效應(yīng)或淡色效應(yīng)。

2211.強帶和弱帶(strongbandandweakband)：

強帶：εmax值大于104的吸收峰，弱帶：εmax值小于102的吸收峰。

23三、吸收帶及其分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

躍遷類型相同的吸收峰稱為吸收帶(absorptionband)。

吸收帶是說明吸收峰在紫外-可見光譜中的位置。根據(jù)電子和軌道種類，可把吸收帶分為六種類型。241.R帶從德文radikal(基團)得名。n→π*躍遷2.K帶從德文konjugation(共軛作用)得名。共軛雙鍵中π→π*躍遷3.B帶從benzenoid(苯的)得名，256nm4.E吸收帶，苯環(huán)中三個共軛烯π→π*躍遷，180nm和200nm左右5.電荷轉(zhuǎn)移吸收帶6.配位體場吸收帶25四、影響吸收帶的因素

主要是分子中結(jié)構(gòu)因素和測定條件等多種因素的影響，它的核心是影響分子中電子共軛結(jié)構(gòu)。261.

位阻影響能共軛，吸收帶長移2.

跨環(huán)效應(yīng)形成類似共軛的作用，吸收帶長移3.溶劑效應(yīng)極性溶劑使π→π*躍遷吸收峰長移；而使n→π*躍遷吸收峰短移4.體系的pH的影響27下表為溶劑對亞異丙酮紫外吸收光譜的影響。

正己烷CHCl3CH3OHH2O

*

max230238237243n

*

max329315309305因此，在實際工作中，你的測定結(jié)果和文獻不完全一致，也是有可能的。28五、朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律Lambert-Beer定律的數(shù)學(xué)表達式：A=-lgT

=ECl

或T=10-A=10-ECl

其中E是吸光系數(shù)(absorptivity)，與單色光、溶劑和溫度等條件有關(guān)。

吸光系數(shù)是定性和定量的依據(jù)。29吸光系數(shù)有兩種表示方式：1.摩爾吸光系數(shù)*（ε或E）

指在一定波長時：A=ε?

1(mol/L)?1cm2.比吸光系數(shù)或稱百分吸光系數(shù)指在一定波長時：A=E1cm1%

?

1％(W／V)?1cm兩者之間的關(guān)系？30兩種吸光系數(shù)之間的關(guān)系：

ε=E1cm1%?M/10（M為摩爾質(zhì)量）通常ε在104～105之間為強吸收，ε＜102為弱吸收，102＜ε＜104中強吸收。吸光系數(shù)ε或E用已知準(zhǔn)確濃度的稀溶液測得。31例如：氯霉素(M為323.15)的水溶液在278nm處有吸收峰。設(shè)用純品配制100ml含有2.00mg的溶液，以1.00cm厚的吸收池在278nm處測得透光率為24.3%。則：E=-lgT/(C?l

)=307ε=E?M/10=992032

吸光度的加合性：A總＝Aa

+Ab

+Ac+??????

因為電磁波照射分子時，所有要吸收相同輻射的躍遷，都要引起吸光度。這是直接測定混合組分的依據(jù)。33六、偏離比爾定律的因素

（一）化學(xué)因素由于溶液濃度改變而產(chǎn)生的離解、締合、與溶劑間的作用等原因而發(fā)生偏離Beer定律的現(xiàn)象。

01234mg/mLA。。。。*0.80.60.40.20工作曲線34例如，重鉻酸鉀的水溶液有以下平衡：

Cr2O2-7+H2O2H++2CrO2-4

若溶液稀釋2倍，Cr2O2-7離子濃度不是減少2倍，而是減少明顯地多于2倍，結(jié)果偏離Beer定律，而產(chǎn)生誤差。35（二）光學(xué)因素1.非單色光（一定波長范圍的光）2.雜散光(straylight)

不在譜帶寬度范圍內(nèi)的與所需波長相隔較遠(yuǎn)的光。3.散射光和反射光（透射光強度減弱）4.非平行光（光程差）36(三)透光率測量誤差（T）

濃度相對誤差取決于透光率和透光率測量誤差ΔT的大小。以吸光度A和濃度相對誤差作圖，當(dāng)A值在0.2～0.7，是測量最適宜范圍。曲線最低點時：T=0.368A=0.4343

透光率測量誤差最小。37第二節(jié)紫外-可見分光光度計一、組成部件

紫外-可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)是由五個部分組成：光源、單色器、吸收池、檢測器和信號指示系統(tǒng)。383940414243儀器基本結(jié)構(gòu)光源單色器吸收池檢測器和信號顯示系統(tǒng)44作用：提供能量，激發(fā)被測物質(zhì)分子，使之產(chǎn)生電子譜帶要求：發(fā)射足夠強的連續(xù)光譜，有良好的穩(wěn)定性及足夠的使用壽命類型：可見與近紅外區(qū)：鎢燈400~1100nm

紫外區(qū)：氫燈或氘燈180~400nm一、光源45作用：從連續(xù)光源中分離出所需要的足夠窄波段的光束常用的元件：棱鏡、光柵二、單色器46功能：用于盛放試樣，完成樣品中待測試樣對光的吸收常用的吸收池：石英（紫外區(qū)）玻璃（可見區(qū)）吸收池光程：1cm、2cm、3cm等注意：為減少光的損失，吸收池的光學(xué)面必須完全垂直于光束方向。吸收池要挑選配對，因為吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程長度的精度等對分析結(jié)果都有影響。三、吸收池47作用：接受光信號，并把光信號轉(zhuǎn)化為電信號組成：檢測器、放大器常用檢測器：光電管和光電倍增管藍敏（銻銫）光電管210~625nm

紅敏（氧化銫）光電管625~1000nm

四、檢測系統(tǒng)48五、信號指示系統(tǒng)

作用：放大信號并以適當(dāng)方式指示或記錄下來。

常用裝置：有直讀檢流計、電位調(diào)節(jié)指零裝置以及數(shù)字顯示或自動記錄裝置等。

49二、紫外-可見分光光度計的類型（一）幾種光路類型主要有：單光束分光光度計雙光束分光光度計雙波長分光光度計5051

對于多組分混合物、混濁試樣（如生物組織液）分析，以及存在背景干擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙波長分光光度計，能獲得導(dǎo)數(shù)光譜。52（二）光學(xué)性能分光光度計光學(xué)性能的說明：1.波長范圍：195～820nm2.波長準(zhǔn)確度：誤差≤±0.5nm3.波長重現(xiàn)（復(fù)）性：變動值≤0.5nm4.透光率（T）測量范圍：0～150%5.吸光度（A）測量范圍：-0.1730～+2.00之間。536.光度準(zhǔn)確：

透光率滿程誤差為≤±0.5%7.光度重復(fù)性：變動性≤±0.5%8.分辨率：260nm處為?λ=0.03nm9.雜散光：通常以測光訊號較弱的波長處(如200或220nm，310或340nm處)所含雜散光的強度百分比為指標(biāo)。220nm處NaI(1%g/ml)≤0.5％。54（三）分光光度計的校正

通常在實驗室工作中，驗收新儀器或?qū)嶒炇沂褂眠^一段時間后都要進行波長校正和吸光度校正。

1.波長的校正鐠銣玻璃或鈥玻璃都有若干特征的吸收峰，可用來校正分光光度計的波長標(biāo)尺，前者用于可見光區(qū)，后者則對紫外和可見光區(qū)都適用。552.吸光度的校正(即標(biāo)準(zhǔn)溶液校正)

其中以鉻酸鉀溶液應(yīng)用最普遍，《中華人民共和國藥典》(2000版)附錄采用重鉻酸鉀的硫酸溶液(0.005mol／L)。3.吸收池的校正(A、B配對互換)

A→試樣溶液，B→參比溶液；A→參比溶液，B→試樣榕液，測量吸光度。要求前后兩次測得的吸光度差值應(yīng)小于1%。其校正值可供以后實驗中使用。56第三節(jié)紫外-可見分光光度分析方法一、定性分析主要依據(jù)是有機化合物的吸收光譜特征（形狀、數(shù)目、位置、強度和ε等）。采用對比法（試樣光譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進行對照比較）：相同，則可能是同一化合物；有明顯差別，則肯定不是同一化合物。571.對比吸收光譜特征數(shù)據(jù)（λmax、ε或E）2.對比不同波長處的吸光度（或吸光系數(shù)）的比值不只一個吸收峰的化合物，可用不同吸收峰處（或峰與谷）測得吸光度的比值作為鑒別的依據(jù)。

58例如：維生素B12的鑒別，中國藥典規(guī)定在361nm與278nm吸光度的比值應(yīng)為1.70～1.88；361nm與550nm吸光度的比值應(yīng)為3.15～3.45。593.對比吸收光譜的一致性在相同條件下（且濃度相同），比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的吸收光譜圖是否一致。60二、純度檢查雜質(zhì)檢查（定性）①待測化合物無吸收，雜質(zhì)有強吸收；②若化合物有強吸收，而雜質(zhì)無吸收或很弱，則ε降低；③若雜質(zhì)更強的吸收，ε增大。2.雜質(zhì)的限量檢測（控制雜質(zhì)的限量）①控制雜質(zhì)在特定λ處的吸光度A值；②用峰谷吸收度的比值控制雜質(zhì)的限量。61三、單組分的定量方法（一）吸光系數(shù)法：即C=A/εl

通常ε和Ｅ可從手冊或文獻中查到。例：維生素B12的水溶液在361nm處的Ｅ值是207，盛于1cm吸收池中，測得溶液的吸光度為0.414，則溶液的濃度為：C=0.414/（207×1）=0.0200（g/100ml）

若用ε計算，則是每升含mol數(shù)。62（二）校正曲線法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）即：A＝KC(10.9)（三）對照法：即：CX=AX/

AS?

CS63校準(zhǔn)曲線法參比標(biāo)準(zhǔn)樣品待測樣品64四、同時測定多組分的定量方法——計算分光光度法（一）根據(jù)吸光度的加合性（兩組分）1.兩組分的吸收峰不重疊，無干擾；a不重疊652.相互重疊，利用各組分的吸收光譜不同，測定的A聯(lián)立求解，即A1a+b=A1a+A1b=E1a

Ca+E1bCbA2a+b=A2a+A2b=E2a

Ca+E2bCbb重疊66五、結(jié)構(gòu)分析（一）有機化合物的紫外吸收光譜根據(jù)特征光譜，可以推定分子的骨架、判斷發(fā)色團之間的共軛關(guān)系和估計共軛體系中取代基的種類、位置和數(shù)目。要確定物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，必須與紅外、質(zhì)譜和核磁共振等配合。67

紫外-可見吸收光譜一般不用于化合物的結(jié)構(gòu)分析，但利用紫外吸收光譜鑒定化合物中的共軛結(jié)構(gòu)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)還是有一定價值。例如，某化合物在近紫外區(qū)內(nèi)無吸收，說明該物質(zhì)無共軛結(jié)構(gòu)和芳香結(jié)構(gòu)。因此681.飽和烴的價值

飽和烴類分子中只含有鍵，只能產(chǎn)生*躍遷。飽和烴的最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外、可見分光光度計的測量范圍。

常選用作溶劑。

692.含孤立助色團和生色團的飽和有機化合物①H被O、N、S、X等取代，n

*躍遷，能量小，長移。（見表10-5）70

飽和鹵代烴，鹵素原子上存在n電子，可產(chǎn)生n

*的躍遷。例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的n

*躍遷分別出現(xiàn)在173、204和258nm處。這些數(shù)據(jù)不僅說明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相應(yīng)的吸收波長發(fā)生了紅移，也顯示了助色團的助色作用。71②含孤立生色團：n

*

和n

*躍遷（表10-6），因含雜原子雙鍵，故還會產(chǎn)生

*躍遷，150～180nm。例：酮和醛有三個吸收峰：n

*躍遷吸收峰在190nm左右；

*吸收峰在150～180nm之間；n

*

吸收峰在275～295nm之間。723.共軛烯烴①兩個雙鍵中間若有2個以上-CH2-，其吸收峰的位置與一個雙鍵相同，強度約增加一倍。②若是共軛系統(tǒng)，π→π*躍遷將長移，化合物可由無色→有色。734.α、β不飽和酮、醛、酸和酯①若C=C和C=O雙鍵未形成共軛化合物，

*躍遷，約在200nm附近有兩個強吸收峰，約在280nm處有羰基的n

*

吸收峰。②在α、β不飽和醛、酮中，由于C=O和C=C共軛，使

*長移至200～260nm，而n

*躍遷長移到310～350nm，ε<100。

74③溶劑對不飽和酮、醛的影響，溶劑極性增加使

*帶紅移，而使n

*

帶藍移。④羧酸和酯的

*躍遷吸收峰比相應(yīng)的酮、醛的吸收峰長移，而n

*躍遷相對短移。755.芳香族化合物(1)苯和取代苯：在紫外光區(qū)苯有三個吸收帶El、E2和B帶，均由π→π*躍遷產(chǎn)生的，B帶的精細(xì)結(jié)構(gòu)是芳香化合物特征，在極性溶劑中消失。當(dāng)苯環(huán)上有取代基時，苯的三個帶都長移，B帶簡單化。76

取代基的性質(zhì)不同紅移效應(yīng)不同，其紅移的強弱次序大致如下：供電子取代基(electrondonatinggroup)：-CH3＜

-Cl

＜-Br＜-OH＜-OCH3＜

-NH2＜

-O＜-NHCOCH3＜

-NCH3

吸電子取代基（electronwithdrawinggroup）：-NH3+＜-SO2NH2＜-COO-≤-CN-＜

-COOH＜-CHO＜-NO2

77助色團取代：孤對電子雜原子取代，產(chǎn)生n

*

共軛，E2