《微生物發(fā)酵技術(shù)》-項目六 發(fā)酵過程的控制

發(fā)酵技術(shù)項目六發(fā)酵過程的控制第一節(jié)：溫度對發(fā)酵的影響及控制（一）溫度對發(fā)酵的影響（二）影響發(fā)酵溫度的因素（三）最適溫度的選擇（一）溫度對發(fā)酵的影響溫度對微生物細胞生長的影響在一定范圍內(nèi)微生物的生長速率會隨溫度升高而增加；超過最適溫度后，隨溫度升高，酶失活的速度也越快，生長速率下降，菌體衰老提前，發(fā)酵周期縮短，這對發(fā)酵生產(chǎn)極為不利。（一）溫度對發(fā)酵的影響溫度對產(chǎn)物合成的影響抗生素發(fā)酵產(chǎn)物形成速率對溫度反應(yīng)最為敏感，過高或過低的溫度都會使其生產(chǎn)速率下降，影響最終產(chǎn)量。溫度還會影響生物合成的方向。金色鏈霉菌產(chǎn)生金霉素產(chǎn)生四環(huán)素＜30℃

＞35℃（一）溫度對發(fā)酵的影響溫度對基質(zhì)的影響氧的溶解度基質(zhì)的傳質(zhì)速率菌對養(yǎng)分的分解和吸收速率等溫度還通過改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)如：間接影響發(fā)酵的動力學(xué)特性和產(chǎn)物的生物合成。例如，溫度會影響基質(zhì)和氧在發(fā)酵液中的溶解和傳遞速率以及菌對某些基質(zhì)的分解吸收速度等。（二）影響發(fā)酵溫度的因素發(fā)酵熱伴隨發(fā)酵的進行而產(chǎn)生的熱量叫發(fā)酵熱；發(fā)酵熱的產(chǎn)生引起發(fā)酵液溫度變化。Q發(fā)酵=Q生物+Q攪拌-Q蒸發(fā)-Q顯-Q輻射產(chǎn)熱>散熱凈熱量堆積溫度上升相反，產(chǎn)熱<散熱，溫度下降。（二）影響發(fā)酵溫度的因素1.生物熱Q生物在發(fā)酵過程中，菌體不斷利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，將其分解氧化而產(chǎn)生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供細胞合成和代謝產(chǎn)物合成需要的能量，其余一部分以熱的形式散發(fā)出來，這散發(fā)出來的熱就叫生物熱。生物熱的大小是隨菌種和培養(yǎng)基成分不同而變化，具有階段性。（二）影響發(fā)酵溫度的因素2.攪拌熱Q攪拌機械攪拌通氣發(fā)酵罐中，由于機械攪拌帶動發(fā)酵液作機械運動，造成液體之間，液體與攪拌器等設(shè)備之間的摩擦，產(chǎn)生可觀的熱量。攪拌熱與攪拌軸功率有關(guān)，可用下式計算：Q攪拌＝（P/V）3600P/V為通氣條件下單位體積發(fā)酵液所消耗的功率（二）影響發(fā)酵溫度的因素3.蒸發(fā)熱Q蒸發(fā)01通入發(fā)酵罐的空氣，其溫度和濕度隨季節(jié)及控制條件不同而有所變化?？諝膺M入發(fā)酵罐與發(fā)酵液廣泛接觸后，排出引起水分蒸發(fā)所需的熱能，即為蒸發(fā)熱。02水的蒸發(fā)以及排氣因溫度差異夾帶著部分顯熱（Q顯）一起散失到外界。（二）影響發(fā)酵溫度的因素4.輻射熱Q輻射由于罐外壁和大氣間的溫度差異而使發(fā)酵液中的部分熱能通過罐體向大氣輻射的熱量，即為輻射熱。輻射熱的大小取決于罐內(nèi)溫度的差值，差值愈大，散熱愈多。由于Q生物、Q蒸發(fā)和Q顯，特別是Q生物在發(fā)酵過程中是隨時間變化的，因此發(fā)酵熱在整個發(fā)酵過程中也隨時間變化。為了使發(fā)酵能在一定溫度下進行，必須采取措施加以控制，如在夾套或蛇管內(nèi)通入冷水等。（三）最適溫度的選擇根據(jù)菌種及生長階段選擇發(fā)酵溫度可根據(jù)不同菌種、不同產(chǎn)品進行控制。微生物種類不同，所具有的酶系及其性質(zhì)不同，所以要根據(jù)菌種特性選擇溫度范圍。另外在生長階段，應(yīng)選擇最適生長溫度；在產(chǎn)物分泌階段，應(yīng)選擇最適生產(chǎn)溫度。（三）最適溫度的選擇根據(jù)發(fā)酵條件選擇例如，供氧條件差的情況下最適的發(fā)酵溫度可能比在正常良好的供氧條件下低一些。這是由于在較低的溫度下氧溶解度相應(yīng)大一些，菌的生長速率相應(yīng)小一些，從而彌補了因供氧不足而造成的代謝異常。（三）最適溫度的選擇根據(jù)培養(yǎng)基的成分和濃度選擇使用稀薄或較易利用的培養(yǎng)基時提高發(fā)酵溫度則養(yǎng)分往往過早耗竭，導(dǎo)致菌絲過早自溶，產(chǎn)量降低。例如，提高紅霉素發(fā)酵溫度在玉米漿培養(yǎng)基中的效果就不如在黃豆餅粉培養(yǎng)基的好，因提高溫度有利于黃豆餅粉的同化。第二節(jié)：pH對發(fā)酵的影響及控制（一）pH對發(fā)酵的影響（二）發(fā)酵過程pH變化規(guī)律（三）發(fā)酵過程pH的調(diào)控策略（一）pH對發(fā)酵的影響不同類型微生物——生長耐受的pH范圍不同細菌：霉菌和酵母菌：放線菌：中性或偏堿性偏酸性偏堿性pH6.3~7.5pH3~6pH7～8（一）pH對發(fā)酵的影響pH影響胞內(nèi)酶活性01pH影響細胞膜的通透性02pH影響微生物的細胞結(jié)構(gòu)03pH影響微生物對物質(zhì)的吸收和利用04（一）pH對發(fā)酵的影響pH影響微生物產(chǎn)物合成改變產(chǎn)物合成途徑酶的性質(zhì)改變代謝方向黑曲霉發(fā)酵：pH2-3，產(chǎn)生檸檬酸。產(chǎn)物合成的最適pH和微生物生長的最適pH不一定相同。pH-7.0，產(chǎn)生草酸。丙酮丁醇菌：生長最適pH2.5~7.0產(chǎn)物合成最適pH4.3~5.3（二）發(fā)酵過程pH變化規(guī)律1.在菌體生長階段pH值有上升或下降的趨勢。如利福霉素B發(fā)酵起始pH為中性，但生長初期由于菌體產(chǎn)生的蛋白酶水解培養(yǎng)基中的蛋白胨而生成NH4+，使pH上升至堿性。接著，隨著菌體對NH4+利用量的增多以及葡萄糖利用過程中產(chǎn)生的有機酸積累使pH下降到酸性范圍，此時有利于菌的生長。（二）發(fā)酵過程pH變化規(guī)律2.在生產(chǎn)階段pH趨于穩(wěn)定，維持在最適產(chǎn)物合成的范圍。（二）發(fā)酵過程pH變化規(guī)律3.菌絲自溶階段隨著基質(zhì)的耗盡，菌體蛋白酶的活躍，培養(yǎng)液中氨基氮增加，致使pH又上升，此時菌絲趨于自溶而代謝活動終止。（三）發(fā)酵過程pH的調(diào)控策略考慮發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方通過適當(dāng)?shù)奶嫉?、緩沖物質(zhì)等使發(fā)酵過程中的pH值變化在合適的范圍內(nèi)。如培養(yǎng)基中含有葡萄糖、（NH4）2SO4，等代謝產(chǎn)酸和NaNO3、尿素等產(chǎn)堿的物質(zhì)以及緩沖劑如CaCO3等成分，它們在發(fā)酵過程中要影響pH值的變化。（三）發(fā)酵過程pH的調(diào)控策略直接補加酸或者補加堿這種方式調(diào)節(jié)ph迅速，適用范圍大。但生產(chǎn)上避免一次加入過量造成局部ph變化過大。01可通過補糖速率，調(diào)節(jié)空氣流量來調(diào)節(jié)pH。02也可用其他生理酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)來控制。如當(dāng)發(fā)酵的pH值和氨氮含量都低時，補加氨水；反之pH值較高，氨氮含量又低時，就補加（NH4）2SO4。它們不僅可以調(diào)節(jié)pH值，還可以補充氮源。（三）發(fā)酵過程pH的調(diào)控策略通過補料調(diào)節(jié)第三節(jié)：溶解氧對發(fā)酵的影響及控制（一）發(fā)酵過程中氧的供需關(guān)系（二）溶解氧變化規(guī)律（三）發(fā)酵中溶解氧的控制（一）發(fā)酵過程中氧的供需關(guān)系1.發(fā)酵液中氧的需求發(fā)酵過程中，監(jiān)測發(fā)酵液中的溶解氧濃度是了解溶氧是否足夠的最簡便有效的辦法，從溶解氧變化的情況可以了解氧的供需規(guī)律及其對生長和產(chǎn)物合成的影響。（一）發(fā)酵過程中氧的供需關(guān)系2.微生物對氧的需求發(fā)酵過程中，監(jiān)測發(fā)酵液中的溶解氧濃度是了解溶氧是否足夠的最簡便有效的辦法，從溶解氧變化的情況可以了解氧的供需規(guī)律及其對生長和產(chǎn)物合成的影響。呼吸強度是指單位質(zhì)量的干菌體在單位時間內(nèi)所消耗的氧量，以Qo2表示，單位為[mmol/（g·h）]。微生物攝氧率是指單位體積培養(yǎng)液在單位時間內(nèi)消耗的氧量，以r表示，單位為[mmol/（L·h）]。（一）發(fā)酵過程中氧的供需關(guān)系r=QO2Xr——攝氧率QO2——呼吸強度X——培養(yǎng)基中菌體的濃度，g/L（一）發(fā)酵過程中氧的供需關(guān)系臨界溶解氧濃度隨溶解氧增加而增加，當(dāng)增加到一定值后不再增加，其轉(zhuǎn)折點叫臨界氧濃度，以C臨界表示。指滿足微生物呼吸的最低氧濃度。（二）溶解氧的變化規(guī)律發(fā)酵前期：發(fā)酵中后期：發(fā)酵后期：微生物大量繁殖，需氧量不斷增加，此時需氧超過供氧，溶氧明顯下降，同時黏度上升。對于分批發(fā)酵來說，溶解氧濃度變化比較小。由于菌體衰老，呼吸減弱，溶氧濃度也會逐步上升，一旦菌體自溶，溶氧就會明顯上升。（二）溶解氧的變化規(guī)律（三）發(fā)酵中溶解氧的控制01知己（設(shè)備供氧量控制）02知彼（微生物需氧量控制）03百戰(zhàn)不殆！（三）發(fā)酵中溶解氧的控制1.供養(yǎng)方面溶解氧濃度的控制在供氧方面，主要是設(shè)法提高氧傳遞的推動力（C*-CL）和液相體積傳氧系數(shù)KLa值?？蓮南率娇紤]：Nv=KLa（C*-CL）Nv為單位體積液體氧的傳遞速率，mmol/（L·h）；KLa為體積溶氧系數(shù)；C*為氧在培養(yǎng)液中的飽和濃度，mmol/lL；CL為發(fā)酵液中的溶解氧濃度，mmol/L。（三）發(fā)酵中溶解氧的控制要想增加氧傳遞的推動力，就必須設(shè)法提高C*或降低CL。（1）提高C*可采用的方法①在通氣中摻入純氧或富氧，使氧分壓提高。②提高罐壓但需注意CO2的溶解濃度增加。③改變通氣速率，其作用是增加液體中夾持氣體體積的平均成分。④由于氧傳質(zhì)的溫度系數(shù)比生長速率的低，降低發(fā)酵溫度可得到較高的溶解氧值。⑤降低溶質(zhì)的濃度可減少菌的生長速率，也可達到限制菌對氧的大量消耗，從而提高溶解氧水平。（2）降低發(fā)酵液中的CL如降低通氣量和攪拌速度可降低CL，但發(fā)酵過程中發(fā)酵液的CL不能低于C臨，否則就會影響微生物的呼吸。（三）發(fā)酵中溶解氧的控制（3）影響KLa的因素（三）發(fā)酵中溶解氧的控制①攪拌功率KLa與單位體積發(fā)酵液實際消耗的攪拌功率成正比。②空氣流速機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐的溶解氧系數(shù)KLa與空氣線速度Vs有關(guān)，當(dāng)增加通風(fēng)量時，空氣線速度相應(yīng)增加，從而增大溶解氧。（3）影響KLa的因素（三）發(fā)酵中溶解氧的控制③發(fā)酵罐體積通常發(fā)酵罐體積大，氧的利用率高；體積小，氧的利用率差。④泡沫的影響蛋白質(zhì)物質(zhì)和通氣攪拌是生產(chǎn)泡沫的主要因素。泡沫形成后CO2排出和O2進入困難，直接影響微生物的呼吸。其次，是在攪拌葉片處形成泡沫影響氣、液兩相接觸，降低氧的傳遞。（三）發(fā)酵中溶解氧的控制2.需氧方面溶解氧濃度的控制從式r=QO2X考慮，若發(fā)酵液中溶解氧暫時不變，即供氧=需氧，則有KLa（C*-CL）=QO2X。能影響這一公式的因子會改變?nèi)芙庋鯘舛取Ｓ绊懶柩醯墓に嚧胧喝绺纳凭N特性、改進和優(yōu)化培養(yǎng)基性能、控制補料或加糖速率、改變發(fā)酵溫度、控制溶解氧和CO2、中間補水以及添加表面活性劑等。第四節(jié)基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響及控制01碳源對發(fā)酵的影響及其控制02氮源對發(fā)酵的影響及其控制03磷酸鹽的濃度對發(fā)酵的影響及控制基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響及其控制依靠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的濃度來控制菌體濃度，確定培養(yǎng)基配方中各組分適當(dāng)?shù)呐浔?，避免產(chǎn)生過濃(或過稀)的菌體量；然后通過中間補料來控制，當(dāng)菌濃太稀時，可補加一部分基質(zhì)，促進生長，提高菌濃；但補加過多，則會使菌體過分生長，超過臨界濃度，對產(chǎn)物合成產(chǎn)生抑制作用。（一）碳源對發(fā)酵的影響及其控制碳源是微生物生長繁殖的關(guān)鍵，一些碳源在細胞內(nèi)分解代謝，為細胞提供小分子碳架的同時還能產(chǎn)生能量供合成代謝。碳源的濃度對于菌體生長和產(chǎn)物的合成有著明顯的影響，如培養(yǎng)基中碳源含量超過5%，細菌的生長會因細胞脫水而開始下降。酵母或霉菌可耐受更高的葡萄糖濃度，達200g/L，這是由于它們對水的依賴性較低。（一）碳源對發(fā)酵的影響及其控制在碳源中，微生物最長利用的是糖類及其衍生物，尤其是單糖（葡萄糖、果糖）、雙糖（蔗糖、乳糖、麥芽糖），絕大多數(shù)微生物都能利用。碳源的濃度碳源營養(yǎng)過于豐富對菌體的代謝、產(chǎn)物的合成及氧的傳遞都會產(chǎn)生不良的影響。如酵母的Crabtree效應(yīng)：酵母生長在高糖濃度下，雖溶解氧充足仍會進行厭氧發(fā)酵，從葡萄糖產(chǎn)生乙醇。為了阻止乙醇的生成，需控制生長速度和葡萄糖濃度。在這種情況下，采用補料分批或連續(xù)培養(yǎng)可以避免Crabtree效應(yīng)的出現(xiàn)?？刂铺荚吹臐舛冉?jīng)驗法：根據(jù)不同代謝類型來確定補糖時間、補糖量和補糖方式。動力學(xué)法：根據(jù)菌體的比生長速率、糖比消耗速率及產(chǎn)物的比生成速率等動力學(xué)參數(shù)來控制。（二）氮源對發(fā)酵的影響及其控制與碳源相似，氮源的濃度過高，會導(dǎo)致細胞脫水死亡，且影響傳質(zhì);濃度過低，菌體營養(yǎng)不足，影響產(chǎn)物的合成。不同產(chǎn)物的發(fā)酵中，所需的氮的濃度也不同。例如，谷氨酸發(fā)酵需要的氮源比一般的發(fā)酵多得多。一般的發(fā)酵工業(yè)碳氮比為100:(0.22.0)，谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100:(15~21)，當(dāng)碳氮比為100:11以上，才開始積累谷氨酸。（二）氮源對發(fā)酵的影響及其控制氨濃度對谷氨酸的產(chǎn)率也有影響影響產(chǎn)物合成的方向和產(chǎn)量，如：谷氨酸發(fā)酵——NH4+供應(yīng)不足，促使形成α-酮戊二酸；NH4+過量，促使谷氨酸轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺；控制適量的NH4+濃度。如何控制氮源濃度1.補加有機氮源，添加某些可調(diào)節(jié)生長代謝的有機氮源，如酵母粉、玉米漿、尿素等。例如青霉素發(fā)酵中，后期出現(xiàn)糖利用緩慢、菌體濃度變稀、菌絲展不開、pH下降的現(xiàn)象，補加尿素水溶液就可以改變這種情況并提高產(chǎn)量。2.補加無機氮源，工業(yè)中常用的方法是補加氨水或硫酸銨，其中氨水既可作為無機氮源，又可調(diào)節(jié)pH。（三）磷酸鹽的濃度對發(fā)酵的影響及控制磷是構(gòu)成蛋白質(zhì)、核酸和ATP的必要元素，是微生物生長繁殖所必需的成分，也是合成代謝產(chǎn)物所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。ATP結(jié)構(gòu)（三）磷酸鹽的濃度對發(fā)酵的影響及控制微生物生長良好時，所允許的磷酸鹽濃度為0.32~300mmol/L，但次級代謝產(chǎn)物合成良好時所允許的磷酸鹽最高平均濃度僅為1mmol/L。當(dāng)提高到10mml/L時，可明顯抑制其合成。菌體生長所允許的濃度和次級代謝產(chǎn)物合成所允許的濃度相差懸殊。因此，控制磷酸鹽濃度對微生物次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵的意義非常大。磷酸鹽濃度的控制磷酸鹽最適濃度取決于菌種特性、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基組成和原料