蛋白質(zhì)與核酸相互作用的試驗(yàn)方法學(xué)研究ppt課件

1、.,1,DNA-蛋白質(zhì)相互作用研究實(shí)驗(yàn),.,2,引言,1.很多細(xì)胞的生命活動(dòng)涉及到特定的DNA區(qū)段與特殊蛋白質(zhì) 結(jié)合因子之間的相互作用： DNA的復(fù)制和重組； mRNA的轉(zhuǎn)錄和修飾； 病毒的感染與增殖等 2.隨著人類基因組測(cè)序工作的基本完成， 功能基因組學(xué)的研究顯得尤為重要。而基因表達(dá)調(diào)控是 功能基因組學(xué)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。而要深入研究基因表 達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制必須要研究DNA與蛋白質(zhì)的相互作用。 3.在重組DNA技術(shù)發(fā)展以來(lái)，已相繼分離到大量的具有重要生 物學(xué)意義的基因。在這種情況下科學(xué)工作者開始把自己的研 究興趣逐漸轉(zhuǎn)向DNA結(jié)合蛋白這一課題上。,.,3,凝膠阻滯試驗(yàn) DNaseI足跡試驗(yàn)

2、甲基化干擾試驗(yàn) 體內(nèi)足跡試驗(yàn) 酵母單雜交技術(shù) 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù) 噬菌體展示技術(shù) 核酸適體技術(shù) 生物信息學(xué)方法 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)及納米技術(shù),.,4,一、凝膠阻滯試驗(yàn)（DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)DNA mobility shift assay）,1 原理： 在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，裸露的DNA朝正電 極移動(dòng)的距離與其分子量的對(duì)數(shù)成反比。 如果此時(shí)DNA分子與某種蛋白質(zhì)結(jié)合， 由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯 在特定電壓和時(shí)間內(nèi)朝正電極移動(dòng)的距離也就相應(yīng)縮短了。,.,5,2 主要步驟及內(nèi)容： 制備探針DNA （P32放射性同位素標(biāo)記DNA） 同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物一道溫育，形成DNA-蛋

3、白質(zhì)復(fù)合物。 將它加樣到非變性的聚丙烯酰胺凝膠中，進(jìn)行電泳分離。 應(yīng)用放射自顯影技術(shù)顯現(xiàn)具放射性標(biāo)記的DNA條帶位置,不存在與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)時(shí) 存在與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)時(shí),.,6,凝膠阻滯試驗(yàn)不僅可以用來(lái)鑒定在特殊類型細(xì)胞的提取物中，是否存在著能夠同某一特定DNA片段結(jié)合的蛋白質(zhì)分子(比如特異的轉(zhuǎn)錄因子等)，而且還可以用來(lái)研究發(fā)生此種結(jié)合作用之精確的DNA序列的特異性,超量的非標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)DNA (competitor DNA ）,.,7,.,8,材料及試劑： 2X結(jié)合緩沖液： 20 mM Tris pH 7.5 、100 mM NaCl、2 mM EDTA、10% 甘油、 poly(dI-

4、dC) (5 mg/ml in TE)、 BSA (10 mg/ml)、 P32-標(biāo)記探針 緩沖液C： 20 mM HEPES pH 7.9、25% glycerol、420 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、 0.5 mM 二硫蘇糖醇、0.5 mM 苯甲基磺酰氟化物、0.2 mM EDTA 4%天然的聚丙烯酰胺凝膠(50 ml)：5 ml 40% 丙烯酰胺 (30:1)、2.5 ml 5X 四溴乙烷， 41.95 ml H20、0.5 ml 10% APS（過(guò)硫酸銨）、50 ml 四甲基乙二胺、0.25X 四溴 烷電泳緩沖夜。 填充染料： 0.2% 溴酚藍(lán)、0.2%二甲本藍(lán)、50%

5、甘油 操作步驟： 1.配置反應(yīng)混合液：探針DNA (1 ng/ml) 0.1ml、 dH20 6.3 ml、2x 結(jié)合緩沖液 12.5 ml、BSA (10 mg/ml) 1.0 ml 、 poly(dI-dC) (5 mg/ml) 0.1ml、 2.在細(xì)胞提取物中加入緩沖液C至5 ml。 3.加1015 mg上述溶液（ 5 ml)到反應(yīng)混合物中，總體積應(yīng)不大于25 ml。 4.在室溫下培養(yǎng)20min。 5.加入2.5 ml的填充染料。 6.裝載樣品到4%的聚丙烯酰胺凝膠柱中。 7.室溫下跑電泳2.5h，至溴酚藍(lán)距底部1cm處停止。 8.80下干燥凝膠，進(jìn)行放射自顯影處理。,.,9,二、DNa

6、seI足跡試驗(yàn)(DNaseI footprinting assay),DNaseI足跡試驗(yàn)是一種測(cè)定DNA結(jié)合蛋白在DNA上的準(zhǔn)確 結(jié)合位點(diǎn)的技術(shù)。 首先是單鏈標(biāo)記， 然后用DNaseI水解單鏈標(biāo)記的雙鏈DNA， 產(chǎn)生“DNaseI保護(hù)”， 尿素變性， PAGE分離及放射性顯影， 形成以相差一個(gè)核苷酸為梯度的一系列DNA條帶， 在此顯影圖中相應(yīng)于DNA結(jié)合蛋白的位置上由于DNA結(jié) 合蛋白的保護(hù)作用而形成了空白區(qū)域。,.,10,如果在電泳時(shí)結(jié)合DNA化學(xué)測(cè)序，則可準(zhǔn)確判斷出結(jié)合區(qū) 的精確序列。,.,11,三、甲基化干擾試驗(yàn),根據(jù)DMS （二甲基亞藍(lán)）能使G殘基甲基化， 而六氫吡啶又能夠特異切割甲

7、基化的G殘基這一原理而設(shè)計(jì),先用DMS處理DNA； （并控制反應(yīng)條件，使之達(dá)到平均每條DNA分子只有一個(gè)殘基被甲基化） 將這些局部甲基化的DNA群體同含有DNA結(jié)合蛋白的適當(dāng)細(xì)胞提取物 一道溫育； 并做凝膠阻滯試驗(yàn)。 經(jīng)電泳分離后， 從凝膠中切除具有結(jié)合蛋白的DNA條帶和沒(méi)有結(jié)合蛋白的DNA條帶， 并用六氫吡啶處理之。,.,12,檢測(cè)靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對(duì)而后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用會(huì)有什么效應(yīng)，從而更加詳細(xì)地揭示DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用模式。 DMS化學(xué)干擾只能在G和A殘基甲基化，不能使T和C甲基化。 故本實(shí)驗(yàn)為足跡實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充手段。,.,13,四、酵母單雜交技術(shù),真核生物中 ，轉(zhuǎn)錄因

8、子中DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain BD)與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域( activationdomain AD) 能夠相互獨(dú)立發(fā)生作用。 酵母中的轉(zhuǎn)錄因子GAL4 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為文庫(kù)蛋白編碼基因，只要其表達(dá)的蛋白能與目的基因相互作用同樣可通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶啟動(dòng)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄 。,.,14,設(shè)計(jì)含目的基因(稱為誘餌)和下游報(bào)告基因的質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)入酵母中; 將文庫(kù)蛋白的編碼基因片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入同一酵母中; 若文庫(kù)蛋白與目的基因相互作用可通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)將文庫(kù)蛋白的編碼基因篩選出來(lái). 注：這里作為誘餌的目的基因就

9、是啟動(dòng)子DNA 片段，文庫(kù)基因所編碼的蛋白就是啟動(dòng)子基因結(jié)合蛋白. 酵母單雜交技術(shù)廣泛用DNA與蛋白相互作用的研究。,.,15,不足以充分反映生理?xiàng)l件下，DNA與蛋白質(zhì)相互作用的真實(shí)情況。 因?yàn)?，高等生物的基因組有染色質(zhì)結(jié)構(gòu)， 用以上所提到的方法分析得到的某段DNA與蛋白質(zhì)，在生理狀態(tài)下， 這段DNA很可能并不與其相對(duì)應(yīng)的因子相結(jié)合。 另外，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)本身是動(dòng)態(tài)的，DNA與非組蛋白在生理狀態(tài)下的相互作用通常是瞬時(shí)的， 以上方法難以捕捉到發(fā)生在染色質(zhì)上的基因表達(dá)調(diào)控的瞬時(shí)事件,以上技術(shù)都有一定的局限性,.,16,八、染色體免疫沉淀技術(shù)Chromatin immunoprecipitation （

10、ChIp）,1.技術(shù)介紹 在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，超聲波將染色質(zhì)打碎后，用所要研究的目的蛋白特異性的抗體沉淀這種交聯(lián)復(fù)合體。只有與目的蛋白結(jié)合的DNA片段才能夠被沉淀下來(lái),.,17,2、主要步驟及內(nèi)容,細(xì)胞的甲醛固定 超聲波斷裂染色質(zhì) 氯化銫等密度離心純化交聯(lián)的染色質(zhì) 染色質(zhì)免疫沉淀和免疫沉淀復(fù)合體的純化 交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化 染色質(zhì)免疫沉淀的DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點(diǎn)的鑒定 目的蛋白和DNA靶序列特異結(jié)合的進(jìn)一步驗(yàn)證,.,18,1.細(xì)胞的甲醛固定 在1%甲醛的作用下，DNA堿基上的氨基或亞氨基和蛋白質(zhì)上的氨基包括賴氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸的側(cè)鏈

11、氨基與另外的DNA和蛋白質(zhì)上的氨基或亞氨基交聯(lián)在一起，在幾分鐘內(nèi)形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。 加入甘氨酸來(lái)終止交聯(lián)反應(yīng)。,.,19,2.超聲波斷裂染色質(zhì) 甲醛交聯(lián)后的染色質(zhì)對(duì)限制酶和DnaseI高度抵抗， 因此通常使用超聲波使得染色質(zhì)斷裂。 打斷后的染色質(zhì)片段的平均長(zhǎng)度應(yīng)該在500-1000bp左右。 （可以用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定）,.,20,3.氯化銫等密度離心純化交聯(lián)的染色質(zhì) 氯化銫等密度離心可以除去未交聯(lián)的蛋白質(zhì)、 DNA和RNA樣品中加入0.5%的十二烷基肌氨酸鈉， 通常在4000rpm離心72h。 離心后，用連接到蠕動(dòng)泵的0.25mm毛細(xì)管從梯度的底部分步收集染色質(zhì)組分

12、，在4透析過(guò)夜。,.,21,4.染色質(zhì)免疫沉淀和免疫沉淀復(fù)合體的純化 用目的蛋白特異性的抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀。 抗體的量要進(jìn)行優(yōu)化防止非特異的結(jié)合。 用ProteinA/G-Agarose/Sepharose回收免疫沉淀復(fù)合體。 經(jīng)過(guò)洗滌除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后， 用1%SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合體。,.,22,5.交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化 在免疫沉淀復(fù)合體中加入不含Dnase的Rnase，proteinase K。 65保溫6h使交聯(lián)逆轉(zhuǎn)。 經(jīng)酚氯仿抽提-乙醇沉淀純化DNA。 純化的DNA極少，可用色譜定量。,.,23,6.染色質(zhì)免疫沉淀的DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA 上結(jié)合

13、位點(diǎn)的鑒定 染色質(zhì)免疫沉淀的DNA的分析方法有許多種。 如果目的蛋白的靶序列是已知的或者懷疑某個(gè)序列 是目的蛋白的靶序列，可以采用狹縫雜交和PCR分析; 如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋 白在基因組上的分布情況,找出反式作用因子的結(jié)合位 點(diǎn),可以采用Southern雜交、ChIP克隆和DNA芯片方法。,.,24,7.目的蛋白和DNA靶序列特異結(jié)合的進(jìn)一步驗(yàn)證 染色質(zhì)免疫沉淀分析得到的結(jié)果有很大一部分是假陽(yáng)性，需要采用其他方法驗(yàn)證結(jié)果的真實(shí)性。 用PCR方法進(jìn)行獨(dú)立的ChIP分析、電泳遷移率變動(dòng)分析、酵母單雜交系統(tǒng)及熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)最終確定目的蛋白與靶DNA序列的特異性結(jié)合。,.,25,近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基因芯片（chip）染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù) 相結(jié)合(chip-ChIP)的方法 要一個(gè)PCR步驟來(lái)擴(kuò)增染色質(zhì)免疫沉淀富集的DNA。 特異性染色質(zhì)免疫沉淀的DNA和對(duì)照DNA的PCR產(chǎn)物 分別用Cy5和Cy3熒光光標(biāo)記， 用于與含有整個(gè)基因組的DNA芯片進(jìn)行雜交 。 通過(guò)