河南科技學(xué)院常景玲第六章.ppt

,6.1 微生物發(fā)酵與制藥 6.2 微生物生長與生產(chǎn)的關(guān)系 6.3 制藥微生物生產(chǎn)菌種建立 6.4 培養(yǎng)基制備 6.5 滅菌工藝 6.6 發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù) 6.7 發(fā)酵工藝過程的控制 6.8 青霉素的生產(chǎn)工藝,第六章微生物發(fā)酵制藥工藝,青霉素的概述 生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性 發(fā)酵工藝過程 提煉工藝過程,6.8 青霉素的生產(chǎn)工藝,1929: Fleming在葡萄球菌培養(yǎng)皿中，污染的霉菌周圍出現(xiàn)透明的抑菌圈。 殺菌物質(zhì)，斷言太不穩(wěn)定，無法分離并用作藥物。 1939：牛津病理家Howard Florey化學(xué)家Ernst Chain,Norman Heatley。發(fā)酵瓶培養(yǎng)霉菌，培養(yǎng)里提取，測活性，青霉素結(jié)晶。,6.8.1 概述發(fā)現(xiàn)（1）,1940:8只鼠注射鏈球菌，提取物對4只治療。未經(jīng)治療鼠在24小時(shí)內(nèi)死亡，治療鼠存活數(shù)天至數(shù)周。 1941年2月開始治療第一批人類病人。 1943：威斯康辛大學(xué)小組，取得突破 生產(chǎn)菌表面培養(yǎng)：幾十個(gè)單位。 深層培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉：100U/ml。 X、UV誘變育種：10001500U/ml。 不產(chǎn)色素變種：6600070000U/ml 目前：85000U/ml。,細(xì)胞壁合成中的肽多糖合成的第三階段 肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽類似物 競爭性與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶不能催化多肽鏈之間的交聯(lián)。 生長中的細(xì)胞有效，靜止細(xì)胞無效 高效、安全的抗細(xì)菌感染藥物,6.8.1 概述作用機(jī)理（2）,（1）臨床抗感染治療：大多數(shù)革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性細(xì)菌及螺旋體等。 毒性小，但需要皮試。 （2）各種半合成抗生素的原料： 氨芐青霉素，磺芐青霉素，乙氧萘青霉素 頭孢菌素母核。,6.8.1 概述應(yīng)用（3）,6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic 6APA）苯乙酰衍生物。 側(cè)鏈基團(tuán)不同，形成不同的青霉素 G：芐基青霉素，C6H5CH2-CO-，為主 雙氫霉素F：戊青霉素 X：對羥芐基青霉素 F：2-戊烯基青霉素 K：庚青霉素 V：苯氧甲基青霉素 產(chǎn)品：鈉、鉀、普魯卡因、二芐基乙二胺,6.8.1概述分子結(jié)構(gòu)及衍生物（4）,產(chǎn)黃青霉：Penicilliumchrosogenum孢子:綠色和黃色 菌落：平坦或皺褶，圓形。 青霉穗:分生孢子鏈狀深層培養(yǎng)菌絲：球狀和絲狀兩種。,6.8.2 青霉素生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性,第1期：分生孢子萌發(fā)，具有小泡。 第2期：菌絲繁殖，嗜堿性，類脂肪小顆粒。 第3期：脂肪包涵體，貯藏物，嗜堿性很強(qiáng)。 第4期：空泡，嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。 第5期：大空泡，中性染色大顆粒，脂肪包涵體消失，青霉素產(chǎn)量最高。 第6期：個(gè)別細(xì)胞自溶，胞內(nèi)無顆粒，釋放氨，pH上升。 第7期：菌絲完全自溶，僅有空細(xì)胞壁。,發(fā)酵培養(yǎng)下的生長過程及細(xì)胞學(xué)變化,規(guī)定時(shí)間取樣，顯微鏡觀察7個(gè)時(shí)期的態(tài)變化，控制發(fā)酵。 14期為菌絲生長期，3期的菌體適宜種子。 45期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過工程措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。 第6期到來之前結(jié)束發(fā)酵。,鏡檢控制,青霉素生產(chǎn)流程框圖,斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng) 米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長7天，25 注意：每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測定效價(jià)及雜菌情況。,6.8.3 發(fā)酵工藝過程,一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。 培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等。 空氣流量1：3（體積比）；300-350rpm； pH自然，溫度271, 40h 二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10 培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。 1:1-1.5；250-280rpm；pH自然，251。10-14h 質(zhì)量：菌絲致密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h,2、種子罐培養(yǎng)工藝,三級罐：生產(chǎn)罐；接種量20 培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3, 玉米油, 硅油. 參數(shù)條件： 通氣量1：0.8-1.2；150-200r/min； 前60小時(shí):pH6.4-6.6，26； 60小時(shí)后: pH6.7, 24。,3、生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝,操作方式：反復(fù)分批式發(fā)酵 發(fā)酵罐：100M3，裝料80M3. 帶放: 6-10次，帶放量10，間隔24h。 發(fā)酵周期：180-220h,4、發(fā)酵培養(yǎng)與過程控制,青霉素的生產(chǎn)周期,發(fā)酵動(dòng)力學(xué),前40小時(shí)：培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物 40小時(shí)后：低速連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。 半饑餓狀態(tài)：延長合成期，提高產(chǎn)量。 碳源占成本12以上，采用糖化液流加,降低成本。 糖與6APA結(jié)合形成糖基-6APA，影響青霉素產(chǎn)量。,（1）過程控制補(bǔ)料分批操作 控制基質(zhì)濃度,根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。 葡萄糖的波動(dòng)范圍較窄，濃度過低使抗生素合成速度減慢或停止，過高則導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至引起自溶。 殘?zhí)?.3-0.6左右，pH開始升高時(shí)流加糖。 濃度：500kg/M3，流速:1.0-2.5kg/M3.h,流加碳源控制,玉米漿: 最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。 補(bǔ)加無機(jī)氮源：硫酸銨、氨水、尿素 氨基氮濃度：0.01-0.05%。,流加氮源控制,無機(jī)鹽：硫、磷、鎂、鉀等。 鐵對青霉素合成有毒，30-40 ug/ml以下。 罐壁涂環(huán)氧樹脂保護(hù)層。,鹽離子控制,時(shí)期：合成階段 種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸 毒性：抑制細(xì)胞生長和青霉素合成。 策略：低濃度流加 濃度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08% 控制：保持供應(yīng)速率略大于生物合成需要。,（2）添加青霉素側(cè)鏈前體,表面活性劑：新潔爾滅、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、單油酸酯、單月桂酸酯、三油酸酯 可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇 其他：剪切保護(hù)劑；分散劑,提高產(chǎn)量的其他物質(zhì)流加,適宜菌絲生長溫度30，分泌青霉素20。 20青霉素破壞少，周期很長。 變溫控制，不同階段不同溫度。 生長階段:較高溫度，縮短生長時(shí)間；生產(chǎn)階段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成。 前期控制26左右，后期降溫控制24,（3）溫度控制,合成適宜pH6.46.6左右，避免超過7.0 直接加酸或堿：自動(dòng)控制 流加葡萄糖：恒速；變速，依賴pH變化快慢。 pH下降：補(bǔ)加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量 pH上升：補(bǔ)加糖、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）,（4）pH控制,30飽和度，產(chǎn)率急劇下降； 10，造成不可逆的損害。 臨界溶氧濃度：30。 通氣比：1：0.81.5 。 適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧 調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速:各階段的生長和耗氧量不同。,（5）溶氧控制,天然油脂：玉米油； 化學(xué)消沫劑：泡敵。 策略：少量多次。 注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。,（6）消沫,青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活 水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定 易溶于有機(jī)溶劑，水中溶解度很小 青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物具有致敏性 防止降解，條件溫和、快速。,2.8.4 提煉工藝過程,青霉素的存在部位：發(fā)酵液 濃度較低：1030Kg/M3 含有大量雜質(zhì)：菌體細(xì)胞、核酸、雜蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產(chǎn)物等 目的：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過程。 預(yù)處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白,1、預(yù)處理,鼓式真空過濾機(jī)過濾： 一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋白質(zhì)含量0. 5-2.0%。 板框式過濾機(jī)過濾： 硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土為助慮劑。 二次濾液：澄清透明，用于提?。ㄊ章?0）,2、過濾,原理：青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而霉素鹽易溶于水。 萃取劑：青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。 工業(yè)上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。 除去蛋白質(zhì)：加0.05-0.1%乳化劑PPB。 萃?。?3次。,3、溶劑萃取,正相萃?。核峄痯H1.8-2.0，濾液：醋酸丁酯1：0.3，碟片式離心機(jī)分離（濃縮1.5-2.1） 反相萃?。簆H6.8-7.4（磷酸鹽、碳酸鹽緩沖液）。把青霉素從丁酯中提取到緩沖液中。 反復(fù)萃取23次，達(dá)到結(jié)晶要求。 萃取條件：10下。萃取罐冷凍鹽水冷卻。,逆流萃取過程,萃取液中添加活性炭，除去色素 過濾，除去活性炭。,4、脫色,加醋酸鈉乙醇溶液反應(yīng)：得到結(jié)晶鈉鹽。 加醋酸鉀乙醇溶液：得到青霉素鉀鹽。,5、結(jié)晶直接結(jié)晶,萃取液，再用0.5 M NaOH萃取 pH6.4-6.8下得到鈉鹽水濃縮液。 加3-4倍體積丁醇，16-26，真空0.67-1.3KPa）下蒸餾。 水和丁醇形成共沸物而蒸出。