致突變作用食品毒理學(xué)

1、第八章 致突變作用,一、基本概念 二、突變類型 三、突變的發(fā)生與修復(fù)機(jī)制 四、致突變?cè)囼?yàn)與致突變作用評(píng)定,一、基本概念,突變(mutation) 遺傳結(jié)構(gòu)本身的變化及其引起的變異稱為突變，突變實(shí)際上是遺傳物質(zhì)的一種可遺傳的變異。 突變發(fā)生原因分為： 1、自發(fā)突變(spontaneous mutation)：由于自然界中誘變劑的作用或由于偶然的自制、 轉(zhuǎn)錄、修復(fù)時(shí)的堿基配對(duì)錯(cuò)誤所產(chǎn)生的突變。 2、誘發(fā)突變(induced mutation)：誘變劑誘發(fā)的突變。,二、化學(xué)毒物致突變的類型,（一）基因突變(gene mutation) 1堿基置換(basepair substitution) 指某一

2、堿基配對(duì)性能改變或脫落所致的突變。 轉(zhuǎn)換(transition) 顛換(transvertion) 2移碼突變 (frameshift mutation) 指發(fā)生一對(duì)或幾對(duì)（三對(duì)除外）的堿基減少或增加，以致從受損點(diǎn)開始?jí)A基序列完全改變，形成錯(cuò)誤的密碼，并轉(zhuǎn)譯成為不正常的氨基酸。 3、大段損傷 是DNA鏈缺失或插入，這種損傷有時(shí)可跨越兩個(gè)甚至數(shù)個(gè)基因。,二、化學(xué)毒物致突變的類型,（二）染色體畸變(chromosome aberration) 1、 指染色體的結(jié)構(gòu)改變 染色單體型畸變(chromatid-type aberration) 染色體型畸變(chromosome aberration),

3、2、染色體數(shù)目異常,體細(xì)胞二倍體（2n）；生殖細(xì)胞單倍體。正常體細(xì)胞染色體數(shù)目2n為標(biāo)準(zhǔn)，分整倍性畸變和非整倍性畸變。整倍性畸變指染色體數(shù)目的異常是以染色體組為單位的增減，非整倍性畸變系指比二倍體多或少一條或多條染色體。,(1) 非整倍體 非整倍體(aneuploid)指細(xì)胞丟失或增加一條或幾條染色體。缺失一條染色體時(shí)稱為單體(monosome)，增加一條染色體時(shí)稱為三體(trisome)。染色體數(shù)目的改變會(huì)導(dǎo)致基因平衡的失調(diào)，可能影響細(xì)胞的生存或造成形態(tài)及功能上的異常。如21三體導(dǎo)致先天愚型(Down氏綜合征)。 （2）整倍體 整倍體(euploid)指染色體數(shù)目的異常是以染色體組為單位的增

4、減，如形成三倍體(triploid)、四倍體(tetroploid)等。在人體，3n為69條染色體，4n為92條染色體。在腫瘤細(xì)胞及人類自然流產(chǎn)的胎兒細(xì)胞中可有三倍體細(xì)胞的存在。發(fā)生于生殖細(xì)胞的整倍體改變，幾乎都是致死性的。,三、化學(xué)毒物致突變作用機(jī)制及后果,（一）化學(xué)毒物致突變作用機(jī)制 1、 直接以DNA為靶的誘變 DNA加合物形成 堿基類似物取代：如 5溴脫氧尿嘧啶核苷能取代胸腺嘧啶，2氨基嘌呤(2-AP）能取代鳥嘌呤 烷化劑的影響：甲基化乙基化高碳烷基化 致突變物改變或破壞堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu) 化學(xué)物破壞或改變堿基的結(jié)構(gòu)， 有時(shí)還引起鏈斷裂。 平面大分子嵌入DNA鏈 DNA蛋白質(zhì)交聯(lián)物 二聚體

5、的形成,(二)、不以DNA 為靶的間接誘變（紡錘體抑制、對(duì)酶促過(guò)程的作用） 化學(xué)物的間接誘變可能是通過(guò)對(duì)紡錘體作用或干擾與DNA合成和修復(fù)有關(guān)的酶系統(tǒng)。 1、 紡錘體抑制：一些化學(xué)物能作用于紡錘體，中心?；蚱渌藘?nèi)細(xì)胞 器，從而干擾有絲分裂過(guò)程。誘發(fā)這種作用的物質(zhì)稱為有絲分裂毒物，又稱干擾劑。 2、 對(duì)酶促過(guò)程的作用： 對(duì)DNA合成和復(fù)制有關(guān)的酶系統(tǒng)作用也可間 接影響遺傳物質(zhì)。,(二)突變后果 1、體細(xì)胞突變的后果 、最受注意的是致癌問題； 、胚胎體細(xì)胞突變可能導(dǎo)致畸胎； 、致突變物透過(guò)胎盤作用于胚胎體細(xì)胞導(dǎo)致流產(chǎn)。 2、生殖細(xì)胞突變的后果 、致死性影響：可能是顯性致死或隱性致死。、非致死性影

6、響：出現(xiàn)顯性或隱性遺傳性疾?。ê忍煨曰危?。 、將使基因庫(kù)的遺傳負(fù)荷增加。 （三）突變的修復(fù)機(jī)制 修復(fù)(repairing) ：是對(duì)已發(fā)生分子改變的補(bǔ)償措施，使其回復(fù)為原有的天然狀態(tài)。 修復(fù)的主要類型： 1 光修復(fù) 2 切除修復(fù) 3重組修復(fù) 4 SOS修復(fù),四、致突變?cè)囼?yàn)方法,（一）回復(fù)突變?cè)囼?yàn) 1 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn) (1) 細(xì)菌回復(fù)突變 假如有致突變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能在營(yíng)養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成菌落，根據(jù)此判斷受試物是否致突變物。如鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。 （2）真核微生物回復(fù)突變?cè)囼?yàn) 真核微生物可以檢測(cè)基因突變和染色體損傷。常用的釀造酵母菌株有

7、：D3,D4,D7等。,2、哺乳動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn),試驗(yàn)原理 在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使細(xì)胞暴露于受試物一定時(shí)間，然后將細(xì)胞再傳代培養(yǎng)，突變細(xì)胞在含有6-硫代鳥嘌呤（6-thioguanine，6-TG）或三氟胸苷（trifluorothymidine，TFT）的選擇性培養(yǎng)液中能繼續(xù)分裂并形成集落?；谕蛔兗鋽?shù)，計(jì)算突變頻率以評(píng)價(jià)受試物的致突變性。,3、果蠅伴性隱性致死試驗(yàn),果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)：是利用隱性基因在伴性遺傳中的交叉特征檢出各類點(diǎn)突變的試驗(yàn)。 試驗(yàn)原理：隱性基因在伴性遺傳中的交叉遺傳特征，即雄蠅的X染色體傳給F1代雌蠅，又通過(guò)F1代傳給F2代雄蠅。X染色的隱性突

8、變基因在F1代雌蠅為雜合體，不能表達(dá)，而在F2代雄蠅為半合體，能表達(dá)出來(lái)。如果雄蠅接著受試物后X染色體出現(xiàn)隱性致死性突變，結(jié)果其F2代雄蠅數(shù)目較少雌蠅少一半。據(jù)此推斷致死突變的存在。,4、染色體分析,（1）染色體畸變分析（chromosome assy) 主要觀察染色體的結(jié)構(gòu)畸變和數(shù)目畸變 （2) 微核試驗(yàn)(micronucleus test, MNT) 能檢察出斷裂劑和有絲分裂毒物 （3）姐妹染色體交換試驗(yàn)（sister chromatid exchange assay, SCE) 現(xiàn)在以廣泛用于篩選食品中化學(xué)物致突變。,5、顯性致死試驗(yàn) 顯性致死試驗(yàn)：使雄性大鼠或小鼠接著受試物，然后使之與

9、未接著該物質(zhì)的雌性大鼠或小鼠交配，觀察胚胎死亡情況。 6、小鼠可遺傳易位試驗(yàn) 用于檢測(cè)受試物引起雄性小鼠生殖細(xì)胞染色體相互易位的作用。 7、細(xì)菌DNA修復(fù)試驗(yàn) 本試驗(yàn)對(duì)檢測(cè)能與DNA形成加合物或嵌入作用的化學(xué)物較為敏感；對(duì)于阻滯DNA促旋酶（gyrase);誘發(fā)DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)、堿基置換和移碼的化學(xué)物也可出。,8、非程序性DNA合成試驗(yàn)（USD試驗(yàn)） 原理正常情況下，于細(xì)胞有絲分裂周期中，僅S期是DNA合成期。當(dāng)DNA受損傷時(shí)，損傷修復(fù)的DNA合成主要在其他細(xì)胞周期，稱程序外DNA合成，即UDS，因此發(fā)現(xiàn)UDS增高，即表明DNA發(fā)生過(guò)損傷。 9、精子畸形試驗(yàn) 原理：已知精子畸形是決定精子形成

10、的基因發(fā)生突變的結(jié)果。常染色體和Y-性連鎖基因突變及某些染色體重排，如性-常染色體易位，也可使精子發(fā)生畸形。小鼠精子畸形試驗(yàn)?zāi)茉u(píng)價(jià)受試物對(duì)精子生成、發(fā)育的影響，可檢測(cè)受試物在體內(nèi)對(duì)生殖細(xì)胞的遺傳毒性作用。,10、小鼠特異基因座試驗(yàn),特異基因座試驗(yàn)(SLT)是利用兩種品系的小鼠，一種為T型，其有幾個(gè)與毛色、眼色和耳型有關(guān)的隱性突變基因的純合子；另一種為3H1或C57BL系，不具有這些基因的野生型，使后一種小鼠接觸受試物，使之與T系交配。如果受試物未能使相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生突變，則雜交一代為雜合子，T系的隱性基因不能表達(dá)，如果發(fā)生了突變，則相應(yīng)的隱性基因可于出生時(shí)或斷乳時(shí)表達(dá)。,五、致突變作用評(píng)價(jià),美國(guó)E

11、PA毒物處(1936)提出了一個(gè)三階段的試驗(yàn)方案，把遺傳毒性檢測(cè)和生殖細(xì)胞致突變性驗(yàn)證分階段進(jìn)行。 第一階段測(cè)試化學(xué)物的遺傳毒性，包括Ames試驗(yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)、體內(nèi)骨髓染色體損傷試驗(yàn)(微核試驗(yàn)或染色體畸變?cè)囼?yàn))； 第二階段測(cè)試對(duì)生殖細(xì)胞的致突變作用； 第三階段為哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞致突變性標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)。 在遺傳危害性評(píng)價(jià)時(shí)，在體外基因突變?cè)囼?yàn)中呈陽(yáng)性的化學(xué)物應(yīng)進(jìn)行與哺乳類性腺DNA相互作用的試驗(yàn)，包括睪丸細(xì)胞的SCE、UDS、染色體畸變及堿性洗脫試驗(yàn)等，也可進(jìn)行顯性致死試驗(yàn)，在第二階段中出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，需進(jìn)行小鼠特異座位試驗(yàn)，可觀察形態(tài)改變或生化改變；在體內(nèi)骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)或微核

12、試驗(yàn)中呈陽(yáng)性的化學(xué)物需進(jìn)行顯性致死試驗(yàn)，在第二階段中出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，再進(jìn)行小鼠可遺傳易位試驗(yàn)。,五、致突變作用評(píng)價(jià),國(guó)際協(xié)調(diào)組織(1CH)(1997)對(duì)于藥品的遺傳毒性評(píng)價(jià)建議的檢測(cè)試驗(yàn)組合為 細(xì)菌基因突變?cè)囼?yàn)； 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)或體外小鼠淋巴瘤細(xì)胞比試驗(yàn)； 體內(nèi)嚙齒類造血細(xì)胞染色體損傷試驗(yàn)(骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)或骨髓或外周血多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn))。 在對(duì)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合得到的致突變作用結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步研究時(shí)，其他試驗(yàn)如DNA加合物測(cè)定、DNA鏈斷裂檢測(cè)、DNA修復(fù)和重組試驗(yàn)等都可作為供選擇的試驗(yàn)。對(duì)于在三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)中為陰性的化學(xué)物，通?？烧J(rèn)為其無(wú)遺傳毒性作用。但對(duì)于構(gòu)效關(guān)系顯示有可能

13、具致癌性或致突變性，但在三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)中為陰性的化學(xué)物，還需要改進(jìn)試驗(yàn)方法或再增加試驗(yàn)項(xiàng)目。對(duì)于在三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)中為陰性，但致癌試驗(yàn)顯示有致癌效應(yīng)，又無(wú)明確的證據(jù)說(shuō)明該化學(xué)物是通過(guò)非遺傳毒性機(jī)制發(fā)揮作用時(shí)，為了了解其作用方式，可再進(jìn)行改變代謝活化系統(tǒng)的體外試驗(yàn)或應(yīng)用腫瘤發(fā)生的靶器官進(jìn)行遺傳損傷試驗(yàn)(如肝臟UDS試驗(yàn)、DNA加合物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因突變檢測(cè)、腫瘤相關(guān)基因的遺傳改變檢測(cè))。,五、致突變作用評(píng)價(jià),我國(guó)衛(wèi)生部在食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序(1994)中對(duì)遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)的要求是： 根據(jù)受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及對(duì)遺傳物質(zhì)作用終點(diǎn)的不同，并兼顧體外和體內(nèi)試驗(yàn) 以及體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的原則，在Ames路試驗(yàn)、小鼠骨髓微核試驗(yàn)或骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)和睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn)中選擇四項(xiàng)，如其中一項(xiàng)試驗(yàn)為陽(yáng)性，還應(yīng)在其他備選試驗(yàn)(V7