《菌種的保藏》PPT課件.ppt

1、菌種的保藏,組長：葉慧沁 組員：許重望、葉小冬 葉智瓊、葉妍悅,菌種保藏的意義,菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗(yàn)及藥品微生物檢驗(yàn)等都有一套完整的菌種.微生物具有生命活力，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此菌種保藏是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作，是微生物學(xué)基礎(chǔ)工作的一項(xiàng)重要內(nèi)容，也是藥品微生物工作中的一項(xiàng)常用技術(shù)。,概念,標(biāo)準(zhǔn)菌株：由國內(nèi)或國際菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌株。 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：由標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物。 商業(yè)派生菌株：由供應(yīng)商提供的所有特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效的菌株。 工作菌

2、株：由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株經(jīng)傳代得到的培養(yǎng)物。,中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株,法國生物梅里埃公司提供的商業(yè)派生菌株,保藏的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株,制備的工作菌株,菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。 菌種衰退不是突然發(fā)生的，而是從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。開始時(shí)，在群體細(xì)胞中僅有個(gè)別細(xì)胞發(fā)生自發(fā)突變（一般均為負(fù)變），不會(huì)使群體菌株性能發(fā)生改變。經(jīng)過連續(xù)傳代，群體中的負(fù)變個(gè)體達(dá)到一定數(shù)量，發(fā)展成為優(yōu)勢群體，從而使整個(gè)群體表現(xiàn)為嚴(yán)重的衰退。,菌種衰退的原因,1、菌種衰退的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。 2、表型延遲現(xiàn)象也會(huì)造成菌種衰退

3、。 3、質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種衰退的情況在抗生素生產(chǎn)中較多，不少抗生素的合成是受質(zhì)粒控制的。 4、連續(xù)傳代是加速菌種衰退的一個(gè)重要原因。 5、不適宜的培養(yǎng)和保藏條件是加速菌種衰退的另一個(gè)重要原因。,如何預(yù)防衰退,1、合理的育種 2、選用合適的培養(yǎng)基 3、創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 4、控制傳代次數(shù) 5、利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行移種傳代 6、采用有效的菌種保藏方法,菌種的復(fù)壯,菌種的復(fù)壯（rejuvenation）：使衰退的菌種恢復(fù)原來優(yōu)良性狀。 狹義的復(fù)壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施； 廣義的復(fù)壯是指在菌種的生

4、產(chǎn)性能未衰退前就有意識的經(jīng)常、進(jìn)行純種的分離和生產(chǎn)性能測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種。,復(fù)壯的方法,1、純種分離。采用平板劃線分離法、稀釋平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細(xì)胞分離出來，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)恢復(fù)原菌株的典型優(yōu)良性狀，若能進(jìn)行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細(xì)胞或單孢子分離出來，經(jīng)培養(yǎng)恢復(fù)原菌株性狀。 2、通過寄主體內(nèi)生長進(jìn)行復(fù)壯（如Bacillus thuringiensis的復(fù)壯）。主要是對一些寄生性的菌株，可以將衰退的菌株接種到相應(yīng)的宿主體內(nèi)，提高其寄生性能及其它性能。 3、淘汰已衰退的個(gè)體（采用比較

5、激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個(gè)體）?？梢圆捎酶鞣N外界不良理化條件,使發(fā)生衰退的個(gè)體死亡,從而留下群體中生長健壯的個(gè)體.4、 4、采用有效的菌種保藏方法。,菌種保藏的基本原理,微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。 低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)的,選擇保藏方法時(shí)，首先應(yīng)考慮方法能否長期地 保持菌種原有的特性，同時(shí)也應(yīng)兼顧到方法的經(jīng)濟(jì) 和簡便。在實(shí)際工作中，往往多種條件同時(shí)使用, 以提高保藏效果。

6、（二）菌種保藏步驟 挑選特征典型的純菌菌落； 確定保藏的合適菌體形態(tài)； 選擇最適宜的保藏方法； 定期對保藏菌種進(jìn)行檢查，觀察是否發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時(shí)進(jìn)行移種。,1.瓊脂斜面低溫保存法,（1）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長保藏時(shí)間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4左右的冰箱中保藏。每隔 23個(gè)月移種一次，繼續(xù)進(jìn)行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年 一年。有的甚至更長時(shí)間。 （2）適用范圍：細(xì)菌、酵母菌

7、、霉菌保藏。,大腸桿菌斜面 金黃色葡萄球菌斜面,各類菌種保藏條件及時(shí)間,（3）特點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)是簡便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對大多數(shù)微生物都適用。 缺點(diǎn)是保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。,（4）注意事項(xiàng)： 保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。 保藏時(shí)，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動(dòng)或生霉，如有異常應(yīng)及時(shí)處理。 每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培養(yǎng)基特征和純度無誤后再繼續(xù)保藏。 保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無糖，其他菌類含糖小于 2 %為宜，以免產(chǎn)酸

8、過多，影響菌種存活。 銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。,2、液體石蠟保存法： 本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長菌種的保藏期。,（1）方法： 將菌種接種于斜面或穿刺于0.3 0.5 %瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。 取化學(xué)純的液體石蠟裝在試管中，每管1015ml，加棉塞，瓶口包上紙，121高壓滅菌30min，取出置37溫箱或 110 170 烤箱中 1 2 h 或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分。,將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端 1 為宜，將試管直立，放入4冰箱中保藏。 適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細(xì)菌保藏效果較差。,液體石蠟對各類菌種保藏效果,（3）特點(diǎn)： 本方法簡便易行，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種保藏方法， 該法主要使菌種與空氣隔絕。 （4）注意事項(xiàng)： 保藏時(shí)，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征 后，方可進(jìn)行保藏。 保藏過程中，需經(jīng)常觀察斜面是否干燥，如干燥， 需重新移種。 使用菌種時(shí)，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一 邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培 養(yǎng)，待長出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上 即可使用。,將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接