1基因工程的基本操作程序.ppt

1、基因工程的 基本操作程序,基因工程的基本操作程序,一、獲取目的基因,(一)、目的基因的概念及基因的結(jié)構(gòu) 1、目的基因主要是指_，,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,也可以是一些起調(diào)控作用的因子,2、原核細(xì)胞基因與真核細(xì)胞基因的比較,連續(xù),不連續(xù),非編碼區(qū),非編碼區(qū)和編碼區(qū)中的內(nèi)含子,編碼區(qū),編碼區(qū)中的外顯子,(二)、獲取目的基因的常用方法,1、從基因文庫中獲取目的基因,(1）、基因文庫概念：將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫,基因組文庫與部分基因文庫的比較,大,某種生物的全部基因,某種生物的部分基因,小,有,無,有,無,部分

2、基因可以,可以,（2）基因文庫的類型,（3）、從基因文庫中篩選目的基因應(yīng)考慮的因素：序列、功能、位置 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、表過產(chǎn)物等,基因組文庫包含著這種生物的所有基因，是用限制酶剪切然后連接上運(yùn)載體然后導(dǎo)入受體細(xì)胞得來的?；蚪M文庫中的所謂基因其實(shí)只能夠說是DNA片斷，這些片斷可能正好是一個(gè)完整的某基因，也有可能是某基因的一個(gè)部分，還有可能包含有幾個(gè)基因或他們的片斷等，在這里，只有那些包含完整基因的片斷才能夠用于基因交流。 另外還有一種理解是：內(nèi)含子、啟動(dòng)子、終止子等調(diào)控序列在另一種生物體內(nèi)可能不能正常表達(dá)。,基因組文庫中的基因只有部分基因能交流的原因,(1）、PCR的原理：DNA雙鏈復(fù)制,2、PCR

3、技術(shù)（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）,(2）、PCR過程,變性（90-95）：高溫使H鍵斷裂，形成單鏈DNA,（3)、特點(diǎn)：,指數(shù)式擴(kuò)增（約2n）,（4)、前提：,模板： 引物： 原料： 酶：,一段已知目的基因的核苷酸序列（以便根據(jù)已知序列合成引物）,目的基因,2條（人工合成，2條引物不一定互補(bǔ)）,dCTP、dGTP、dATP、dTTP,耐高溫DNA聚合酶（Taq酶）,PCR技術(shù)與生物體內(nèi)DNA復(fù)制的比較,高溫變性解旋,解旋酶催化,場所,體外,主要在細(xì)胞核內(nèi),酶,熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,解旋酶、DNA聚合酶,溫度條件,在較高溫度下進(jìn)行， 不同過程溫度不同,常溫,原理,DNA雙鏈復(fù)制,原料,四種游離的脫氧核苷酸

4、,條件,需模板、能量、酶等,用DNA合成儀合成,3、化學(xué)方法人工合成,適用于核苷酸序列已知且堿基數(shù)較少的基因,二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心： 1、目的。 使目的基因在_中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。 使目的基因能夠_和發(fā)揮作用。 2、組成：_+目的基因+_+標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因),受體細(xì)胞,表達(dá),啟動(dòng)子,終止子,3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程：,限制酶A識(shí)別：5- ATGATCAT 3- TACTAGTA ，切割位點(diǎn)是T與G之間； 限制酶B識(shí)別：5- CAGATCTG 3- GTCTAGAC ，切割位點(diǎn)是A與G之間 但是它們產(chǎn)生的粘性末端都是： GATC ,只能用同一種限制酶嗎？

5、,例1.(20分)(2014天津高考)嗜熱土壤芽孢桿菌產(chǎn)生的-葡萄糖苷酶(BglB)是一種耐熱纖維素酶。 （1）PCR擴(kuò)增bglB基因時(shí)，選用嗜熱土壤芽孢桿菌基因組DNA作 。 （2）、下圖為質(zhì)粒限制酶酶切圖譜。bglB基因不含圖中限制酶識(shí)別序列。為使PCR擴(kuò)增的bglB基因重組進(jìn)該質(zhì)粒，擴(kuò)增的bglB基因兩端需分別引入和不同限制酶的識(shí)別序列。,Nde,BamH,模板,例2.下圖是將某細(xì)菌的基因A導(dǎo)入大腸桿菌，制備“工程菌”的示意圖,據(jù)圖回答： (1)獲得A有兩條途徑：一是以A的mRNA為模板，在酶的催化下，合成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在 的作用下合成雙鏈DNA；二是根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的序列，推測出

6、相應(yīng)的mRNA序列，再按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測其DNA的序列，再通過化學(xué)方法合成所需基因。 (2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，需添加的有機(jī)物質(zhì)有4種脫氧核糖核苷酸耐熱性的 和、。 (3)由A和載體B拼接形成的C通常稱為。 (4)在基因工程中，常用Ca2+處理D，其目的是,逆轉(zhuǎn)錄,DNA聚合酶,氨基酸,脫氧核苷酸,引物,模板(A基因),基因表達(dá)載體,使其成為感受態(tài)細(xì)胞，有利于吸收重組DNA分子,DNA聚合酶,例3、以下實(shí)例為體外處理“蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體”獲得DNA片段信息的過程圖。,據(jù)圖回答： (1)過程酶作用的部位是，此過程只發(fā)生在非結(jié)合區(qū)DNA，過程酶作用的部位是。 (2)兩過程利用了酶

7、的特性。 (3)若將得到的DNA片段用于構(gòu)建重組質(zhì)粒，需要將過程的測序結(jié)果與酶的識(shí)別序列進(jìn)行比對(duì)，以確定選用何種酶。 (4)如果復(fù)合體中的蛋白質(zhì)為RNA聚合酶，則其識(shí)別、結(jié)合的DNA序列區(qū)為基因的。,磷酸二酯鍵,肽鍵,專一性,限制性核酸內(nèi)切,啟動(dòng)子(或轉(zhuǎn)錄起始區(qū)),(5)以下研究利用了生物分子間特異性結(jié)合性質(zhì)的有(多選) A.分離得到核糖體，用蛋白酶酶解后提取rRNA B.用無水乙醇處理菠菜葉片，提取葉綠體基粒膜上的光合色素 C.通過分子雜交手段，用熒光物質(zhì)標(biāo)記的目的基因進(jìn)行染色體基因定位 D.將抑制成熟基因?qū)敕?，其mRNA與催化成熟酶基因的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，終止后者翻譯，延遲果實(shí)成熟,A

8、、C、D,例4.(2014新課標(biāo)全國卷)植物甲具有極強(qiáng)的耐旱性，其耐旱性與某個(gè)基因有關(guān)，若從該植物中獲得該耐旱基因，并將其轉(zhuǎn)移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性?；卮鹣铝袉栴}： (1)理論上，基因組文庫含有生物的基因；而cDNA文庫含有生物的基因。 (2)若要從植物甲中獲得耐旱基因，可首先建立該植物的基因組文庫，再從中出所需的耐旱基因。,全部,部分,篩選,(4)將耐旱基因?qū)朕r(nóng)桿菌，并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入植物乙的體細(xì)胞中，經(jīng)過一系列的過程得到再生植株。要確認(rèn)該耐旱基因是否在再生植株中正確表達(dá)，應(yīng)檢測此再生植株中該基因的，如果檢測結(jié)果呈陽性，再在田間試驗(yàn)中檢測植株的是否得到提高,(

9、4)假如用得到的二倍體轉(zhuǎn)基因耐旱植株自交，子代中耐旱與不耐旱植株的數(shù)量比為31時(shí)，則可推測該耐旱基因整合到了 (填“同源染色體的一條上”或“同源染色體的兩條上”)。,(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,轉(zhuǎn)化:,方法,導(dǎo)入植物細(xì)胞,導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞,導(dǎo)入微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細(xì)胞法,目的基因進(jìn)入_ 內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法： （1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(適合雙子植物),（2）基因槍法,（3）花粉管通道法,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞-顯微注射法,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 （1）原核生物特點(diǎn)： 單細(xì)

10、胞、遺傳物質(zhì)少、繁殖快 （2）方法步驟：,用Ca2+處理細(xì)胞得到感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,四.目的基因的檢測與鑒定：,目的基因,mRNA,蛋白質(zhì),1、利用標(biāo)志基因進(jìn)行篩選的原理與方法,為了檢測重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入原本無ampR和tetR的大腸桿菌，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖二的菌落。再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖三的結(jié)果(空圈表示與圖二對(duì)照無菌落的位置)。與圖三空圈相對(duì)應(yīng)的圖二中的菌落表現(xiàn)型是_ _，圖三結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌導(dǎo)入的是_。,能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素,pBR3

11、22質(zhì)粒,2、DNA分子雜交的原理與方法,變性,2.(2015威海模擬)科學(xué)家將人的生長激素基因與某種細(xì)菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子進(jìn)行重組，并成功地在該細(xì)菌中得以表達(dá)(如下圖)。請(qǐng)據(jù)圖分析回答：,(1)過程所示獲取目的基因的方法是。 (2)細(xì)菌是理想的受體細(xì)胞，這是因?yàn)樗?(3)質(zhì)粒A與目的基因結(jié)合時(shí)，首先需要用酶將質(zhì)粒切開“缺口”，然后用酶將質(zhì)粒與目的基因“縫合”起來。,逆轉(zhuǎn)錄法(反轉(zhuǎn)錄法),繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)較少,限制性核酸內(nèi)切,DNA連接,(4)若將細(xì)菌B先接種在含有 的培養(yǎng)基上能生長，說明該細(xì)菌中已經(jīng)導(dǎo)入外源質(zhì)粒，但不能說明外源質(zhì)粒是否成功插入目的基因；若將細(xì)菌B再重

12、新接種在含有 的培養(yǎng)基上不能生長，則說明細(xì)菌B中已經(jīng)導(dǎo)入了插入目的基因的重組質(zhì)粒。 (5)檢測工程菌中的生長激素基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA和是否翻譯出生長激素，可采用的技術(shù)分別是 、。,氨芐青霉素,四環(huán)素,核酸分子雜交抗原抗體雜交,4.(2015唐山模擬)基因工程是在現(xiàn)代生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)基礎(chǔ)上建立和發(fā)展起來的，并有賴于微生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展運(yùn)用?；蚬こ袒静僮髁鞒倘缦聢D，請(qǐng)據(jù)圖分析回答問題：,(1)圖中A是。 (2)在上述基因工程的操作過程中，可以遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則的 步驟有(用圖解中序號(hào)表示)。 (3)不同種生物之間的基因移植成功，從分子水平分析，進(jìn)行基因 工程的主要理論依據(jù)是不同生物

13、的DNA結(jié)構(gòu)的基本形式 (填相同、不相同) ，也說明了生物共用一套。,載體,相同,遺傳密碼子,(4)研究中發(fā)現(xiàn)，番茄體內(nèi)的蛋白酶抑制劑對(duì)害蟲的消化酶有抑制作 用，導(dǎo)致害蟲無法消化食物而被殺死，人們成功地將番茄的蛋白酶 抑制劑基因?qū)胗衩左w內(nèi)，玉米獲得了與番茄相似的抗蟲性狀，玉 米這種變異的來源是。,基因重組,(5)科學(xué)家在某種植物中找到了抗枯萎病的基因，并用基因工程的 方法將該基因?qū)虢鸩杌ㄈ~片細(xì)胞的染色體DNA上，經(jīng)培養(yǎng)長成的 植株具備了抗病性，這說明目的基因(抗枯萎病的基因)已。 如果把該基因?qū)肴~綠體DNA中，將來產(chǎn)生的配子中_ (填“一定”或“不一定”)含有抗病基因。,表達(dá),不一定,【

14、解析】(1)圖中A是運(yùn)載目的基因的載體。 (2)基因工程的操作步驟包括獲取目的基因，基因表達(dá)載體的構(gòu)建，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，目的基因的檢測與鑒定。只有將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞過程不遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。 (3)基因工程的操作基礎(chǔ)是不同生物的DNA結(jié)構(gòu)基本形式相同，且共用一套遺傳密碼子。 (4)基因工程又稱DNA重組技術(shù)，其變異原理為基因重組。 (5)如果把抗枯萎病的基因?qū)肴~綠體DNA中，將來產(chǎn)生的雌配子中可能含有抗病基因，雄配子中不含抗病基因。,【考題回訪】 1.(2015石家莊模擬)據(jù)圖表回答問題：,(1)假設(shè)所用的限制酶均能將所識(shí)別的位點(diǎn)完全切開，采用EcoR和Pst酶切含有目的基因的

15、DNA，能得到種DNA片段。如果將質(zhì)粒載體和含目的基因的DNA片段只用EcoR酶切，酶切產(chǎn)物再加入DNA連接酶，其中由兩個(gè)DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有 、 、,4,質(zhì)粒質(zhì)粒連接物,目的基因目的基因連接物,質(zhì)粒目的基因連接物,(2)為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體酶切后的末端任意連接，酶切時(shí)應(yīng)該選用的酶是、。,EcoR,Sma,（3）若啟動(dòng)子位于圖中質(zhì)粒Sma和EcoR酶切位點(diǎn)之間(左側(cè))，能否用EcoR和Sma進(jìn)行切割，進(jìn)而連接？為什么？,不能。這樣會(huì)使質(zhì)粒中的啟動(dòng)子丟失，使形成的基因表達(dá)載體無法轉(zhuǎn)錄。,不能轉(zhuǎn)錄出信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。有調(diào)控序列，如啟動(dòng)子和終止子,：能轉(zhuǎn)錄出信使RNA，能編碼蛋白質(zhì),編碼區(qū),非編碼區(qū),