第二章 菌種的來源(2006).ppt

1、發(fā)酵工程精品課程,華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,第二章：菌種的來源 微生物的特性及工業(yè)微生物的要求 一些工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌種的特點 自然界中有目的微生物分離的原則 菌種選育、分子育種,菌種的來源,第一節(jié) 微生物的特性及工業(yè)微生物的要求 一、微生物的特性,有些微生物能在厭氧的條件下生長,有些微生物能夠利用簡單的有機物和無機物滿足自身的生長,有些微生物能進行復(fù)雜的代謝,有些微生物能利用較復(fù)雜的化合物,有些微生物能在極端的環(huán)境下生長,菌種的來源,微生物的特性及工業(yè)微生物的要求,二：工業(yè)化菌種的要求,能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成 產(chǎn)物,有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的 可

2、操作性要強,遺傳性能要相對穩(wěn)定,不易感染它種微生物或噬菌體,產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病 菌無關(guān)）,生產(chǎn)特性要符合工藝要求,菌種的來源,微生物的特性及工業(yè)微生物的要求,放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）,真菌（青霉素、頭孢等）,一些產(chǎn)芽孢的細(xì)菌,植物或動物來源,一、抗生素生產(chǎn)有關(guān)的微生物,抗生素是次級代謝產(chǎn)物，需要生物體進行復(fù)雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來源如下：,第二節(jié) 已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹,菌種的來源,已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹,二、氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生物,代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有意識地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產(chǎn)物，這種發(fā)酵形象地稱為代謝控制發(fā)酵，最

3、早在氨基酸發(fā)酵中得到成功應(yīng)用。,50, 60年代以氨基酸發(fā)酵為代表的代謝控制發(fā)酵，是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展歷史上的一個轉(zhuǎn)折點：,菌種的來源,已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹,HD:高絲氨酸脫氫酶,黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸的合成調(diào)節(jié)機制,HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶,AK:天冬氨酸激酶,菌種的來源,已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹,氨基酸生產(chǎn)菌的要求：,代謝途徑比較清楚， 代謝途徑比較簡單,谷氨酸發(fā)酵的菌種：,其它氨基酸生產(chǎn)菌：,棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小 桿菌屬的棒型細(xì)菌,常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產(chǎn)菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌,菌種的來源,已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹,三、食品酶制劑生產(chǎn)

4、有關(guān)的微生物,開發(fā)一個新酶，都要經(jīng)過一系列研究的毒理試驗。關(guān)于食品用酶，美國需要得到FDA的批準(zhǔn)。目前已同意使用的僅僅少數(shù)微生物能用于生產(chǎn)食品用酶。,淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌 和地衣牙孢桿菌,菌種的來源,已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹,三、常用的基因表達系統(tǒng),(一)原核生物：大腸桿菌(1977年Boyer)、枯草牙胞桿菌 沙門氏菌,生長迅速、蛋白產(chǎn)量高;,表達蛋白的純化、分離及分析快速；,外源基因的導(dǎo)入相對容易；,已建立了整套表達理論及技術(shù).,菌種的來源,已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹,(二) 真核細(xì)胞表達系統(tǒng),酵母(既是微生物又是真核細(xì)胞),生長迅速，營養(yǎng)要求不高，易培養(yǎng)；,安全性好

5、；,比哺乳動物細(xì)胞操作簡單；,具有一定的修飾蛋白的能力。,菌種的來源,已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹,中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）表達系統(tǒng),具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能；,具有產(chǎn)物胞外分越功能，便于下游產(chǎn)物分離純化；,具有重組基因的高效擴增和表達能力；,具有貼壁生長特性，也可進行懸浮生長；,CHO很少分泌自身的內(nèi)源蛋白。,菌種的來源,已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹,微生物（包括動、植物細(xì)胞）幾乎可以生產(chǎn)我們所需的一切產(chǎn)品，但是涉及到工業(yè)化生產(chǎn)對于某一種特定的產(chǎn)品，只有特定的微生物才具有大量表達的潛力。,問題：,生產(chǎn)抗生素的微生物能不能用于生產(chǎn)氨基酸？,禮來(Eli lilly),花了10年的時間從40萬株微

6、生物中，發(fā)現(xiàn)了三種有潛力的新抗生素。,例：,菌種的來源,已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹,第三節(jié) 自然界中有目的微生物分離的原則,一、菌種分離的一般過程,土樣的采取, 預(yù)處理, 培養(yǎng), 菌落的選擇, 產(chǎn)品的鑒定,如何使樣品中所含微生物的可能性大,如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn),目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物,問題：,菌種的來源,自然界中有目的微生物分離的原則,二、采樣時要注意的問題,氣候、水分、空氣,來源要廣,結(jié)合產(chǎn)品的特點,標(biāo)簽：地點、時間、氣候等,菌種的來源,自然界中有目的微生物分離的原則,富集的三種方案：,定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的 條件，進行培養(yǎng)。,三、目的微生物

7、富集的一些基本方法,富集的目的：,讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。,當(dāng)不可能采用定向培養(yǎng)時，則可設(shè)計在一個分 類學(xué)中考慮，,不能提供任何有助于篩選產(chǎn)生菌的信息，這 時只能通過隨機分離的辦法,菌種的來源,自然界中有目的微生物分離的原則,定向培養(yǎng)的方法,物理方法：加熱、膜過濾等，表2-2 （P31）,但主要是通過培養(yǎng)的方法,菌種的來源,自然界中有目的微生物分離的原則,定向培養(yǎng)的富集方法,1、底物,2、pH條件,3、培養(yǎng)時間,4、培養(yǎng)溫度,等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。,菌種的來源,自然界中有目的微生物分離的原則,四、

8、菌落的選出,從產(chǎn)物角度出發(fā),在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計培養(yǎng)基,利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素（P35）,從形態(tài)的角度,菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。,菌種的來源,自然界中有目的微生物分離的原則,實例：堿性纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選（國家七五攻關(guān)項目）,采樣（造紙廠）,80度30分鐘處理,文獻:產(chǎn)生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿牙孢桿菌、放線菌及霉菌,0.0075%曲利本藍1%CMC（羧甲基纖維素），pH10.5 培養(yǎng)34天，選擇有凹陷圈的菌落,從285個土樣中獲得62株,26株為組成型,36株為誘導(dǎo)型,菌種的來源,

9、自然界中有目的微生物分離的原則,例：醛肟水解酶的篩選,-Journal of biotechnology 94(2002), 65-72,培養(yǎng)基中含0.05% of Z-PAOx,每隔2-3天移去一半培養(yǎng)物，補充新鮮培養(yǎng)基,不斷分析樣品，2-3個月后Z-PAOx降低后，稀釋分離條菌落,菌種的來源,自然界中有目的微生物分離的原則,五、目的微生物富集方法的研究進展,分子生物學(xué)的實驗手段，在微生物鑒別及特定目標(biāo)產(chǎn)物 的篩選方面發(fā)揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術(shù)等,目前土壤中能夠培養(yǎng)的微生物不到總數(shù)的1%。微生物的 多樣性及資源的開發(fā)仍然是今后

10、若干年的研究重點。,2002,陳文新（科學(xué)院院士）,In contrast to this traditional approach, modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening, which also enables access to enzymes of nonculturable organisms. By this strategy, for instance, the company Diversa (San Diego, CA, USA) identised 120

11、unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.,FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 7381,菌種的來源,自然界中有目的微生物分離的原則,第四節(jié) 菌株選育、分子改造,目的,提高生產(chǎn)能力,提高產(chǎn)品質(zhì)量,開發(fā)新產(chǎn)品,解決生產(chǎn)實際問題,防止菌種退化,菌種的來源,菌株選育、分子改造,方法,基因突變：,自然選育、誘變育種,基因重組：,雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程,基因的直接進化：,點突變、易錯PCR、同序法 DNA Shuffl

12、ing等,菌種的來源,菌株選育、分子改造,自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為10-810-9,自然突變有兩種情況：,一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)突變。,另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。,一、自然選育,菌種的來源,菌株選育、分子改造,自然選育在工業(yè)生產(chǎn)上的意義,自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施。,回復(fù)突變：高產(chǎn)菌株在傳代的過程中，由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失，生產(chǎn)性能下降，這種情況我們稱為回復(fù)突變,問題：,高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負(fù)突變高？,菌種的來源,菌株選育、分子改造,自然選育操作

13、步驟：,一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。,單細(xì)胞(孢子)懸液的制備,平板分離,挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察),發(fā)酵試驗,菌種的來源,菌株選育、分子改造,二、誘變育種,用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進行的篩選，稱為誘變育種,誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑,誘變劑,物理在：紫外，快中子,化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍,菌種的來源,菌株選育、分子改造,（二）、誘變劑處理過程中幾個有關(guān)的問題,化學(xué)誘變劑使用過程的安全性,誘變劑量的選擇,誘變劑的選擇,出發(fā)菌株的選擇,（一）、誘變劑的作用原理（略）,壓硝酸：0.07MNa2HPO4 亞硝基胍：1MNaOH,菌種的來源,菌株選育、

14、分子改造,（三）、誘變育種的一般步驟 (p83),（四）、篩選的方法,隨機篩選,形態(tài),理性化篩選,從產(chǎn)物形成的生理生化途徑著手，進行有的放矢的篩選。如結(jié)構(gòu)類似物抗性、營養(yǎng)缺陷型等，篩選而產(chǎn)生的這些特性，稱為遺傳標(biāo)記。,結(jié)構(gòu)類似物：在化學(xué)和空間結(jié)構(gòu)上和代謝的中間物（終產(chǎn)物）相似，因而在代謝調(diào)節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產(chǎn)物）的功能，但細(xì)胞不能以其作為自身的營養(yǎng)物質(zhì)。,菌種的來源,菌株選育、分子改造,HD:高絲氨酸脫氫酶,黃色短桿菌中賴氨酸的合成調(diào)節(jié)機制,HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶,AK:天冬氨酸激酶,結(jié)構(gòu)類似物抗性：Lys的類似物AEC,Thr的類似物AHV,營養(yǎng)缺陷型：如Thr缺陷型,菌種的來源,

15、菌株選育、分子改造,黃色短桿菌F9-50的誘變譜系,Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-) lys.HCl 2.1 g/l,F6-16 (leu -, Thr -) 20.8 g/l,F9-50 (leu -, Thr -, AEC r) 33.5 g/l,菌種的來源,菌株選育、分子改造,三、基因的直接進化(directed evolution),突變 基因突變庫的建立 篩選 基因突變庫的篩選 基因復(fù)制與遺傳,步驟：,在分子水平上，對目標(biāo)基因直接處理，然后通過高通量的篩選方法，提高目標(biāo)蛋白的性能。,菌種的來源,菌株選育、分子改造,主要應(yīng)用：,酶學(xué)性能的提高:

16、,pH,溫度,有機溶劑,生理環(huán)境工業(yè)催化環(huán)境,底物專一性,菌種的來源,菌株選育、分子改造,脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯,例：,PLA,PLA光學(xué)拆分選擇性(%),2 31 57 75 81 90,5次錯位PCR 2次定點突變 Reetz (1997) Liebeton(2000),第二章 菌種的來源,菌種的來源,菌株選育、分子改造,菌種的來源,菌株選育、分子改造,定點突變,錯位PCR,菌種的來源,菌株選育、分子改造,DNA Shuffling:指DNA分子的體外重排，是基因在分子水平上進行有性重組(Sexual Recombination)。,菌種的來源,菌株選育、分子改造,X XXX,X XX X,XX X,XXX X,XX X,X XXX,XX X,X XX X,XXX X,X XXX,XX X,X XX X,XXX X,XX X,XX X,XX XXX X X X X X XX X,Fragment Reassemble Select best with DNAseI fragments recombinants,Repeat for multiple cycles,DNA shuffling,菌種的來源,菌株選育、分子改造,菌種的來源