第二章 基因工程基礎(chǔ)(2)ppt課件.ppt

1、生物技術(shù)制藥,第二章基因工程基礎(chǔ)（2）,1,2.1.2 基因的分離,基因的分離是基因工程研究中的最重要的要素，目的基因的成功分離是基因工程操作的關(guān)鍵。 每個基因特別是單拷貝基因只占整個基因組的很小一部分，且化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，均由A、T、G、C四種堿基組成，具有極其相似的理化性質(zhì)，給特定基因的分離帶來很大的困難。 早期曾利用DNA鏈中富GC區(qū)的解鏈溫度(Tm)高于富AT區(qū)的特點(diǎn)，通過加熱解開部分雙鏈，再用單鏈核酸酶S1切掉單鏈，得到富GC區(qū)的片段。這種方法現(xiàn)在已經(jīng)不用。,生物技術(shù)制藥,2,2.1.2.1 鳥槍(shot gun)法,又叫霰彈法，是用生化方法如用限制酶切割基因組DNA，得到許多長度與一

2、般基因大小相當(dāng)(0.89106Da)的片段。然后將這些片段的混合物隨機(jī)地重組入適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化后在宿主菌中擴(kuò)增，在用適當(dāng)?shù)姆椒êY選所需的基因。 本法要求有簡便的篩選方法，如利用基因(營養(yǎng))缺陷型宿主菌、特異的寡核苷酸或DNA片段探針、特定基因產(chǎn)物的抗體等，通過表型篩選、分子雜交或免疫結(jié)合等技術(shù)檢出目的基因。 鳥槍法常用于建立基因文庫和原核生物基因的克隆。,生物技術(shù)制藥,3,4,建立基因組文庫,基因組文庫是指將基因組DNA經(jīng)限制酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段，隨機(jī)地與相應(yīng)的載體進(jìn)行重組、克隆，所得的克隆群體即組成基因組文庫，它代表了該基因組的所有序列。 為從基因組文庫中篩得所需基因而要求的

3、重組體數(shù)目的大小可用下式計算： N = ln(1-p)/ln(1-f) 式中p為期望概率，f為單個重組體中的插入片段在基因組中所占的份額比，N為所需的重組體數(shù)。 如欲在一哺乳動物基因組(3109 bp)的17kb片段的文庫中，使含有一給定DNA序列達(dá)99%的概率，計算得N為8.1105。即：基因組DNA部分酶解片段大小為17kb時，所建基因組文庫至少應(yīng)含有8.1105以上重組體，才能代表整個基因組。酶解片段越大，所需重組體數(shù)越少。,5,組建基因組文庫用的載體,噬菌體 黏(質(zhì))粒 人工染色體： 酵母：YAC 細(xì)菌：BAC 噬菌體：PAC 哺乳動物：MAC,生物技術(shù)制藥,6,2.1.2.2 cDN

4、A法（即逆轉(zhuǎn)錄法）,由于真核生物的基因中常含有非編碼間隔區(qū)（內(nèi)含子），在原核受體中無法正常表達(dá)，必須設(shè)法消去內(nèi)含子。mRNA是已經(jīng)轉(zhuǎn)錄加工過的RNA，即無內(nèi)含子的遺傳密碼攜帶者。在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以mRNA為模版逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA (cDNA)，加上接頭后，即可與載體連接成重組分子。 構(gòu)建cDNA文庫和直接逆轉(zhuǎn)錄都屬于逆轉(zhuǎn)錄法。,生物技術(shù)制藥,7,生物技術(shù)制藥,8,建立cDNA文庫,cDNA的克隆對于特定基因的分離和特性研究是極有價值的。 cDNA文庫的最關(guān)鍵的特征是它只包括在特定組織或細(xì)胞類型中已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因序列，這樣使cDNA文庫的復(fù)雜性要比基因組文庫低得多。 由于不同細(xì)

5、胞類型、發(fā)育階段以及細(xì)胞所處的特定狀態(tài)是由特定基因的表達(dá)決定的，因此各自的mRNA種類不同，其cDNA文庫具有獨(dú)特性。 若選擇的細(xì)胞或組織的類型得當(dāng)，可容易地從cDNA文庫中篩選出所需的基因序列。,生物技術(shù)制藥,9,建cDNA文庫的一般步驟,分離表達(dá)目的基因的組織或細(xì)胞 從組織或細(xì)胞制備總RNA和mRNA cDNA第一條鏈的合成 cDNA第二條鏈的合成 cDNA的甲基化和接頭的加入 雙鏈DNA與載體的連接,生物技術(shù)制藥,10,分離表達(dá)目的基因的組織或細(xì)胞,為最大限度地獲得目的基因，避免其它組織或細(xì)胞來源基因的混雜，應(yīng)盡量避免其它組織和細(xì)胞類型的污染。 為得到全長的cDNA，所用材料要盡可能新鮮

6、。,生物技術(shù)制藥,11,從組織或細(xì)胞制備總RNA和mRNA,從有限量的起始材料組建cDNA文庫的主要限制是能否得到足夠量的模板RNA。 為增加RNA的回收，可用硫氰胍或酸性硫氰胍-酚-氯仿等微量RNA分離法及載體RNA共沉淀法來制備RNA。所用載體RNA必須與目的RNA有明顯區(qū)別，不作為模板參與cDNA的合成。 如材料有限應(yīng)直接用總RNA建cDNA文庫。 如起始材料不受限制，一般用oligo(dT)纖維素柱親和層析分離出poly(A) RNA作為cDNA合成模板。這可降低文庫的復(fù)雜性，大部分mRNA序列可富集50倍左右。mRNA的相對含量增加于細(xì)胞內(nèi)豐度較低的mRNA cDNA的合成是有利的，

7、但在poly(A) RNA的純化過程中也可能造成某些基因序列的丟失。,生物技術(shù)制藥,12,生物技術(shù)制藥,13,cDNA第一條鏈的合成(1),合成需要RNA模板、cDNA合成引物、反轉(zhuǎn)錄酶、四種脫氧核苷三磷酸和相應(yīng)的緩沖液。 模板可以用總RNA或poly(A) RNA。 引物通常用oligo(dT)(1218)或由小牛胸腺DNA制備的隨機(jī)引物(56nt)。 合成的質(zhì)量可用堿性瓊脂糖凝膠電泳檢測。,生物技術(shù)制藥,14,cDNA第一條鏈的合成(2)：oligo(dT)引物,用oligo(dT)的優(yōu)點(diǎn)是可最大限度地減少poly(A)模板合成cDNA的可能性，缺點(diǎn)是cDNA的合成總是從mRNA 3-端開

8、始，在最后的cDNA文庫中，代表mRNA 3-區(qū)域的組份所占比例會高，而且對一些較長的mRNA分子來說，由于反轉(zhuǎn)錄酶在cDNA合成過程中易于從mRNA分子上脫開，因而造成第一條cDNA鏈合成的不完整。,生物技術(shù)制藥,15,cDNA第一條鏈的合成(3)：隨機(jī)引物,用隨機(jī)引物的好處是，合成的cDNA文庫可更好地代表最初RNA模板所代表的組份；缺點(diǎn)是，由于cDNA在RNA模板上的合成是隨機(jī)的，容易產(chǎn)生較大量的非全長RNA模板的轉(zhuǎn)錄物，從而影響到全長cDNA分子的得率。 若想使cDNA文庫最大限度地代表poly(A) mRNA的序列，在合成cDNA的反應(yīng)中，最好的組合是用總RNA和oligo(dT)引

9、物。,生物技術(shù)制藥,16,生物技術(shù)制藥,17,cDNA第二條鏈的合成(1)：自身引導(dǎo)法,反轉(zhuǎn)錄酶的催化反應(yīng)，通常會在新合成出的cDNA 3-端形成具有部分雙鏈形式的發(fā)夾環(huán)。基于這一特點(diǎn)，在完成第一鏈的合成并與模板mRNA分離后，可利用發(fā)夾環(huán)中的雙鏈部分為引物，引導(dǎo)DNA聚合酶以cDNA為模板，合成出互補(bǔ)的cDNA第二鏈，反應(yīng)結(jié)束后用S1核酸酶降解去除發(fā)夾環(huán)中的單鏈部分，得到雙鏈形式的cDNA片段。 缺點(diǎn)是S1核酸酶的反應(yīng)條件苛刻，難以控制，?；夭簧鹘到怆p鏈形式的cDNA?，F(xiàn)已很少用。,生物技術(shù)制藥,18,19,cDNA第二條鏈的合成(2)：置換合成法,特點(diǎn)：以第一條鏈合成的產(chǎn)物cDNAmRNA

10、雜交分子為切口平移的模板，RNase H在雜交分子的mRNA鏈上造成切口或缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物，它們被大腸桿菌DNA聚合酶用以合成第二條鏈。 優(yōu)點(diǎn)：效率高；直接利用第一條鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，毋需進(jìn)一步處理和純化；省去S1酶處理，改善了cDNA的質(zhì)量。 改進(jìn)：RNase H/大腸桿菌DNA聚合酶/Klenow片段不同配比合成第二條鏈，使全長cDNA的得率提高。,生物技術(shù)制藥,20,21,cDNA第二條鏈的合成(3)：引物-銜接頭法,引物-銜接頭法是通過將cDNA兩端加上限制酶切位點(diǎn)，使之能較方便地克隆入相應(yīng)的載體。 也可以加入寡聚核苷酸，以之完成合成。,生物技術(shù)制藥,22,23,cDNA的甲基化

11、與接頭的加入,雙鏈cDNA合成后，為提高cDNA片段與載體的連接效率，通常要給平端接上接頭。 接頭為人工合成的含有限制酶酶切位點(diǎn)的雙鏈DNA短片段時，需先對文庫cDNA甲基化處理，修飾內(nèi)部可能出現(xiàn)的酶切位點(diǎn)，然后接入接頭，再用限制酶處理，使cDNA片段產(chǎn)生黏端，以便與相應(yīng)限制酶切處理的載體DNA連接。 接頭是一端為限制酶黏端的雙鏈DNA片段，則不必對文庫cDNA作甲基化修飾。,生物技術(shù)制藥,24,雙鏈cDNA與載體的連接,建好cDNA文庫的關(guān)鍵是雙鏈cDNA與載體的有效連接，特別是起始材料很少時尤為如此。 保證cDNA文庫具代表性的關(guān)鍵是選擇盡可能有效的載體。通常用gt10/gt11及與之相當(dāng)

12、的載體來組建非表達(dá)和表達(dá)cDNA文庫，一般不用轉(zhuǎn)化效率低的質(zhì)粒作載體。 插入序列(cDNA) 載體DNA的摩爾比一般在11至31之間為好。,生物技術(shù)制藥,25,直接從特定的mRNA分離基因,若在細(xì)胞中某mRNA的含量很高，如哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞中珠蛋白mRNA占總mRNA的90%以上，則可通過mRNAcDNAdscDNA的途徑直接得到該基因，而繞過建cDNA文庫這一步。,生物技術(shù)制藥,26,2.1.2.3 基因的化學(xué)合成,全合成 化學(xué)-酶促合成,生物技術(shù)制藥,27,基因的化學(xué)合成：全合成,先分別合成出所有片段，相鄰片段間46個堿基重疊互補(bǔ)，在適當(dāng)條件下，退火后，用T4 DNA連接酶將各片段以磷酸

13、二酯鍵共價連接成一個完整的基因。 化學(xué)合成的DNA片段純化后其5-和3-端均為羥基，在連接前5-端要磷酸化，但處于基因5-端的兩個寡核苷酸片段不磷酸化，以防基因本身在片段連接時自環(huán)化。 大的基因，可先將它分成幾個亞單位合成，然后分離純化亞單位，再組成完整的基因。,生物技術(shù)制藥,28,基因的化學(xué)合成：化學(xué)-酶促合成,不需要合成組成完整基因的所有寡核苷酸片段 只需合成其中的一些片段，相鄰的3-端有一短的序列相互補(bǔ)，在適當(dāng)?shù)臈l件下，經(jīng)退火形成模板-引物復(fù)合體，然后在存在四種dNTP的條件下，用Klenow片段填補(bǔ)互補(bǔ)片段之間的缺口，最后，用T4 DNA連接酶連接和適當(dāng)?shù)南拗泼该盖泻?，重組入載體。,生

14、物技術(shù)制藥,29,30,2.1.2.4 分離目的基因的其他方法,從蛋白質(zhì)入手分離其編碼基因 如有足夠量的某源于真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)，可得其抗體，則可通過雙抗體法分離編碼該蛋白的基因。 原理：核糖體沿mRNA合成多肽鏈時形成多聚核糖核蛋白體，把它從細(xì)胞中提取出來后與特定抗體一起孵育，可形成多聚核糖體-抗體復(fù)合物，再加入該蛋白抗體的抗體，則 可通過不連續(xù)蔗糖梯度離心，將含有特定mRNA的多聚核糖體與總多聚核糖體分離，然后通過酚、氯仿抽提除去蛋白，經(jīng)oligo(dT)柱親和層析，便可得到該蛋白質(zhì)的mRNA，反轉(zhuǎn)錄即得cDNA。 改進(jìn)：用protein A-Sepharose 4B為親和層析介質(zhì)。 PCR

15、技術(shù)的出現(xiàn)使基因的分離和改造變得簡便，特別是對原核基因的分離，只要知道基因的序列，即可設(shè)計適當(dāng)?shù)囊飶娜旧wDNA上將所要的基因擴(kuò)增出來。,生物技術(shù)制藥,31,2.1.3 基因工程載體,外源基因必須將它導(dǎo)入宿主細(xì)胞之中才能發(fā)揮作用，或制藥或治療等，這就需要運(yùn)載它的載體。 基因工程載體決定了外源基因的復(fù)制、擴(kuò)增、傳代乃至表達(dá)。,生物技術(shù)制藥,32,生物技術(shù)制藥,33,載體需具備的基本條件,能自我復(fù)制并能帶動插入的外源基因一起復(fù)制 具有合適的限制酶切位點(diǎn)。載體上單一的限制酶切位點(diǎn)越多越好，可將不同限制酶切下的外源DNA片段方便地插入載體。 具有合適的篩選標(biāo)記，如抗性標(biāo)記。 在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)要多，使

16、外源基因得以擴(kuò)增。 載體的分子量要小，以容納較大的外源DNA插入片段。 在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性高，保證重組體能穩(wěn)定傳代，不易丟失。,生物技術(shù)制藥,34,載體的分類,現(xiàn)有的載體多由細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、病毒DNA分離出來的元件組裝而成。 克隆載體與表達(dá)載體 胞內(nèi)表達(dá)載體與分泌表達(dá)載體 原核細(xì)胞表達(dá)載體與真核細(xì)胞表達(dá)載體 測序載體、克隆-轉(zhuǎn)錄載體、基因調(diào)控報告載體等,生物技術(shù)制藥,35,載體的類型,質(zhì)粒載體 噬菌體載體 黏(質(zhì))粒載體 M13噬菌體載體和噬菌粒 真核細(xì)胞載體,生物技術(shù)制藥,36,質(zhì)粒載體,質(zhì)粒載體是以細(xì)菌質(zhì)粒的各種元件為基礎(chǔ)組建而成的基因工程載體。 雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，大小在120

17、0kb。 復(fù)制和遺傳獨(dú)立于細(xì)菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主的酶和蛋白質(zhì)。 質(zhì)粒的復(fù)制方式分嚴(yán)緊型和松弛型：嚴(yán)緊型質(zhì)粒與松弛型質(zhì)粒。 常用的有：pBR322、pUC18/19、pGEM系列。,生物技術(shù)制藥,37,噬菌體載體,要想很好地利用這類載體，必須透徹了解它的分子生物學(xué)。“Molecular Cloning”中有詳細(xì)介紹。 噬菌體基因組為雙鏈線性DNA分子，長48502bp，末端長12nt，為互補(bǔ)單鏈，稱黏端，是將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需的序列。 噬菌體基因組中部約1/3區(qū)段為裂解性生長的非必需區(qū)，在J和N基因之間的區(qū)域可被外源DNA取代。據(jù)此，可通過遺傳操作在其適當(dāng)位置接上便于克隆

18、的限制酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成噬菌體載體。,生物技術(shù)制藥,38,噬菌體載體的種類,Chiron系列：可用于克隆DNA大片段，n24kb。 EMBL系列：可用于克隆大片段。 gt系列：gt1023；主要用于構(gòu)建cDNA文庫，gt11及其衍生物gt1823亦可作表達(dá)載體。 其它：ORF8、ZAP等。 選擇時要考慮：所要用的限制酶；將要插入的DNA片段大??；是否要在大腸桿菌中表達(dá)；所具備的篩選方案等。,生物技術(shù)制藥,39,黏質(zhì)粒載體,黏質(zhì)粒是將質(zhì)粒與噬菌體DNA包裝(cos)序列組合構(gòu)建而成。 特點(diǎn)：所能容納的外源DNA片段的長度比噬菌體載體的大，約在3545kb。 能轉(zhuǎn)染大腸桿菌、哺乳動物細(xì)胞。,生物技術(shù)

19、制藥,40,M13噬菌體載體,M13噬菌體屬絲狀噬菌體，此類噬菌體基因組的序列同源性在98%以上。 M13mp系列是由重組的M13mp1改造而來。其特點(diǎn)是在主要基因間隔區(qū)插入了一段帶有l(wèi)acZ基因調(diào)控序列及其N端頭146氨基酸的編碼序列，并在lacZ序列內(nèi)引入了一系列獨(dú)特的限制酶切位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)(MCS)。 篩選方便：可利用噬斑顏色的變化來篩選重組體。（因外源DNA片段的插入破壞了-半乳糖苷酶片段的-互補(bǔ)作用） 現(xiàn)最廣泛使用的是M13mp18/19。,生物技術(shù)制藥,41,真核細(xì)胞用載體的基本條件(1),含有原核基因的復(fù)制起始序列(如ColE1起始序列ori)和篩選標(biāo)記(如使大腸桿菌具有Am

20、pr的-內(nèi)酰胺酶基因)，以便于在大腸桿菌中擴(kuò)增和篩選。 含有真核基因的復(fù)制起始序列(如SV40病毒的復(fù)制序列)、酵母的2質(zhì)粒的復(fù)制起始序列，及真核細(xì)胞篩選標(biāo)記(如氨基糖苷G418抗性基因，在酵母中與自養(yǎng)有關(guān)的基因TRP1、LEU2、HIS3和URA3，哺乳動物細(xì)胞中常用的二氫葉酸還原酶DHFR基因)。,生物技術(shù)制藥,42,真核細(xì)胞用載體的基本條件(2),含有有效的啟動子序列(增強(qiáng)子序列等各種順式作用元件)，保證在其下游的外源基因進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄起始。 含有RNA聚合酶所需要的轉(zhuǎn)錄終止和poly(A)加入的信號序列 有合適的供外源基因插入的限制酶切位點(diǎn)。,生物技術(shù)制藥,43,人工染色體：YAC,Y

21、AC(酵母人工染色體)：是由酵母染色體中分離出來的DNA復(fù)制起始序列(ARS，自主復(fù)制序列)、著絲點(diǎn)(CEN)、來自于四膜蟲的端粒(TEL)和酵母選擇性標(biāo)記(TRP1、URA3)組成的能自我復(fù)制的線性克隆載體。 可插入1002000kb的外源DNA片段 缺點(diǎn)：易出現(xiàn)嵌合體(占4060%)；某些克隆不穩(wěn)定 ；不容易與15Mb的酵母自身染色體相分離。,生物技術(shù)制藥,44,生物技術(shù)制藥,45,人工染色體：BAC,BAC(細(xì)菌人工染色體)：是以細(xì)菌F因子為基礎(chǔ)組建的細(xì)菌克隆體系。 BAC特點(diǎn)：拷貝數(shù)低；穩(wěn)定；比YAC易分離；對外源DNA的包容量可達(dá)300kb可通過電穿孔導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞。 BAC不足：對無

22、選擇性標(biāo)記的DNA的產(chǎn)率很低。,生物技術(shù)制藥,46,人工染色體：MAC,MAC(哺乳動物人工染色體)：正在研究中。擬從哺乳動物細(xì)胞中分離出復(fù)制起始區(qū)、端粒、著絲點(diǎn)等進(jìn)行組建。 特點(diǎn)：可確定精確的有絲和減數(shù)分裂所需的DNA片段大小；研究哺乳動物中染色體的功能；對大而復(fù)雜的基因進(jìn)行功能分析；用于體細(xì)胞基因治療。,生物技術(shù)制藥,47,大腸桿菌中所用表達(dá)載體的要求,含有強(qiáng)的可誘導(dǎo)的啟動子，使外源基因能有效轉(zhuǎn)錄(常用啟動子有：Lac、Trp、Tac；PL、PR；T7)。 在啟動子下游區(qū)和ATG(起始密碼子)上游區(qū)有一個好的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列(SD)。 在外源基因插入序列的下游區(qū)要有一個強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列，

23、保證外源基因的有效轉(zhuǎn)錄和質(zhì)粒的穩(wěn)定性。,生物技術(shù)制藥,48,適用于大腸桿菌的常用質(zhì)粒,測序質(zhì)粒：T-VECTOR 表達(dá)質(zhì)粒：基本質(zhì)粒 穿梭質(zhì)粒 融合質(zhì)粒 Creator系統(tǒng),生物技術(shù)制藥,49,T-VECTOR,PCR產(chǎn)物由于大多使用Taq酶作為合成酶，因此在其3端大多接有一個或多個dA，故對于一類3端加有dT的線型載體有高效的連接環(huán)化能力。 T-VECTOR接頭兩端有通用的測序引物序列，可方便的用于接入片段的序列測定。并且兩端同時存在多種限制性酶切位點(diǎn)，便于產(chǎn)物DNA的進(jìn)一步克隆。,生物技術(shù)制藥,50,生物技術(shù)制藥,51,生物技術(shù)制藥,52,生物技術(shù)制藥,53,生物技術(shù)制藥,基本表達(dá)質(zhì)粒,5

24、4,生物技術(shù)制藥,55,穿梭質(zhì)粒,生物技術(shù)制藥,56,生物技術(shù)制藥,pDual Expression System* High-level protein expression in bacterial or mammalian systems Express protein as a native or tagged fusion protein PROMOTERS CMV promoter for constitutive mammalian expression Hybrid T7/lacO promoter for inducible bacteria expression SELEC

25、TION G418 selection in mammalian cells Kanamycin selection in bacterial cells C-TERMINAL TAGS AVAILABLE New pDual GC has a 6xHis tag and a c-myc epitope pDual has a CBP tag for simple detection and affinity purification,57,生物技術(shù)制藥,融合質(zhì)粒,58,生物技術(shù)制藥,59,Clontech公司的Creator系統(tǒng),準(zhǔn)確的說這更像一個克隆系統(tǒng)，或者說像是一個操作平臺：這個系統(tǒng)中

26、有一個中間載體和一系列配套的受體質(zhì)粒（最終的表達(dá)載體），當(dāng)目的基因克隆到中間載體后，就可以快速高效地將目的基因轉(zhuǎn)移到任意一個配套的受體質(zhì)粒中，而不用再考慮酶切位點(diǎn)、連接效率、目的基因的方向、讀碼框架。在這個系統(tǒng)中有一個介導(dǎo)目的DNA定點(diǎn)重組的蛋白叫做Cre，這是一個來源于P1噬菌體、大小為38kDa的重組酶，能夠?qū)Ｒ蛔R別DNA序列上的loxP位點(diǎn),并介導(dǎo)該位點(diǎn)上的DNA重組。 當(dāng)用戶需要將目的基因克隆到多個表達(dá)載體時，只需要將含有目的基因的供體質(zhì)粒分別和配套的表達(dá)載體（受體質(zhì)粒）混合，加入Cre酶室溫放置15分鐘，70度保溫5分鐘，即可用于轉(zhuǎn)化。Cre酶結(jié)合兩種質(zhì)粒的loxP位點(diǎn)，解鏈并介導(dǎo)DNA重組，使目的基因插入到表達(dá)載體上，而不會改變目的基因的閱讀框架或者方向。,生物技術(shù)制藥,60,生物技術(shù)制藥,61,各種克隆載體的比較,生物技術(shù)制藥,62,附加知識點(diǎn)：PCR引物設(shè)計,1 atgtcagtca gaaaaatttt aagaatggga gatccaattc tccgtaaaat ctcagagcca