青霉素生產(chǎn)工藝

1、.,1,青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝,.,2,青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝 菌種 發(fā)酵工藝流程 培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)控制 提取精制,.,3,青霉素類抗生素,青霉素(Penicillin)又稱盤尼西林，是人類發(fā)現(xiàn)的第一種抗生素，也是目前全球銷量最大的抗生素。 青霉素是-內(nèi)酰胺類抗生素中的一類，是分子中含有青霉烷、能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的系列生長(zhǎng)期起殺菌作用的一類抗生素。 一種高效、低毒、臨床應(yīng)用廣泛的重要抗生素。它的研制成功大大增強(qiáng)了人類抵抗細(xì)菌性感染的能力，帶動(dòng)了抗生素家族的誕生。,.,4,青霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu),青霉素是-內(nèi)酰胺類抗生素中的一類，具有-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)；是分子中含有青霉素母核（青霉烷）的多種化合物的總稱

2、。,分子結(jié)構(gòu)球棍模型,-內(nèi)酰胺環(huán),6-氨基青霉烷酸,.,5,青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝,.,6,青霉素制備的一般流程圖,菌種 孢子制備 種子制備 發(fā)酵 發(fā)酵液預(yù)處理及種子加濾 提取及精制 成品檢驗(yàn) 成品包裝,前體,發(fā)酵階段,提取精制,.,7,菌種,目前國(guó)內(nèi)青霉素生產(chǎn)菌按其在深層培養(yǎng)中菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種，根據(jù)絲狀菌產(chǎn)生孢子的顏色又分為黃孢子絲狀菌和綠孢子絲狀菌，常用菌種為綠孢子絲狀菌，如產(chǎn)黃青霉素。,.,8,菌種,青霉素最初生產(chǎn)菌為音符型青霉菌，生產(chǎn)能力僅為幾十個(gè)單位，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)需要。后來(lái)發(fā)現(xiàn)適合深層培養(yǎng)的新菌種產(chǎn)黃青霉，生產(chǎn)能力100U/ml，經(jīng)不斷誘變選育，目前平均生產(chǎn)能力660

3、00-70000U/ml，國(guó)際最高生產(chǎn)能力已超100000U/ml。,.,9,青霉素產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)過(guò)程,分生孢子發(fā)芽期 菌絲繁殖期 脂肪粒形成期 脂肪粒減少，小空孢 大空孢 自溶,菌絲生長(zhǎng)期,青霉素分泌期,菌絲自溶期,.,10,14期為菌絲生長(zhǎng)期，3期的菌體適宜為種子。45期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過(guò)工程措施，延長(zhǎng)此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來(lái)之前結(jié)束發(fā)酵。,.,11,青霉素發(fā)酵過(guò)程中的代謝變化分為菌體生長(zhǎng)、青霉素合成和菌體自溶三個(gè)階段。,菌體生長(zhǎng)階段：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的環(huán)境中經(jīng)過(guò)短時(shí)間的適應(yīng)，即開(kāi)始發(fā)育、生長(zhǎng)和繁殖，直至達(dá)到菌體的臨界濃度。 青霉素合成階段：這個(gè)階段主要合成青霉素，

4、青霉素的生產(chǎn)速率達(dá)到最大，并一直維持到青霉素合成能力衰退。在這個(gè)階段，菌體重量有所增加，但產(chǎn)生菌的呼吸強(qiáng)度一般無(wú)顯著變化。 菌體自溶階段：這個(gè)階段菌體衰老，細(xì)胞開(kāi)始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生產(chǎn)速率下降，氨基氮增加，PH上升。,.,12,絲狀菌三級(jí)發(fā)酵工藝流程冷凍管（25C，孢子培養(yǎng)，7天）斜面母瓶（25C，孢子培養(yǎng)，7天）大米孢子（26C，種子培養(yǎng)56h）一級(jí)種子培養(yǎng)液（27C，種子培養(yǎng)，24h）二級(jí)種子培養(yǎng)液（2726C,發(fā)酵,7天）發(fā)酵液。,.,13,青霉素發(fā)酵過(guò)程,青霉素發(fā)酵時(shí)，青霉素生產(chǎn)菌在合適的培養(yǎng)基、PH、溫度和通氣攪拌等發(fā)酵條件下進(jìn)行生長(zhǎng)并合成青霉素。 發(fā)酵開(kāi)始前，有關(guān)設(shè)

5、備和培養(yǎng)基（主要是碳源、氮源、前體和無(wú)機(jī)鹽等）必須先經(jīng)過(guò)滅菌，后接入種子。 在整個(gè)過(guò)程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，在發(fā)酵過(guò)程中往往要加入泡沫劑，假如酸堿控制發(fā)酵液的PH，還需要間歇或連續(xù)的加入葡萄糖及銨鹽等化合物以補(bǔ)充碳源及氮源，或補(bǔ)進(jìn)其他料液和前體等以促進(jìn)青霉素的生產(chǎn)。,.,14,青霉素的發(fā)酵,發(fā)酵工藝控制： 1.基質(zhì)濃度 2.培養(yǎng)基成分的控制 3.溫度 4. pH 值、溶氧 5.菌絲狀態(tài) 6.泡沫的控制,.,15,發(fā)酵工藝控制,1.基質(zhì)濃度 ： 在發(fā)酵過(guò)程中，常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過(guò)高，對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏或?qū)z生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制（如葡萄糖的阻遏和抑制 , 苯乙酸的生長(zhǎng)抑制

6、）, 而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成 。 所以， 在青霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操作法 ，以維持一定的最適濃度 。,.,16,發(fā)酵工藝控制,2.培養(yǎng)基成分的控制 : A.碳源： 發(fā)酵中常用乳酸或葡萄糖。 乳糖最為便宜，但因貨源較少，很多國(guó)家采用葡萄糖代替。但當(dāng)葡萄糖濃度超過(guò)一定限度時(shí)，會(huì)過(guò)分加速菌體的呼吸，以至培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要，使一些中間代謝物不能完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基中，導(dǎo)致pH下降，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。 目前普遍采用淀粉的酶水解產(chǎn)物，葡萄糖化液流加，以降低成本。,.,17,發(fā)酵工藝控制,B.氮源： 主要有機(jī)氮源為玉米漿、棉籽餅粉、

7、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨等。 玉米漿為較理想的氮源，含固體量少，有利于通氣及氧的傳遞，因而利用率較高。 有機(jī)氮源還可以提供一部分有機(jī)磷，供菌體生長(zhǎng)。無(wú)機(jī)氮如硝酸鹽、尿素、硫酸銨等可適量使用。,.,18,發(fā)酵工藝控制,C.無(wú)機(jī)鹽： 碳酸鈣用來(lái)中和發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的雜酸，并控制發(fā)酵液的pH值 為菌體提供營(yíng)養(yǎng)的無(wú)機(jī)磷源一般采用磷酸二氫鉀。 另外加入硫代硫酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所需的硫。 鐵離子對(duì)青霉素有毒害作用，應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵液中鐵含量在30ug/mL以下?，F(xiàn)在還有一些工廠采用鐵罐發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中鐵離子便逐漸進(jìn)入發(fā)酵液；發(fā)酵時(shí)間愈長(zhǎng)，則鐵離子愈多。鐵離子在50g/ml以上便會(huì)影響青霉素的合成

8、。所以青霉素的發(fā)酵罐采用不銹鋼制造為宜。,.,19,發(fā)酵工藝控制,D.前體： 前體的加入是青霉素發(fā)酵的關(guān)鍵問(wèn)題之一。 添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借?；D(zhuǎn)移的作用，將苯乙酸轉(zhuǎn)入青霉素分子，提高青霉素G的生產(chǎn)強(qiáng)度。 但苯乙酸對(duì)發(fā)酵有影響，一般以苯乙酰胺較好。 也有采用苯乙酸月桂醇酯，其優(yōu)點(diǎn)是在發(fā)酵中月桂醇酯水解，苯乙酸結(jié)合進(jìn)青霉素成品。而月桂酸作為細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)劑及發(fā)酵液消沫劑，且其毒性比苯乙酸小，但價(jià)格較貴。 前體要在發(fā)酵開(kāi)始20h后加入，并在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中控制在50g/ml左右。前體用量大于0.1%時(shí)，青霉素的生物合成均下降。所以一般發(fā)酵液中前體濃度以始終維持在0.1%為宜。,.,20,發(fā)酵工藝控

9、制,3.溫度 ： 青霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別 , 但一般認(rèn)為應(yīng)在25 C 左右。溫度過(guò)高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率 , 同時(shí)增加葡萄糖的維持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。對(duì)菌絲生長(zhǎng)和青霉素合成來(lái)說(shuō) , 最適溫度不是一樣的, 一般前者略高于后者, 故有的發(fā)酵過(guò)程在菌絲生長(zhǎng)階段采用較高的溫度，以縮短生長(zhǎng)時(shí)間, 到達(dá)生產(chǎn)階段后便適當(dāng)降低溫度 , 以利于青霉素的合成。,.,21,發(fā)酵工藝控制,4. pH 值、溶氧 ： pH值：青霉素發(fā)酵的最適pH 值一般認(rèn)為在6.87.2 左右, 應(yīng)盡量避免 pH 值超過(guò)7.0。因?yàn)榍嗝顾卦趬A性條件下不穩(wěn)定,容易加速其水解。 溶氧:對(duì)于好氧的青霉

10、素發(fā)酵來(lái)說(shuō),溶氧濃度是影響發(fā)酵過(guò)程的一個(gè)重要因素。當(dāng)溶氧濃度降到30%飽和度以下時(shí),青霉素產(chǎn)率急劇下降,低于10%飽和度時(shí),則造成不可逆的損害。溶氧濃度過(guò)高,說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)不良或加糖率過(guò)低,造成呼吸強(qiáng)度下降,同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。 在罐的夾層或蛇管中需通冷卻水以維持一定罐溫。 在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，需不斷通無(wú)菌空氣和攪拌，以維持一定罐壓或溶氧。,.,22,5. 菌絲狀態(tài)： 菌絲濃度：發(fā)酵過(guò)程中必須控制菌絲濃度不超過(guò)臨界菌體濃度, 從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上達(dá)到平衡。 菌絲生長(zhǎng)速度：在葡萄糖限制生長(zhǎng)的條件下，當(dāng)比生長(zhǎng)速率低于0.015h-1時(shí)，比生產(chǎn)速率與比生長(zhǎng)速率成正比。因此,

11、要在發(fā)酵過(guò)程中達(dá)到并維持最大比生產(chǎn)速率,必須使比生長(zhǎng)速率不低0.015h-1。 菌絲形態(tài)：青霉素產(chǎn)生菌分化主要呈絲狀生長(zhǎng)和結(jié)球生長(zhǎng)兩種形態(tài)。在絲狀菌發(fā)酵中, 控制菌絲形態(tài)使其保持適當(dāng)?shù)姆种Ш烷L(zhǎng)度, 并避免結(jié)球 , 是獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中, 使菌絲球保持適當(dāng)大小和松緊,并盡量減少游離菌絲的含量, 也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵素之一。,.,23,發(fā)酵工藝控制,6.泡沫的控制 ： 在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑 “ 泡敵 ” 來(lái)消泡。 應(yīng)當(dāng)控制其用量并要少量多次加入, 尤其在發(fā)酵前期不宜多用, 否則會(huì)影響菌體的呼吸代謝 。 加消沫

12、劑控制泡沫，必要時(shí)還加入酸、堿以調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH。,.,24,染 菌 處 理,染菌是發(fā)酵工業(yè)長(zhǎng)期以來(lái)不能徹底解決的問(wèn)題，因此如何解決染菌問(wèn)題就成了發(fā)酵工業(yè)的工作重點(diǎn)之一。要解決染菌問(wèn)題首要問(wèn)題就是要能檢測(cè)出是否染菌。 染菌通常通過(guò)三個(gè)途徑發(fā)現(xiàn)：無(wú)菌試驗(yàn)，發(fā)酵液直接鏡檢，發(fā)酵液的生化分析。其中無(wú)菌試驗(yàn)是判斷染菌的主要依據(jù)。,.,25,染 菌 的 處 理,染菌在發(fā)酵過(guò)程的每個(gè)階段都可能發(fā)生，下面就各個(gè)不同的階段的染菌情況和處理辦法一一說(shuō)明。 種子培養(yǎng)期染菌 發(fā)酵前期染菌 發(fā)酵中期染菌 發(fā)酵后期染菌,.,26,染 菌 的 處 理,種子培養(yǎng)期染菌 種子培養(yǎng)主要是生長(zhǎng)繁殖菌體。此時(shí)菌體濃度低，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)

13、豐富，因此容易染菌。種子培養(yǎng)期染菌，帶進(jìn)發(fā)酵罐中的危害極大，應(yīng)嚴(yán)格控制種子污染。當(dāng)發(fā)現(xiàn)種子受污染后均應(yīng)滅菌后棄去，并對(duì)種子罐、管道進(jìn)行檢查和徹底滅菌。,返 回,.,27,染 菌 的 處 理,發(fā)酵前期染菌 發(fā)酵前朗主要是菌體生長(zhǎng)繁殖，代謝產(chǎn)物生成很少，染菌后雜菌容易繁殖，與生產(chǎn)菌爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)成分和氧分，嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)物的生成，因此要特別注意發(fā)酵前期的染菌。當(dāng)發(fā)酵前期染菌時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)成分消耗不多，能耗也不大，從經(jīng)濟(jì)性的角度考慮應(yīng)迅速重新滅菌，補(bǔ)充必要的營(yíng)養(yǎng)成分，重新接種進(jìn)行發(fā)酵。,返 回,.,28,染 菌 的 處 理,發(fā)酵中期染菌 發(fā)酵中期染菌將嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的代謝，影響產(chǎn)物的生成。如產(chǎn)

14、酸，產(chǎn)泡沫，使菌體自溶，使發(fā)酵液變臭等。發(fā)酵中期染菌，由于營(yíng)養(yǎng)成分大量消耗，一般挽救處理困難，危害性大，發(fā)酵中期染菌應(yīng)做到早發(fā)現(xiàn)，早處理，通常做法是“倒罐”，即用一罐沒(méi)有染菌的發(fā)酵液與染菌的發(fā)酵液混合，使有害菌濃度下降，生產(chǎn)菌濃度提高進(jìn)而重新成為優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)菌群。顯然，倒罐必然造成物料消耗和操作費(fèi)用的增加。,返 回,.,29,染 菌 的 處 理,發(fā)酵后期染菌 發(fā)酵后期產(chǎn)物積累較多，效價(jià)已經(jīng)很高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)接近耗盡，此時(shí)如染菌量不多，可繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，如嚴(yán)重污染也可提前放罐，停止發(fā)酵，這在經(jīng)濟(jì)上往往是合算的。,.,30,下游操作,過(guò)濾 萃取 脫色 結(jié)晶,.,31,發(fā)酵液預(yù)處理,青霉菌素發(fā)酵后，放罐，加少

15、量絮凝劑沉淀蛋白，然后經(jīng)真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾或板框過(guò)濾（青霉菌絲較粗，過(guò)濾較容易） ，除掉菌絲體及部分蛋白，過(guò)濾收率一般在90%左右。 青霉素易降解，發(fā)酵液及濾液應(yīng)冷卻至10 低溫保存，備后續(xù)提取精制。,通常發(fā)酵液中青霉素濃度很低，僅0.1%4.5%左右，而雜質(zhì)濃度比青霉素的高幾十倍甚至幾千倍。發(fā)酵液中常見(jiàn)的雜質(zhì)有：菌絲、未用完的培養(yǎng)基、易污染雜菌、產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物等。,.,32,提 取,溶媒萃取法 青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質(zhì)，在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)入有機(jī)溶媒中，調(diào)節(jié)pH，再轉(zhuǎn)入中性水相，反復(fù)幾次萃取，即可提純濃縮。 常用有機(jī)溶劑：醋酸丁酯（或戊酯）,.,33,提 取,溶媒萃取法 萃取2-3次。從發(fā)酵液萃取到醋酸丁酯時(shí)，pH選擇1.8-2.0，從醋酸丁酯反萃到水相時(shí)，pH選擇6.8-7.4。 發(fā)酵濾液與醋酸丁酯體積比3-4。 萃取總收率在85%左右。,.,34,青 霉 素 提 取,青霉素的提取遵循下面四個(gè)原則： 時(shí)間短 溫度低 pH