血紅蛋白作為催化劑高靈敏測定過氧化氫.ppt

血紅蛋白作為催化劑 高靈敏測定過氧化氫,報告人:劉立宇,本文采用血紅蛋白作為過氧化物酶的替代物，用于催化 H2O2 氧化對甲基酚的反應(yīng)體系。從而建立了高靈敏測定痕量 H2O2 的熒光分析法。,引言 痕量 H2O2 的測定不論是在臨床生物化學還是在環(huán)境化學中都有重要意義。酶法測定 H2O2 一般是基于過氧化物酶催化 H2O2 氧化底物的反應(yīng)來實現(xiàn)的。,本文用 Hb 作為催化劑催化 H2O2 氧化對甲基酚的反應(yīng)，建立了測定 H2O2 的高靈敏熒光分析方法。,實驗部分 儀器與試劑 實驗方法,儀器 RF-5301PC 熒光儀；SFM-25 熒光 儀 ；PH-3C 數(shù)字型精密酸度計；GS501 超級恒溫槽。 試劑 血紅蛋白生化試劑，配成110-5 mol/L的水溶液；對-甲酚(99%)移取105.6L,用二次蒸餾水稀釋至100mL，得110-2mol/L的儲備液；H2O2：移取0.1mL30%的分析純過氧化氫稀釋至100 mL，得1.06410-2 mol/L的儲備液 ，棕色瓶裝 ，冰箱保存，使用時依實驗需要進行稀釋 。所用其他試劑除注明外 ，均為分析試劑，所用水為二次蒸餾水。,在 10 mL 比色管中依次加入系列 H2O2 溶液；110-3 mol/L 對甲基酚 1.0 mL ；pH=10.3 的NH3-NH4Cl 緩沖溶液 3.0 mL；110-5 mol/L血紅蛋白 0.50 mL 。用二次水定容，混合均勻后，室溫放置 10min ，測定產(chǎn)物在激發(fā)波長 318nm ，發(fā)射波長 427nm 處的熒光強度。 ,結(jié)果與討論 體系的熒光光譜 血紅蛋白的催化活性比較 過氧化氫測定條件的選擇 分析方法特性 干擾情況 樣品測定,體系的熒光光譜,用血紅蛋白催化對甲基酚與H2O2的反應(yīng)得到的熒光產(chǎn)物為2,2 - 二羥基 4，4- 二甲基聯(lián)苯，其熒光的激發(fā)和發(fā)射光譜如圖1（a），最大激發(fā)和發(fā)射波長為ex / em =318nm/427nm 。 需要指出的是，血紅蛋白在本實驗條件下亦產(chǎn)生微弱的熒光，這是由于其分子中肽鏈上的色氨酸和酪氨酸所致。然而其最大激發(fā)和發(fā)射波長為ex / em =318nm/427nm（如圖1 b）對本體系只產(chǎn)生微弱的本底值 。,血紅蛋白的催化活性比較,基于血紅蛋白的上述結(jié)構(gòu)特點，我們研究了對甲基酚濃度對血紅蛋白催化反應(yīng)速率的影響情況。實驗結(jié)果顯示，當對甲基酚濃度較低時，其與反應(yīng)速率成正比，表現(xiàn)為一級反應(yīng)。隨著對甲基酚濃度的增高，表現(xiàn)為混合級反應(yīng)。當對甲基酚濃度大于310-4mol/L 時，反應(yīng)速率不再上升，此時反應(yīng)速率與對甲基酚濃度無關(guān)，表現(xiàn)為零級反應(yīng)。,血紅蛋白的催化活性比較,利用Linewear-Burk圖，由截距和斜率求得Vm = 1.6 min-1 ，K m = 8.7510-4mol/L，再由方程：Vm = Kcat E 0 求得酶催化的轉(zhuǎn)換數(shù) Kcat = 6.4106L/ molmin 。,血紅蛋白的催化活性比較,按同樣方法實驗測得了氯化血紅素和合成的環(huán)糊精-氯化血紅素（-CD-Hemin）等過氧化物模擬酶的 K m 、V m 和 K cat 值(表1)。比較發(fā)現(xiàn)，這3種鐵卟啉化合物對底物對甲基酚的催化氧化活性順序為 ： Hb -CD-HeminHemin,過氧化氫測定條件的選擇,酸度及氨濃度 對甲基酚濃度 血紅蛋白（Hb）的濃度,酸度及氨濃度 酸度是酶催化反應(yīng)需要用緩沖溶液嚴格控制的條件之一。我們比較了NH3-NH4Cl、甘氨酸-NaOH、硼砂-NaOH、NaHCO3及混合酸-NaOH等緩沖體系。發(fā)現(xiàn)在NH3-NH4Cl緩沖溶液中，當pH 10.3時產(chǎn)物的熒光強度最大。同時我們固定這一酸度實驗了NH3濃度對體系熒光強度的影響情況，結(jié)果顯示的最佳氨濃度是0.03mol/L。表明血紅蛋白的催化活性也可被氮配體（如NH3）所增強。,對甲基酚濃度 對甲基酚作為酶催化反應(yīng)的氫供體，濃度太低，將使反應(yīng)不完全而導致信號太弱；濃度太高，亦可使信號損失，并且造成浪費和環(huán)境污染。為此，本實驗選擇的對甲基酚濃度為110-4 mol/L。,血紅蛋白（Hb）的濃度 由于血紅蛋白是一熒光物質(zhì) ，盡管在本實驗選定的條件下熒光強度很弱，然而當其濃度太大時，會導致較大的空白值，并且造成浪費。當濃度很低時，在測定時間內(nèi)催化反應(yīng)不完全。實驗結(jié)果表明：當血紅蛋白濃度在 210-7 610-7 mol/L時，體系熒光強度最大且恒定 。 本實驗選擇510-7mol/L為最佳用量。,分析方法特性 按選擇的實驗條件測定了H2O2 ； 在3.1910-83.1910-6mol/L范圍內(nèi)，線性方程為F =26.83 + 28.59 H2O2 107mol/L,(r = 0.9990)，相對標準偏差（以5.3210-7mol/L為樣品11次測定結(jié)果）RSD = 2.1% 。檢出限按空白標準偏差（ n = 9）的3倍除以校準曲線的斜率，得8.8510-10 mol/L。,干擾情況 以1.110-6mol/L H2O2 的測定考察了不同干擾離子的影響，當要求相對誤5，外加離子的允許量（摩爾比）為：F 、SCN、NO3 、Br、PO43 、CO32 、Ba2+ 、Mo（V）、Cr3+（1000倍）；Al3+ 、Mg2 、Sn()（500倍），Hg2+ 、Ni2+ 、NO2（200倍），Ag+ 、Cu2+（100倍），D-葡萄糖、Fe3+（20倍）、Zn2（100倍），尿酸、Co2