直鏈淀粉,支鏈淀粉測(cè)定試劑盒

直鏈淀粉 /支鏈淀粉測(cè)定試劑盒 用于測(cè)定淀粉中的直鏈淀粉和支鏈淀粉含量 AMYL 11/99 簡(jiǎn)介 : 決定谷物淀粉最終的特殊用途取決于淀粉眾多特性中的直鏈淀粉 /支鏈淀粉比率，因此，對(duì)于淀粉加工企業(yè)，淀粉中直鏈淀粉含量是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)。 測(cè)定谷物淀粉中的直鏈淀粉通常采用電位測(cè)定法、糊化染色法或旋光分析法，即通過測(cè)定碘與直鏈淀粉結(jié)合生成直鏈淀粉 -碘復(fù)合物的方法來評(píng)估直鏈淀粉含量，然而由于支鏈淀粉 -碘復(fù)合物在此過程中同樣會(huì)形成，因此這些方法的準(zhǔn)確性常遭到質(zhì)疑。利用非比色方法測(cè)定游離碘離子的減少和通過比色測(cè)定直鏈 淀粉 -碘復(fù)合物的方法會(huì)導(dǎo)致高估直鏈淀粉的含量，是用此方法可能出現(xiàn)的更多問題請(qǐng)參考 Gibson et al11。 目前， 國(guó)際上普遍采用結(jié)果更加準(zhǔn)確的利用 伴刀豆凝集素 A(Con A)沉降支鏈淀粉 ，然后測(cè)定直鏈淀粉含量的方法，在特定的溫度、 pH和離子強(qiáng)度下， Con A可以特定的連接含 吡喃葡萄糖 基a-D-glucosepyranosyl或 吡喃甘露 基 a-D-mannopyranosyl的支鏈多聚糖，因此會(huì)優(yōu)先于直鏈淀粉與支鏈淀粉形成沉淀 復(fù)合物。 原理 : 加入二甲基亞砜 (DMSO)的淀粉樣品通過加熱被完全溶解，乙醇洗脫樣品中的油脂，回收洗滌后的淀粉樣品，并用醋酸 /鈉鹽溶液溶解，加入 Con A后支鏈淀粉被特異性的沉降，離心分離支鏈淀粉，保存于懸浮液中的直鏈淀粉被酶水解生成葡萄糖，利用葡萄糖氧化酶 /過氧化物酶測(cè)定葡萄糖的含量。溶解于醋酸 /鈉鹽溶液中的總淀粉同樣可以被水解成葡萄糖，并利用萄糖氧化酶 /過氧化物酶測(cè)定葡萄糖。在 510nm測(cè)定利用 Con A沉降后懸浮液中 GOPOD吸光度的比率變化來計(jì)算直鏈淀粉的濃度，同樣道理可計(jì)算出總淀粉濃度。 此方 法適用于所有的 純凈淀粉樣品 和 谷物面粉。 精確性 : 對(duì)于純凈淀粉和 10%的谷物面粉，批內(nèi)偏差 12,000 U/升 過氧化物酶 650 U/升 4-氨基安替比林 0.4 mM 穩(wěn)定性： 4C保存， 2-3個(gè)月或 -20C保存， 12個(gè)月 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（ 100g/0.1ml；保存于 0.2%的苯甲酸中），室溫保存 5年。 淀粉參考標(biāo)樣 瓶簽上標(biāo)注有直鏈淀粉含量 緩沖液（試劑盒中未提供） 1. 醋酸鈉緩沖液 (100mM, pH 4.5) 5.9ml冰醋酸 (,1.05g/ml)加入 900ml蒸餾水，用 1M NaOH(4g/100ml)調(diào)節(jié) pH到 4.5（大約需要 30ml），然后加入疊氮化鈉 (0.2g)并補(bǔ)液至1L。室溫中保存。 注意： 疊氮化鈉是一種有毒化學(xué)物質(zhì)應(yīng)妥善保存。疊氮化鈉是葡萄糖緩沖液穩(wěn)定劑，稀釋操作過程中必須帶防護(hù)手套進(jìn)行操作。 二甲基亞砜對(duì)皮膚具有刺激性，應(yīng)謹(jǐn)慎使用。 2. 濃縮 Con A緩沖液 (pH 6.4, 600mM) 無水醋酸鈉 (BDH Cat No: 10236) -49.2g 氯化鈉 (BDH Cat. No: 10241)- 175.5g CaCl2.2H2O (Mallinckrodt Cat. No: 4160)-0.5g MgCl2.6H2O (BDH Cat. No: 10149) -0.7g MnCl2.4H2O (Ajax Cat. No: 307) -0.7g 將上述試劑溶解于 900ml蒸餾水中，滴加冰醋酸調(diào)節(jié) pH到 6.4，用蒸餾水補(bǔ)液至 1L， 4C保存。 注意： 調(diào)節(jié) pH時(shí)必須謹(jǐn)慎小心，如果該溶液的 pH低于 6.4，將會(huì)產(chǎn)生沉淀物，重新調(diào)節(jié) pH沉淀物不會(huì)再溶解，因此，必須重新配置新的溶液。 3. Con A緩沖液 (工作液 ): 使用當(dāng)天，用 100ml蒸餾水稀釋 30ml濃縮 Con A緩沖液。 4. 二甲基亞砜 (DMSO) 分析純?cè)噭?(BDH Analar Cat. No: 10323) 設(shè)備 : 1. 玻璃器具 -試管 (圓底 ； 16x120 mm, 15ml) -容量瓶 (25ml) -螺口戴帽樣品管 (10ml) 2. 離心機(jī)（ 2,000g） 3. 微量移液器 (50-1000l). 4. 連續(xù)分配器 5. 分析天平 . 6. 分光光度計(jì) 510 nm. 7. 漩渦混合器 8. 定時(shí)鐘 9. 沸水浴鍋 10. 微量離心機(jī)（ 14,000g） 11. 控溫水浴箱（ 40C） 12. 微量離心管 (2.0ml) 注意事項(xiàng) 1、淀粉樣品必須用乙醇進(jìn)行處理以去除油脂，如果樣品不能用乙醇處理，樣品中的直鏈淀粉含量可能會(huì)被低估 50% 實(shí)驗(yàn)步驟 A. 淀粉前處理 1、 準(zhǔn)確稱取淀粉和面粉樣品 20-25mg，加入到螺口試管中，記錄樣品重量（精確到 0.1mg）。 注意： 每批試驗(yàn)必須包括參考標(biāo)樣 每第五個(gè)樣品設(shè)定重復(fù)管 2、 加入 1ml的 DMSO，用漩渦混合器低速的輕輕振蕩，蓋住試管帽在沸水中加熱直到完全溶解（大約 1分鐘），確保沒有凝膠塊殘留。 3、 用漩渦混合器高速混合，再次將試管置于沸水浴鍋中加熱 15分鐘，并間斷性的用漩渦混合器高速混合。 4、 室溫下放置大約 5分鐘，加入 2ml乙醇（ 95%），漩渦混合器混合，并再次加入乙醇 4ml，振蕩，將形成淀粉沉淀物，靜置試管 15分鐘（或過夜）。 5、 離心 5分鐘（ 2,000g），棄去懸浮液，并用吸水紙吸干試管中的液體，確保去除所有的乙醇溶液。 6、 加入 2ml的 DMSO，用漩 渦混合器低速振蕩，沸水浴鍋中加熱15分鐘，并間斷性的混合，以避免凝膠形成。 7、 加入 4ml稀釋的的 Con A緩沖液（工作液），混合均勻，然后轉(zhuǎn)移到 25ml的容量瓶中，并用 Con A緩沖液反復(fù)沖洗試管并一同加入容量瓶中，用 Con A緩沖液定溶至刻度線。（ 此溶液為溶液1） 注意： 必須在 60分鐘之內(nèi)對(duì)此溶液進(jìn)行測(cè)定。 B. 用 Con A沉淀支鏈淀粉，并測(cè)定直鏈淀粉 1、 取 1ml 溶液 1到 2.0ml的微量離心管中，加入 0.50ml的 Con A緩沖液 (4mg/ml)，蓋緊試管，輕輕的反復(fù)顛倒混合， 避免樣品起泡 。 2、 在室溫中靜 置 1小時(shí)， 20C下離心 10分鐘（ 14,000g）。 3、 轉(zhuǎn)移 1ml的上層液到 15ml的離心管中，加入 3ml的醋酸鈉緩沖液（ 100mM； pH 4.5），輕輕的蓋住試管蓋，在沸水中加熱 5分鐘。 4、 將試管置于 40C的水浴箱中孵育 5分鐘，加入 0.1ml的淀粉葡萄糖苷酶 / -淀粉酶，并繼續(xù)在 40C的水浴箱中孵育 30分鐘，2,000g下離心 5分鐘。 5、 加入 4ml 的 GOPOD試劑，在 40C下孵育 20分鐘，同時(shí)孵育空白對(duì)照和葡萄糖質(zhì)控。 6、 相對(duì)于空白對(duì)照在 510nm下讀取每個(gè)樣品和葡萄糖質(zhì)控的吸光度值。 注意： 空白對(duì)照 ： 1.0ml醋酸那緩沖液 +4ml 的 GOPOD試劑，在 40C下孵育 20分鐘 葡萄糖質(zhì)控： 0.1ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 (1mg/ml)+0.9ml醋酸那緩沖液+4ml 的 GOPOD試劑，在 40C下孵育 20分鐘 C. 測(cè)定總淀粉 1、 取 0.5ml 溶液 1，加入 4ml的醋酸鈉緩沖液（ 100mM； pH 4.5）。 2、 加入 0.1ml的淀粉葡萄糖苷酶 / -淀粉酶，在 40C的水浴箱中孵育 10分鐘。 3、 轉(zhuǎn)移 1.0ml（兩份）到測(cè)定試管中，加入 4ml 的 GOPOD試劑，在 40C下孵育 20分鐘，同時(shí)孵育空白對(duì)照和葡萄糖質(zhì)控。 計(jì)算直鏈淀粉含量（ %） Con A懸浮液吸光度 6.15 100 直鏈淀粉 ,% = x x 總淀粉吸光度 9.2 1 Con A懸浮液吸光度 = x 66.8 總淀粉吸光度 注釋： 6.15和 9.2分別代表 Con A和總淀粉在提取時(shí)的稀釋系數(shù) 注意 : 1、 加入 Con A緩沖液的樣品（如：在試驗(yàn)步驟 A中的 溶液 1）中的直鏈淀粉有衰退和沉淀傾向，因此不能放置過長(zhǎng)時(shí)間。 2、 為了達(dá)到 Con A沉淀 支鏈淀粉的效果必須在室溫中放置 60分鐘（步驟 B1），但是不能超過 120分鐘，因?yàn)橹辨湹矸塾兴ネ藘A向。 3、 利用乙醇可去除樣品中可溶性的糖，因?yàn)榭扇苄缘奶菚?huì)干擾試驗(yàn)。 參考文獻(xiàn) : 2. Juliano, B.O. (1971) Cereal Sci.Today 16, 334-338, 340, 360. 3. Berry, C.S., lAnson, K., Miles, M.J., Morris,V.J. and Russel, P.L.J. (1988) Cereal Sci. 8, 203-206. 4. Sievert, D. and Pomeranz,Y. (1989) Cereal Chem. 66, 342-347. 5. Tester, R.F. and Morrison,W.R. (1990) Cereal Chem. 67, 551-557. 6. Leloup,V.M., Colonna, P. and Buleon,A. (1991) J. Cereal Sci. 13, 1-13. 7. Matheson, N.K. (1971) Phytochem. 10, 3213-3219. 8. Morrison,W.R. and Laignet, B. (1983) J. Cereal Sci. 1, 9-20. 9. Knutson, C.A. (1986) Cereal Chem. 63, 89-92. 10. Chrastil, J. (1987) Carbohydr. Res. 159, 154-158. 11. International Organisation for Standardisation (1987) ISO 6647:1987E. Rice: determination of amylose content. 12. Gibson,T.S., Solah,V.A. and McCleary, B.V. (1996) “A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with Con A.” J. Cereal Science, 25, 111-119. 13. Matheson