版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
第三章細胞工程共一百二十七頁23.1細胞工程的基本技術3.2植物細胞工程3.3動物細胞工程3.4單克隆抗體3.5核移植與克隆動物3.6干細胞共一百二十七頁3.1細胞工程的基本(jīběn)技術細胞工程實驗室的常見設備(shèbèi)細胞培養(yǎng)的基本方法3共一百二十七頁3.1.1細胞工程實驗室的常見(chánɡjiàn)設施滅菌鍋電熱(diànrè)干燥箱超凈工作臺倒置顯微鏡細胞計數(shù)板4電熱鼓風干燥箱手提式高壓滅菌鍋立式高壓滅菌鍋垂直雙人雙面超凈工作臺離心機光照培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱液氮罐共一百二十七頁倒置(dàozhì)顯微鏡細胞計數(shù)板5動物細胞培養(yǎng)中用于觀察細胞的生長狀況(zhuàngkuàng)及計數(shù)。共一百二十七頁CO2培養(yǎng)箱(動物(dòngwù)細胞培養(yǎng))6光照(guāngzhào)培養(yǎng)箱(植物細胞培養(yǎng))CO2培養(yǎng)箱主要控制模擬活體內環(huán)境相關的3個基本變量:穩(wěn)定的CO2水平、溫度、相對濕度。共一百二十七頁液氮罐(用于凍存培養(yǎng)(péiyǎng)的動物細胞)7共一百二十七頁3.1.2細胞培養(yǎng)的基本(jīběn)方法
——無菌操作
細胞工程的所有試驗都要求在無菌條件下進行,要求十分嚴格的無菌操作。
1、準備室、接種室、培養(yǎng)(péiyǎng)室(紫外線、熏蒸等);
2、超凈工作臺、高壓滅菌設備、過濾器;
3、生物材料的消毒(酒精、升汞、次氯酸鈉等);
4、試驗器械、器皿的滅菌(干熱、濕熱);
5、藥品、培養(yǎng)基的滅菌(濕熱、過濾);8共一百二十七頁細胞培養(yǎng)技術(jìshù)細胞培養(yǎng)是指動物、植物或微生物細胞在體外無菌條件下的保存和生長。(微生物培養(yǎng)、植物細胞培養(yǎng)、動物細胞培養(yǎng))基本(jīběn)步驟包括:獲取原材料及除菌;配制培養(yǎng)基,對培養(yǎng)基進行滅菌;接種、培養(yǎng)和傳代。9共一百二十七頁細胞融合技術(jìshù)離體條件下將不同生物或同種生物不同類型的單細胞通過無性方式融合成一個(yīɡè)雜合細胞的技術?!獑慰寺】贵w細胞融合技術的主要過程:制備原生質體(植物);誘導細胞融合(化學融合劑介導、電融合、病毒融合劑介導等);篩選雜合細胞。10共一百二十七頁核移植用機械的辦法將供體細胞的細胞核轉移至另一個受體細胞(去除(qùchú)細胞核)中,并使這個重組細胞進一步發(fā)育、分化。——克隆羊Dolly11共一百二十七頁3.2植物(zhíwù)細胞工程121幾個基本概念2組織培養(yǎng)的基本方法3快速繁殖技術4植物脫毒技術5次生物質與植物細胞的大量培養(yǎng)6原生質體培養(yǎng)與細胞融合7人工種子共一百二十七頁細胞(xìbāo)的全能性(totipotence)1902年:德國植物學家哈伯蘭德(Haberlandt)就預言,植物細胞具有全能性,即植物活細胞具有能夠發(fā)育成為完整植株的潛在(qiánzài)能力。1943年,懷特明確提出了“植物細胞全能性”學說:每個植物細胞具有該植物的全部遺傳信息和發(fā)育成完整植株的能力。植物細胞的全能性,是植物細胞工程創(chuàng)立的重要理論基礎。131997年多利羊誕生證明了動物細胞全能性3.2.1幾個基本概念*共一百二十七頁外植體、愈傷組織(zǔzhī)外植體:從健康植株的特定部位或組織,選擇用于組織培養(yǎng)的起始材料(cáiliào),稱之為外植體??梢允瞧鞴佟⒔M織、細胞和原生質體等(如:花粉、莖段、葉片、莖尖、胚等)。愈傷組織:原指從植物的傷口部位生成的脫分化的薄壁細胞團。組織培養(yǎng)時,則指在培養(yǎng)基上從外植體上長出的一團無序薄壁細胞。它具有再分化成為完整植物體的潛能。14水稻幼胚水稻愈傷組織共一百二十七頁細胞(xìbāo)分化、脫分化、再分化分化(fēnhuà)(diffrentiation):細胞的形態(tài)、構造和功能發(fā)生變化,如花芽分化,木質部分化,不定胚分化;脫分化(dediffrentiation):培養(yǎng)條件下使一個已分化的細胞回復到原始無分化狀態(tài)或分生細胞狀態(tài)的過程就是細胞脫分化;再分化(rediffrentiation):將脫分化的母細胞再培養(yǎng)成分化細胞,并且形成組織或器官以及生物體;15水稻幼胚水稻愈傷組織脫分化分化出苗再分化共一百二十七頁植物(zhíwù)細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基16糖(碳源),氨基酸,維生素等水:大量(dàliàng)元素:K,Ca,Mg,P,S等微量元素:Cl,Fe,Mn,B,Zn,Cu,Co等無機營養(yǎng):蒸餾水或去離子水有機營養(yǎng):生長調節(jié)物質:生長素:2,4-D,NAA,IAA等。促進根的分化細胞分裂素:6-BA,玉米素,激動素等,促進芽的分化天然附加物:椰乳,酵母提取物,麥芽浸出物等植物生長所必須的元素:大量元素(9種):C、H、O、N、K、Ca、Mg、P、S微量元素(7種):Cl、Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mu共一百二十七頁3.2.2組織培養(yǎng)的基本(jīběn)方法進行植物組織培養(yǎng),一般要經(jīng)歷以下(yǐxià)五個階段:171.材料的準備;2.接種與培養(yǎng);3.繼代增殖;4.誘導分化、生根成芽;5.移栽、煉苗成活。共一百二十七頁18水稻幼胚水稻成熟胚愈傷組織(zǔzhī)分化(fēnhuà)出苗誘導成芽誘導生根(底面觀)誘導生根(側面觀)移栽、煉苗共一百二十七頁19共一百二十七頁3.2.3快速繁殖(fánzhí)技術植物快速(kuàisù)繁殖技術(快繁):利用組織培養(yǎng)方法將植物體某一部分的組織小塊,進行培養(yǎng)并誘導分化成大量的小植株,從而達到快速無性繁殖的目的。也稱為試管苗繁殖或微體繁殖。20快繁技術最早在蘭花工業(yè)上獲得成功。在20平方米的培養(yǎng)室內,最多可容納100萬株試管苗。共一百二十七頁21共一百二十七頁3.2.4植物(zhíwù)脫毒技術是植物快繁的一個分枝1952年,法國科學家首次建立了生長點培養(yǎng)成株的脫毒法,從而開創(chuàng)了防治植物病毒病的新途徑。對植物病毒病迄今已采用的生物、物理、化學等多種防治途徑均收效甚微,有的毫無成效(chéngxiào)。因此,過去人們只能采取拔除并消毀病株的消極方法。22共一百二十七頁原理(yuánlǐ)在感染病毒的植株中,病毒的分布是不一致的。老葉片及成熟組織和器官中,病毒含量較高,但幼嫩的和未成熟的植物部位(bùwèi)(如莖尖分生組織),病毒的含量較低,而在生長點約0.1~1毫米時,則幾乎不含病毒顆粒。這是由于病毒的繁殖運輸速度與莖尖細胞生長速度不同所致。在莖尖分生組織中,細胞繁殖十分迅速,病毒還來不及侵入,因此就成為植物體相對無病毒的特殊區(qū)域。23共一百二十七頁采取不含病毒顆?;虿《绢w粒含量甚少的0.1~0.5毫米帶1~2個葉原基的莖尖作為外植體,進行微繁殖,使其培養(yǎng)成完整的無病毒小植株的技術。所取的外植體很小,分離難度大,一般在解剖鏡下操作。馬鈴薯、洋蔥、大蒜、蘭花、菊花、康乃馨、水仙、唐菖蒲、香蕉(xiāngjiāo)、蘋果、柑橘、葡萄等。24共一百二十七頁華中(Huázhōng)農大馬鈴薯脫毒試管苗25共一百二十七頁3.2.5次生物質與植物細胞(xìbāo)的大量培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物是指生物中一大類并非生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物,其產(chǎn)生(chǎnshēng)和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育期的特異性。那些應用價值高,價格昂貴,資源不足,難以進行化學合成的植物次生物質,用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)才會有經(jīng)濟上的效益。
261956年,提出工業(yè)化培養(yǎng)植物細胞以生產(chǎn)其天然產(chǎn)物。之后,用此方法生產(chǎn)了紫草寧、哈爾堿、麻黃堿、人參皂角苷、紫杉醇等?!侗静菥V目》中所開列的1892種藥物中絕大多數(shù)是植物;目前約有25%的法定藥品來自植物。共一百二十七頁第一個商品化的細胞大規(guī)模培養(yǎng)的植物是紫草。1983年,日本三井石油化學工業(yè)公司利用紫草細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧,最終(zuìzhōnɡ)濃度達1400mg/L,宣布把紫草寧作為燃料和藥物進行工業(yè)化生產(chǎn)。在搖床擴大培養(yǎng)(péiyǎng)的長春花細胞27紫草我國已經(jīng)建立了人參、三七、西洋參、三尖杉、紫草、洋地黃、長春花、丹參、紅豆杉等40多種藥用植物的液體培養(yǎng)系統(tǒng),并對長春花、人參、紫草、紅豆杉等進行大規(guī)模培養(yǎng)的探索。長春花共一百二十七頁28紅豆杉紅豆杉樹皮中提取的紫杉醇對治療卵巢癌和乳腺癌有特效。這種物質的碳環(huán)結構十分特殊(tèshū),難以通過化學合成獲得。然而要治好一個卵巢癌病婦,至少需要2~3棵60老齡的此種樹的樹皮。這種樹屬于稀有樹種,且生長很慢,若不斷取用的話,很快就要面臨瀕危的境地。我生物(shēngwù)技術產(chǎn)物第一個商品化的例子:人參,中國藥科大學組培室人參共一百二十七頁3.2.6原生質體培養(yǎng)(péiyǎng)與細胞融合是指將不同來源的原生質體(除去細胞壁的細胞)相融合并使之分化再生、形成新物種或新品種的技術。可以避開生殖細胞的受精過程,在親緣(qīnyuán)更遠的物種間實現(xiàn)基因轉移,創(chuàng)造出自然界中所沒有的新物種。目前仍以種內和種間的細胞雜種為主。29顯微鏡下的細胞融合過程共一百二十七頁細胞融合的方法(fāngfǎ)
物理法(電)、化學法(化學融合劑)及生物(shēngwù)法(病毒融合劑)。原理:增加細胞間的粘附、改變膜的通透性——隨機結合、融合植物細胞融合常用PEG法和電融合法。30目前,最常用的植物細胞融合技術,有高國楠建立的使用化學融合劑PEG(聚乙二醇)的融合技術(1974),森達和喬默爾曼創(chuàng)立和發(fā)展的電融合技術,以及斯維格(1987)將電融合與微培養(yǎng)結合起來的技術。共一百二十七頁31植物(zhíwù)原生質體融合過程共一百二十七頁3.2.7人工(réngōng)種子人工種子(zhǒngzi)又稱人造種子(zhǒngzi),這是細胞工程中最年輕的一項新興技術。由英國科學家于1978年提出的。天然種子,一般都是由種皮、胚乳和胚三部分構成。人工種子是由體細胞胚、人工胚乳和人工種皮三個部分組成。32共一百二十七頁體細胞胚胚不一定從受精卵發(fā)育來,尤其在植物界,往往可以看到未受精的卵細胞或胚囊細胞、珠心細胞等發(fā)育成胚的現(xiàn)象。由體細胞發(fā)育成的類似于合子胚的結構成為胚狀體或體細胞胚,簡稱(jiǎnchēng)體胚。體胚具有兩極性,可從方向相反的兩端分化出莖和根。因此,體胚可以一次性再生成完整植株。把體胚包埋在膠囊內形成球狀結構,使其具備種子機能。所以,人工種子是一種人工制造的代替天然種子的顆粒體,可以直接播種于田間。33馬鈴薯人工(réngōng)種子共一百二十七頁包埋介質(jièzhì)海藻酸鈉這種物質在0.1M氯化鈣溶液中可以迅速固化成透明的小膠球。海藻(hǎizǎo)酸價格低廉,質地柔軟無毒性,還可人為地在其中加入各種營養(yǎng)物質和生長調節(jié)劑,因此是一種,迄今為止已發(fā)現(xiàn)的比較理想的體細胞胚包埋劑。34美國的一個研究組花了近兩年時間,從百余種材料中篩選到目前廣泛使用的人工種子包埋介質海藻酸鈉。共一百二十七頁三大(sāndà)難題有待克服①許多(xǔduō)重要植物還不能培養(yǎng)出大量的高質量的體細胞胚。②現(xiàn)有的人工胚乳和種皮還不夠理想,不能有效地防止微生物的腐蝕。③人工種子的貯藏有待進一步完善。35目前已制成模式性人工種子的植物十余種,但距離實際應用還有很大距離。共一百二十七頁3.3動物細胞工程(gōngchéng)3.3.1動物細胞培養(yǎng)3.3.2動物細胞培養(yǎng)的基本過程3.3.3體外培養(yǎng)(péiyǎng)的動物細胞的生長類型3.3.4動物細胞培養(yǎng)條件3.3.5動物細胞的凍存與復蘇3.3.6動物細胞培養(yǎng)應用36共一百二十七頁3.3.1動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)動物細胞(組織)培養(yǎng):從動物體內取出細胞(或組織),模擬體內的生理環(huán)境,在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)(yíngyǎng)條件下,使離體細胞(或組織)生存、生長并維持結構和功能。起源于19世紀所應用的某些胚胎學技術。奠基人:美國生物學家哈里森。在1907年采用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中,保持存活了幾周時間,并觀察到細胞突起的生長過程。37共一百二十七頁培養(yǎng)(péiyǎng)器具38過濾器離心管培養(yǎng)(péiyǎng)瓶凍存管共一百二十七頁幾個(jǐɡè)概念原代培養(yǎng)期(10代細胞以內(yǐnèi))傳代培養(yǎng)期(10代細胞以后)細胞株:(10-50代細胞)細胞系:(50代細胞以后,細胞發(fā)生了癌變)39共一百二十七頁原代培養(yǎng)(péiyǎng)
(primaryculture)把第1代細胞(xìbāo)的培養(yǎng)與傳10代以內的細胞培養(yǎng)統(tǒng)稱為原代培養(yǎng)。40過程:從動物機體中取出組織
剪碎加胰蛋白酶細胞游離加培養(yǎng)液將細胞接種到培養(yǎng)瓶內
培養(yǎng)(1—2天換一次培養(yǎng)液)
細胞貼壁生長
長成單層細胞細胞接種后一般幾小時內就能貼壁,并開始生長,如接種的細胞密度適宜,5天到一周即可形成單層。共一百二十七頁傳代培養(yǎng)(subculture)體外培養(yǎng)的原代細胞或細胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代,以便獲得穩(wěn)定的細胞株或得到大量的同種細胞,并維持(wéichí)細胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細胞形成單層匯合以后,由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭,將培養(yǎng)的細胞分散,從容器中取出,以1:2或l:3以上的比率轉移到另外的容器中進行培養(yǎng),即為傳代培養(yǎng)。41共一百二十七頁42細胞株:從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出進行(jìnxíng)傳代培養(yǎng)的細胞,能傳到40-50代,其遺傳物質沒有發(fā)生變化。細胞系:體外培養(yǎng)的動物細胞傳到40-50代后有部分細胞遺傳物質發(fā)生了變化,帶有癌變的特點,可能在培養(yǎng)條件下無限制的傳代下去(xiàqù),這種傳代細胞稱為細胞系。共一百二十七頁在進行動物細胞培養(yǎng)時,用胰蛋白酶分散細胞,說明細胞間的物質(wùzhì)主要是蛋白質。動物細胞培養(yǎng)適宜的pH為7.2-7.4,此環(huán)境下胃蛋白酶(最適pH2.0)沒有活性,而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。3.3.2動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)的基本過程43選材:多選擇動物胚胎或幼齡動物的組織、器官,因為它們細胞增殖能力強,分裂旺盛,分化程度低,容易培養(yǎng)。共一百二十七頁44基本(jīběn)過程:動物胚胎(pēitāi)或幼齡動物的組織、器官細胞懸浮液胰蛋白酶10代細胞原代培養(yǎng)的細胞50代細胞細胞株無限傳代細胞系單個細胞加培養(yǎng)液遺傳物質未改變動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質,將細胞網(wǎng)絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。(分解彈性纖維)遺傳物質已改變共一百二十七頁3.3.3體外培養(yǎng)的動物細胞的生長(shēngzhǎng)類型離體培養(yǎng)的動物細胞可分為(fēnwéi)三類:貼壁依賴性貼壁非依賴性兼性貼壁細胞。45共一百二十七頁貼壁依賴性細胞(xìbāo)動物細胞培養(yǎng)中,大多數(shù)哺乳動物細胞需有給予貼附的支持物表面,細胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼壁因子才能在該表面上生長、增殖。這樣的細胞稱為貼壁細胞;當細胞布滿表面后即停止生長,這時若取走一片細胞,存留在表面上的細胞就會沿著(yánzhe)表面生長而重新布滿創(chuàng)面。要求:培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內表面光滑、無毒、易于貼附。46共一百二十七頁接觸抑制當貼壁細胞分裂(fēnliè)生長到表面相互接觸時,細胞就會停止分裂(fēnliè)增殖,這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。
正常二倍體細胞的生長壽命是有限的,而異倍體細胞無接觸抑制現(xiàn)象,其壽命是無限的,如腫瘤細胞。47共一百二十七頁48培養(yǎng)中的胃癌(wèiái)細胞MGC-803(多層)共一百二十七頁貼壁非依賴性細胞(xìbāo)體外生長不必貼壁,可在培養(yǎng)液中懸浮生長,細胞透明度較大,邊緣不是那么清晰,故也叫懸浮型細胞。一些在體內原本就以懸浮狀態(tài)生長的細胞,當接種于體外環(huán)境中也可以以懸浮狀態(tài)生長。血液(xuèyè)白細胞、淋巴組織細胞,某些腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉化細胞系等都屬此類細胞。這類細胞形態(tài)學特點是胞體始終為球形。49兼性細胞生長不嚴格依賴支持物。如中國地鼠卵巢細胞,小鼠L929細胞。共一百二十七頁3.3.4動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)條件1、無菌、無毒的環(huán)境(添加一定量的抗生素,定期更換培養(yǎng)液)2、營養(yǎng)要求高(葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等。)3、環(huán)境要求高:溫度(wēndù)和pH36.5+0.5度,7.2-7.44、氣體環(huán)境:
O2和CO2(95%空氣和5%CO2
)50保證細胞順利的生長增殖不同血清對細胞作用不同。以小牛血清最好,成年牛和馬血清次之。共一百二十七頁3.3.5動物細胞的凍存與復蘇(fùsū)冷凍保存:將體外培養(yǎng)物或生物(shēngwù)活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中,以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70℃的超低溫條件),并在此溫度下對其長期保存的過程。復蘇:以一定的復溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復到常溫的過程。在復蘇時,一般以很快的速度升溫,1-2分鐘內即恢復到常溫。51共一百二十七頁冷凍保存(bǎocún)方法
最常用的方法:利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-70℃
~-80℃
,然后直接投入液氮進行保存;或者(huòzhě)是利用電子計算機程控降溫儀以及利用液氮的氣、液,按一定的降溫速率從室溫降至-1000C以下,再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結的細胞懸液或多或少都有冰晶的形成。52共一百二十七頁53獲得(huòdé)細胞或細胞產(chǎn)物細胞(xìbāo)的全能性細胞株、細胞系植物個體或細胞培養(yǎng)結果快速繁殖、培育無病毒植株等培養(yǎng)目的葡萄糖、動物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質細胞增殖原理動物細胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項目植物細胞和動物細胞培養(yǎng)的比較共一百二十七頁3.3.6動物(dòngwù)細胞培養(yǎng)應用利用體外培養(yǎng)的動物細胞來大規(guī)模生產(chǎn)生物制品(病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體)獲得(huòdé)大量自身的皮膚細胞,用于植皮培養(yǎng)的動物細胞可以用于檢測有毒物質,判斷某種物質的毒性為治療和預防癌癥及其他疾病提供理論依據(jù)54共一百二十七頁3.4單克隆抗體(kàngtǐ)長期以來,為了獲得抗體,采用的是把某種抗原反復注射到動物體內,然后從動物血清中分離出所需抗體的方法。用這種方法獲得的抗體,只能是混合抗體,產(chǎn)量低,特異性差,純度(chúndù)低,反應不夠靈敏。人們發(fā)現(xiàn),在動物發(fā)生免疫反應的過程中,體內的B細胞可以產(chǎn)生多達百萬種以上的特異性抗體,但是每個B細胞只分泌一種化學性質單一、特異性強的抗體。要想獲得大量的單一抗體,必須用單個B細胞進行無性繁殖,即克隆。55共一百二十七頁56什么是抗體?由何種細胞產(chǎn)生?主要分布在哪里(nǎli)?起何作用?什么是單克隆抗體?B細胞(xìbāo)血清特異性免疫作用抗體:機體受抗原刺激后產(chǎn)生的,并且能與該抗原發(fā)生特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。用單個B淋巴細胞進行無性增殖(擴增),也就是通過克隆,形成細胞群,這樣的細胞群就有可能產(chǎn)生出化學性質單一、特異性強的抗體——單克隆抗體3.4.1幾個基本概念共一百二十七頁57傳統(tǒng)(chuántǒng)抗血清抗原免疫所有抗體(kàngtǐ)混合123412341234脾臟淋巴結B細胞一種抗原通常具有多個不同的抗原決定簇,因此能刺激多個B淋巴細胞產(chǎn)生相應的單克隆抗體,因此血清中的抗體是針對不同抗原決定族的單克隆抗體混合物,稱為多克隆抗體。傳統(tǒng)方法獲得的抗體是多克隆抗體(混合抗體)共一百二十七頁58設計方案:一個B淋巴細胞--只分泌一種特異性抗體(kàngtǐ)小鼠骨髓瘤細胞--能無限增殖化學性質單一、特異性強,只針對一種抗原(kàngyuán)決定簇的抗體。雜合細胞單克隆抗體3.4.2單克隆抗體的制備過程共一百二十七頁591975年,英國劍橋大學分子生物學研究室將已適應于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細胞與用綿羊紅細胞免疫過的小鼠脾細胞(B淋巴細胞)進行融合,發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細胞具有雙親細胞的特征(tèzhēng):即像骨髓瘤細胞一樣在體外培養(yǎng)中能夠無限地快速增殖,又能持續(xù)地分泌特異性抗體。共一百二十七頁60
單克隆抗體制備(zhìbèi)過程注射(zhùshè)抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)篩選,繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體誘導其融合的方法有哪些?兩次篩選分別有什么目的?為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合?共一百二十七頁61雜交瘤細胞(xìbāo)產(chǎn)生單克隆抗體示意圖共一百二十七頁①動物免疫(miǎnyì)與免疫(miǎnyì)脾細胞懸液的制備腹腔注射、皮下淋巴樣器官注射、靜脈注射、皮內注射、肌肉注射等如果需要免疫脾細胞,一般取最后(zuìhòu)一次加強免疫3天以后的脾臟,制備成細胞懸液。
62
單克隆抗體制備過程共一百二十七頁63
小白鼠免疫流程抗原混合(hùnhé)弗氏完全佐劑進行初次免疫至少(zhìshǎo)三次相同劑量的加強免疫效價測定最后一次加強免疫取出脾臟,制備細胞懸液,細胞融合BALB/c02468101214wk試采血加佐劑制成乳劑佐劑:能使抗原緩慢釋放,以便延長抗原與免疫系統(tǒng)接觸的時間;產(chǎn)生高親和力的免疫應答共一百二十七頁64②免疫(miǎnyì)后取出脾臟共一百二十七頁65
脾臟(pízàng)為B細胞集中地取出脾臟(pízàng)內細胞(無菌條件下操作。)共一百二十七頁66③PEG介導細胞融合細胞融合2min加入(jiārù)
PEG共一百二十七頁67④培養(yǎng)(péiyǎng)、篩選融合后的細胞(xìbāo)均分在96孔板中HAT培養(yǎng)基:這一步篩選,主要是篩選出雜合的瘤細胞。共一百二十七頁68
融合后的細胞生長(shēngzhǎng)狀況剛融合完成(wánchéng)一個癌細胞與兩個脾臟細胞經(jīng)數(shù)次分裂后穩(wěn)定的細胞群落JuangRH(2003)共一百二十七頁69PEG脾臟(pízàng)細胞骨髓瘤細胞(xìbāo)細胞融合HAT初步篩選雜合細胞ELISA篩選抗體mm11133332m143m12342mmmm3412mm431mmmmmm2224444共一百二十七頁3.4.3單克隆抗體(kàngtǐ)的應用醫(yī)學檢驗試劑:主要用于特異性、敏感性要求高的的實驗技術中,如傳染病的快速診斷;尋找(xúnzhǎo)腫瘤特異性抗原及檢測腫瘤相關抗原;免疫細胞抗原檢測,等等(主要是利用抗原抗體的特異性反應檢測特異性抗原)。導向治療:生物導彈或免疫導彈抗原物質的分離和提純:親和層析中作為配體,可篩選特異性抗原物質70共一百二十七頁3.5核移植與克隆(kèlónɡ)動物71共一百二十七頁一、什么(shénme)是克隆即由同一個祖先(zǔxiān)細胞分裂而形成的純細胞系,這個細胞系每個細胞的基因彼此是相同的。低等的無脊椎動物中---常見脊椎動物---未見共一百二十七頁分子水平(shuǐpíng)克隆:PCR技術細胞水平克?。簞游锛毎囵B(yǎng)(單克隆抗體)個體水平克隆:克隆羊多利什么(shénme)是克隆技術是一種人工誘導的無性繁殖方式。共一百二十七頁二、(動物細胞的)核移植74將供體細胞核移入去核的卵母細胞中,使后者不經(jīng)精子穿透等有性(yǒuxìnɡ)過程即可被激活、分裂并發(fā)育,使得核供體的基因得到完全復制。共一百二十七頁將早期胚胎、胎兒或成體動物(dòngwù)的細胞核移植到去核的卵母細胞中,重新組成重構胚并使之發(fā)育成成體動物(dòngwù)的過程。共一百二十七頁胚胎核移植在多種動物上獲得了克隆后代(hòudài):綿羊(Willadsen等,1986),牛(Prather等,1987),兔(Stice等,1988),豬(Prather等,1989),山羊(張勇等,1991)等。1997年,由
Mengetal成功地克隆出兩只猴,這是靈長類動物的首次被克隆。
共一百二十七頁1938年漢斯·斯皮曼(克隆(kèlónɡ)之父)蠑螈(rónɡyuán)受精卵的結扎實驗
(一)、核移植技術的發(fā)展簡史共一百二十七頁HansSpemann分化了的細胞核移入卵子中能否指導(zhǐdǎo)胚胎發(fā)育?1952年美國費城(fèichénɡ)癌癥研究院Briggs和King兩棲類囊胚的細胞核移植羅伯特?布里格斯共一百二十七頁Robert
Briggs
(1911-1983)ThomasKing(1921-2000)1952:Briggs&Kingclonefrogs
共一百二十七頁1958年到1962年,英國劍橋大學的JohnGurdon和Machineer利用爪蟾原腸內胚層細胞核移植(yízhí),培育出可育的非洲爪蟾.1970年JohnGurdon以同樣的方法,用青蛙腳蹼角質化細胞進行移核試驗,蛙卵發(fā)育成了蝌蚪。共一百二十七頁童第周
共一百二十七頁上個世紀60年代,童第周對金魚、鯽魚進行(jìnxíng)細胞核移植。1978年又成功地進行了黑斑蛙的克隆試驗,他將黑斑蛙的紅細胞的核移入事先除去了核的黑斑蛙卵中,這種換核卵最后長成能在水中自由游泳的蝌蚪。共一百二十七頁生物(shēngwù)遺傳性狀是細胞核和細胞質相互作用結果
“童魚”開創(chuàng)了人類按照需要進行人工培養(yǎng)新物種(wùzhǒng)的先例,對培育動植物新品種具有重大指導的意義。共一百二十七頁(二)、核移植分類(fēnlèi)根據(jù)核供體細胞來源(láiyuán)的不同1.胚胎細胞的核移植2.體細胞的核移植根據(jù)供體細胞與受體細胞是否來于同一種動物又可將其分為1.同種核移植2.異種核移植兩類。共一百二十七頁胚胎(pēitāi)細胞核移植技術胚胎細胞核移植(embryocelluncleartransplantation)技術。將一個(yīɡè)早期胚胎的細胞核移植到去核的卵母細胞中,構建新合子的生物技術,通常將提供細胞核的細胞稱為供體,接受細胞核的卵母細胞稱為受體。共一百二十七頁此后,胚胎細胞的核移植在多種動物上獲得了克隆后代:綿羊(斯蒂恩·威拉德森等,1986),牛(Prather等,1987),兔(Stice等,1988),豬(Prather等,1989),山羊(shānyáng)(張勇等,1991)等。1997年,由
成功地克隆出兩只猴,這是靈長類動物的首次被克隆。
共一百二十七頁哺乳動物(bǔrǔdòngwù)體細胞核移植技術動物(dòngwù)克隆技術的里程碑共一百二十七頁里程碑式的突破(tūpò)英國羅斯林(Roslin)研究所維爾穆特(Wilmut)博士1997年2月27日在《Nature》宣布用乳腺(rǔxiàn)細胞的細胞核成功克隆出一只綿羊“多莉(Dolly)”
。
88維爾穆特等試驗的生物學意義是證明了哺乳動物的體細胞也具有全能性。在此之前,人們從未能從哺乳動物的已分化的體細胞再培育出基因相同的個體。但是,他們的試驗尚未解決直接從體細胞培養(yǎng)成成體的問題,他們還需借助于卵細胞,即還要依賴卵細胞的細胞質。共一百二十七頁綿羊(miányáng)“多莉”整個克隆過程如下:母綿羊A乳腺細胞
(體細胞)
母綿羊(miányáng)B未受精的卵細胞
母綿羊C“DollyParton”新的卵細胞發(fā)育成胚胎去核卵細胞提取細胞核細胞融合胚胎移植共一百二十七頁HelloDolly!共一百二十七頁為什么?卵母細胞核位置(wèizhi)靠近第一極體,便于一并吸出。通常用10代以內(yǐnèi)的培養(yǎng)細胞,為什么?共一百二十七頁共一百二十七頁1切開卵母細胞透明帶2擠出(jǐchū)卵母細胞細胞核3注入供體細胞核4電融合儀融合123455、培養(yǎng)(péiyǎng)共一百二十七頁胚胎(pēitāi)細胞核移植體細胞核移植細胞核移植(yízhí)的方法共一百二十七頁
1998年7月,美國夏威夷大學Wakayama等報道,由小鼠卵丘細胞克隆了27只成活(chénghuó)小鼠,其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代,這是繼“多莉”以后的第二批哺乳動物體細胞核移植后代。此后,體細胞核移植技術在牛、山羊、豬等多種動物獲得成功。。至1999年底,全世界已有6種類型細胞——胎兒成纖維細胞、乳腺細胞、卵丘細胞、輸卵管/子宮上皮細胞、肌肉細胞和耳部皮膚細胞的體細胞克隆后代成功誕生。共一百二十七頁2000年,楊向中博士領導的實驗室在美國從體外培養(yǎng)6-13代的細胞(xìbāo)克隆出6頭公牛。2000年,美國從衰老細胞克隆出6頭小牛。2000年,英國從成年動物體細胞克隆出5頭豬。2000年,中國西北農林科技大學從4歲山羊耳上取細胞體外培養(yǎng),克隆出1頭山羊。2001年,體細胞克隆狗誕生。2001年,體細胞克隆兔誕生。2002年,體細胞克隆貓誕生。2003年,體細胞克隆猴誕生。2004年,體細胞克隆大鼠誕生。2005年,體細胞克隆馬誕生。96共一百二十七頁2005:我國第一(dìyī)頭體細胞克隆豬克隆
小香豬
共一百二十七頁世界首例體細胞克隆(kèlónɡ)水牛在廣西大學誕生
共一百二十七頁成功率始終很低,具有極大的偶然性和隨機性。277個綿羊胚胎(pēitāi)——1個多莉;夭折率高,不少克隆動物天生患有疾病或體形過大;沒有遺傳物質的交流和互補,將會加劇一些遺傳疾病的發(fā)生。4存在(cúnzài)問題99Dolly的命運:2003年2月14日,多莉因肺部感染無法治愈而死亡,“享年”不足7歲。肺部感染是11-12歲的老年羊的常見病。1999年,法國全國農業(yè)研究所的克隆牛犢出生一月后死亡。尸體解剖發(fā)現(xiàn)其脾臟、胸腺等組織未正常發(fā)育。共一百二十七頁應用(yìngyòng)價值及意義檢驗動物細胞全能性加速動物繁殖、優(yōu)良育種、保護珍貴動物。生殖(shēngzhí)性克隆克隆動物的遺傳背景相同,因此它們是模擬疾病、基因治療、器官移植等研究的良好實驗材料,具有良好的穩(wěn)定性和重復性??梢杂没颊弑救思毎嘤鲂陆M織(器官移植)。治療性克隆100共一百二十七頁5生殖(shēngzhí)性克隆101人體細胞克隆技術生殖(shēngzhí)性克?。寺∪耍┲委熜钥寺。寺∨咛ィ┏鲇卺t(yī)療目的而在實驗室使用克隆技術制造胚胎,然后取出胚胎干細胞進行體外培養(yǎng)以獲得再生組織或器官的過程?!吧承钥寺 保褐赋鲇谏车哪康氖褂每寺〖夹g在實驗室制造人類胚胎,然后將胚胎置入人類子宮發(fā)育成胎兒和嬰兒的過程?;谧鹬厝祟愖饑赖膫惱韺W考慮,目前世界各國政府嚴禁生殖性克隆?!爸委熜钥寺 保汗惨话俣唔摽寺?kèlónɡ)人類?將普通的體細胞(男性或女性來源均可)和一枚女性卵子結合起來(儲存于女性卵子中的遺傳信息將事先被消除)。通過細胞分裂形成的胚胎應只帶有這名供體的全部遺傳信息,最后將胚胎移植到女性子宮中,將獲得該供體人類的克隆(kèlónɡ)后代。102共一百二十七頁社會、倫理(lúnlǐ)問題他(她)是正常人嗎?該如何(rúhé)看待他(她)?他(她)的父母是誰?誰生育了他(她)?誰愛他(她)?有可能產(chǎn)生真正相同的克隆的孿生子嗎?103Whoami?不管克隆技術怎樣發(fā)展,克隆人怎樣產(chǎn)生,都是人,與被克隆人實質上是存在著年齡差的同胞胎。但就是這一點讓人們覺得很難應對克隆人出現(xiàn)的倫理關系。這個孩子就是人類的試驗品,這位代孕的母體起到的也僅僅是一個生育機或孵化器的作用。共一百二十七頁英雄、偉人能夠克隆嗎?身體上任何一部分的細胞是否(shìfǒu)都可以用來克???人可以無休止地被克隆嗎?任何克隆動物都有基因上的缺陷。克隆羊和克隆牛都有體形過度龐大的問題。該缺陷在克隆鼠身上也存在??寺∨?、羊、豬都存在發(fā)育不良、免疫系統(tǒng)缺陷和心肺功能不健全的問題。那么,克隆人呢?104共一百二十七頁克隆人是否是人類文明的倒退?(有性生殖(yǒuxìngshēngzhí),無性生殖——克隆)105共一百二十七頁106
1998年1月,歐洲19個國家在法國巴黎簽署了一項有關嚴格禁止克隆人的協(xié)議。這是國際上第一個禁止克隆人的文件。它禁止各簽約國的研究機構或個人使用任何技術創(chuàng)造與一個活人或死人基因相似的人,否則將重罰。美國(měiɡuó):2001年7月31日,美國國會眾議院通過了一項全面禁止克隆人的法案。美國總統(tǒng)布什表示“百分之百”反對克隆人的研究,并已多次敦促參議院通過禁止克隆人的法案。英國:1990年通過的《人類授精和胚胎學法案》,認為克隆人類胚胎的研究是非法的。2001年11月22日英國政府公布一項新法案,明確禁止通過克隆技術復制人類個體,即“繁殖性克隆”,成為世界上第一個立法反對生殖性克隆的國家。德國:1991年德國實行《胚胎保護法》,嚴格禁止人類胚胎干細胞研究以及克隆胚胎干細胞。2000年11月,德國衛(wèi)生部提出一項新的《生殖醫(yī)學法》草案,再次強調在德國不允許進行胚胎干細胞的培育研究。意大利:2001年3月,意大利眾議院批準了政府于1998年簽署加入歐洲禁止克隆人協(xié)議。日本:2000年4月14日,日本內閣會議通過關于《限制對人的克隆技術的法律草案》,禁止克隆人,違者最高將被判處5年徒刑。世界一些(yīxiē)國家對克隆人研究的態(tài)度:共一百二十七頁從需要救治的病人身上提取體細胞將該細胞(xìbāo)的遺傳物質置入一個去除了細胞(xìbāo)核的卵細胞(xìbāo)該卵細胞開始自行分裂,直至形成一個早期胚胎從這早期胚胎中提取胚胎干細胞胚胎干細胞經(jīng)過相應的技術處理,便可發(fā)展成遺傳特征與病人完全吻合的細胞、組織或器官107以前器官移植治療方法中經(jīng)常出現(xiàn)的排異反應問題因此得到了徹底解決血細胞、腦細胞、骨骼和內臟等都將可以更換癌癥、白血病、帕金森氏癥、心臟病等頑疾也有望得到有效的治療與治愈由于(yóuyú)從早期人類胚胎中提取的干細胞擁有形成所有的人體細胞類型的能力,因而它也就有可能成為21世紀最重要、最理想的人體器官替代物的原料。6治療性克隆共一百二十七頁治療(zhìliáo)性克?。双F混合胚胎中國最早進行人獸混合胚胎實驗(shíyàn),現(xiàn)已中斷/tech/2007-09/27/content_6801227.htm英國批準人獸雜交胚胎研究/article/2007/0907/A20070907814001.shtml108人卵子的來源有限,無法大規(guī)模進行。為此科學家們就考慮把人的體細胞移植到去核的動物卵母細胞中,讓其發(fā)育成為一個混合的異種克隆胚胎進行胚胎干細胞研究,進行“胞質雜交”,獲得完全具有人類性狀的干細胞胚胎。由此培養(yǎng)出的胚胎干細胞可能幫助找到某些疾病的源頭,如與脊髓有關的肌肉萎縮、帕金森氏癥或阿爾茨海默氏癥等。進行人獸混合胚胎研究的目的主要是用于治療性克隆研究。通過培育人獸混合胚胎,可以得到大量的干細胞。而干細胞可以分化成人體的各種組織和器官,在器官移植和探尋像帕金森氏癥、糖尿病等疾病的病因方面都有著廣闊的應用前景。共一百二十七頁3.6干細胞109共一百二十七頁3.6.1定義(dìngyì)干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。or具有多項分化潛能和自我復制、更新能力的原始未分化細胞,是形成各種(ɡèzhǒnɡ)組織器官的祖宗細胞。110共一百二十七頁111來源(láiyuán)胚胎干細胞(embryonicstemcells,ESC):指處于胚胎早期的干細胞。分化潛能寬,具有分化為機體任何(rènhé)組織細胞的能力,如囊胚期(受精后5~7天)內細胞團的細胞、原始生殖細胞3.6.2干細胞的分類成體干細胞(adultstemcell,ASC):具有自我更新能力,但分化潛能窄,只能分化為相應(或相鄰)組織器官組成的細胞,如:骨髓、大腦、神經(jīng)、皮膚、胰腺、角膜、脂肪、心臟、肝臟等組織源干細胞共一百二十七頁112分化(fēnhuà)潛能單能/專能/偏能/定向干細胞:只能向一種類型(lèixíng)或密切相關的兩種類型(lèixíng)的細胞分化。如上皮組織基底層的干細胞、肌肉中的成肌細胞(衛(wèi)星細胞)。全能干細胞:具有形成完整個體的分化潛能。如:受精卵、8個細胞期以前的卵裂球以及胚胎干細胞(后者尚有爭議)多能干細胞(pluripotentstemcells):具有分化出多種細胞組織的潛能,但失去了發(fā)育成完整個體的能力,發(fā)育潛能受到一定限制。如骨髓多能造血干細胞,它可分化出至少十二種血細胞,但不能分化出造血系統(tǒng)以外的其它細胞。共一百二十七頁3.6.3干細胞的生物學特點(tèdiǎn)具有自我(zìwǒ)更新能力和不同程度的多向分化潛能終生保持未分化或低分化特征,缺乏分化標記能無限地分裂、增殖,可連續(xù)分裂幾代,也可在較長時間內保持靜止狀態(tài)113共一百二十七頁干細胞有對稱(duìchèn)與不對稱兩種分裂方式不對稱分裂的結果使兩個子細胞一個成為功能專一的分化(fēnhuà)細胞;另一個保持干細胞的特征。114對稱分裂:干細胞
分裂干細胞干細胞對稱分裂:干細胞
分裂分化細胞分化細胞不對稱分裂:干細胞
干細胞分化細胞分裂共一百二十七頁3.6.4胚胎(pēitāi)干細胞ES細胞:由早期胚胎(pēitāi)(囊胚期/胚泡期)或原始性腺中分離出來的一類
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 2024版二手房交易貸款合同范文
- 2025年度地質勘探儀器采購及技術服務合同模板3篇
- 2024年高層住宅裝修協(xié)議
- 福建省南平市武夷山上梅中學2020年高一物理上學期期末試題含解析
- 福建省南平市王臺中學高二物理測試題含解析
- 2024年版跨國技術交易協(xié)議詳則版
- 2024氧氣、乙炔能源項目投資與市場拓展合同3篇
- 2024汽車修理配件采購流程優(yōu)化合同
- 3-2《哦香雪》(說課稿)高一語文同步高效課堂(統(tǒng)編版 必修上冊)
- 外墻保溫材料采購合同(2篇)
- 臨床療效總評量表(CGI)
- 從教走向學:在課堂上落實核心素養(yǎng)
- 美世國際職位評估體系IPE3.0使用手冊
- 2020電網(wǎng)檢修工程預算定額第五冊 通信工程
- 圖像超分辨率增強技術
- 集裝箱貨運碼頭的火災防范措施
- DB15T+3199-2023公路工程水泥混凝土質量聲波層析成像法檢測規(guī)程
- 高壓電纜試驗報告
- 七年級數(shù)學上冊專題1.14數(shù)軸與絕對值綜合問題大題專練(重難點培優(yōu))-【講練課堂】2022-2023學年七年級數(shù)學上冊尖子生同步培優(yōu)題典(原卷版)【人教版】
- 酸性氨基酸對caco
- 藝術導論PPT完整全套教學課件
評論
0/150
提交評論