高效液相色譜儀操作步驟.doc

高效液相色譜儀操作步驟 1. 過濾流動(dòng)相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。 2. 對(duì)抽濾后的流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。 3. 打開HPLC工作站（包括計(jì)算機(jī)軟件和色譜儀），連接好流動(dòng)相管道，連接檢測系統(tǒng)。 4. 進(jìn)入HPLC控制界面主菜單，點(diǎn)擊manual，進(jìn)入手動(dòng)菜單。 5. 有一段時(shí)間沒用，或者換了新的流動(dòng)相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進(jìn)樣閥，需要在manual菜單下，先點(diǎn)擊purge，再點(diǎn)擊start，沖洗時(shí)速度不要超過10ml/min。 6. 調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動(dòng)相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點(diǎn)擊injure，選用合適的流速，點(diǎn)擊on，走基線，觀察基線的情況。 7. 設(shè)計(jì)走樣方法。點(diǎn)擊file，選取select users and methods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個(gè)新的方法，點(diǎn)擊new method。選取需要的配件，包括進(jìn)樣閥，泵，檢測器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點(diǎn)擊protocol。一個(gè)完整的走樣方法需要包括：a.進(jìn)樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進(jìn)樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時(shí)間，隨不同的樣品而不同。 8. 進(jìn)樣和進(jìn)樣后操作。選定走樣方法，點(diǎn)擊start。進(jìn)樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點(diǎn)擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標(biāo)記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。 9. 關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)液相色譜。 10. 登記。一、 問:用HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移，有時(shí)發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？ 答:關(guān)于漂移問題： 1 溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定 2 流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等 3 柱子未平衡好，需對(duì)柱子進(jìn)行更長時(shí)間的平衡 關(guān)于快速變化問題 1 流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定 2 泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。 3 流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合 二、問:液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？ 答: 1 篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。 2 存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子 三、問：HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法 答: 1 樣品量不足，解決辦法為增加樣品量 2 樣品未從柱子中流出。可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子 3 樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器 4 檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。 5 檢測器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù) 6 檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。 7 檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。 8 記錄儀測壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。 9 流動(dòng)相流量不合適。調(diào)整流速即可。 10 檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。 四、問：做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？ 答：原因可能有： 1 泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理； 2 比例閥失效，更換比例閥即可； 3 泵密封墊損壞，更換密封墊即可； 4 溶劑中的氣泡，解決的辦法是對(duì)溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法； 5 系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可； 6 梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。 五、問：我購買的HPLC柱驗(yàn)收測試時(shí)柱壓過高，請問為什么？ 答：柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。 1 拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查； 2 把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查； 3 將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查； 4 更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。 一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne 7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。Agilent1100液相基本操作步驟(一)、開機(jī)： 1、打開計(jì)算機(jī),進(jìn)入Windows NT （或Windows 2000）畫面,并運(yùn)行Bootp Server程序。 2、打開 1100 LC 各模塊電源。 3、待各模塊自檢完成后，雙擊Instrument 1 Online圖標(biāo)，化學(xué)工作站自動(dòng)與1100LC 通訊，進(jìn)入的工作站畫面如下所示。 4、從“View”菜單中選擇“Method and Run control”畫面, 單擊”View”菜單中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“”標(biāo)志，來調(diào)用所需的界面。 5、把流動(dòng)相放入溶劑瓶中。 6、打開Purge閥。 7、單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Setup pump選項(xiàng)，進(jìn)入泵編輯畫面。 8 、設(shè)Flow：5ml/min，單擊OK。 9、單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Pump control選項(xiàng)，選中On，單擊OK，則系統(tǒng)開始Purge，直到管線內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止,切換通道繼續(xù)Purge，直到所有要用通道無氣泡為止。 10、單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Pump Control選項(xiàng)，選中Off，單擊Ok關(guān)泵， 關(guān)閉Purge valve。 11、單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Setup pump選項(xiàng)，進(jìn)入Pump編輯畫面，設(shè)Flow：1.0ml/min。 12、單擊泵下面的瓶圖標(biāo)，如圖所示（以二元泵為例），輸入溶劑的實(shí)際體積和瓶體積。也可輸入停泵的體積。單擊Ok。（二）數(shù)據(jù)采集方法編輯： 1、開始編輯完整方法： 從“Method”菜單中選擇“Edit entire method” 項(xiàng)，如上圖所示選中除“Data analysis ”外的三項(xiàng)，單擊Ok，進(jìn)入下一畫面。 2、方法信息： 在“Method Comments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。 單擊Ok 進(jìn)入下一畫面。3、泵參數(shù)設(shè)定：（以二元泵為例） 在“Flow”處輸入流量,如1ml/min，在“Solvent B”處輸入70.0,(A=100-B) ,也可Insert 一行”Timetable” ,編輯梯度。在“Pressure Limits Max”處輸入柱子的最大耐高壓，以保護(hù)柱子。 單擊Ok進(jìn)入下一畫面。4、自動(dòng)進(jìn)樣器參數(shù)設(shè)定: 選擇合適的進(jìn)樣方式, 如圖所示，進(jìn)樣體積 1.0ul ,洗瓶位置為6號(hào)。“Standard Injection”-只能輸入進(jìn)樣體積，此方式無洗針功能?！癐njection with Needle Wash”-可以輸入進(jìn)樣體積和洗瓶位置，此方式針從樣品瓶抽完樣品后，會(huì)在洗瓶中洗針?！癠se injector program”-可以點(diǎn)擊Edit 鍵進(jìn)行進(jìn)樣程序編輯。 點(diǎn)擊Ok進(jìn)入下一畫面。5、柱溫箱參數(shù)設(shè)定: 在”Temperature”下面的方框內(nèi)輸入所需溫度,并選中它,點(diǎn)擊”more” 鍵,如圖所示,選中”Same as left”-使柱溫箱的溫度左右一致。 點(diǎn)擊ok進(jìn)入下一畫面。6、VWD檢測器參數(shù)設(shè)定: 在”Wavelength”下方的空白處輸入所需的檢測波長,如254nm, 在”Peak width (Response time)”下方點(diǎn)擊下拉式三角框,選擇合適的響應(yīng)時(shí)間, 如0.1min (2s)。 在Timetable 中可以“Insert”一行，輸入隨時(shí)間切換的波長，如1min ，波長=300nm。點(diǎn)擊ok進(jìn)入下一畫面。 7、DAD檢測器參數(shù)設(shè)定: 檢測波長: 254nm,BW=30nm, 參比波長=350nm,BW=100nm; 檢測波長：一般選擇最大吸收處的波長。樣品帶寬BW： 一般選擇最大吸收值一半處的整個(gè)寬度。參比波長：一般選擇在靠近樣品信號(hào)的無吸收或低吸收區(qū)域。參比帶寬BW：至少要與樣品信號(hào)的帶寬相等，許多情況下用100nm作為缺省值。Peak width（Response time）：其值盡可能接近要測的窄峰峰寬。Slit狹縫窄，光譜分辨率高；寬時(shí)，噪音低。同時(shí)可以輸入采集光譜方式，步長，范圍，閾值。選中所用的燈。 點(diǎn)擊Ok進(jìn)入下一畫面。8、 RID檢測器參數(shù)設(shè)定: 色譜條件: 進(jìn)樣體積: 20ul 。 光學(xué)單元溫度: Off 。 極性: 正 。 峰寬(響應(yīng)時(shí)間) : 4s 。 如圖所示: “Optical Unit Temperature”-若環(huán)境溫度控制在2,設(shè)定為Off, 若環(huán)境溫度不穩(wěn)定,則設(shè)定光學(xué)單元溫度為高于環(huán)境溫度5度,以防樣品在池中沉淀。“Peak width”-大多數(shù)分析設(shè)為4S，只有在高速分析下設(shè)為更短。“Automatic recycling after analysis”-在不進(jìn)行分析時(shí)可以讓流動(dòng)相循環(huán)，節(jié)省流動(dòng)相，檢測器連續(xù)運(yùn)行，可隨時(shí)投入使用。 * 點(diǎn)擊RID圖標(biāo)，選擇RID Control ：Heater 設(shè)為On，若要循環(huán)流動(dòng)相，必須將“Recycling Valve”設(shè)為ON。手動(dòng)purge 參比池，將其設(shè)為On，并輸入Purge 時(shí)間。 9、 FLD檢測器參數(shù)設(shè)定: 色譜條件： 樣品：P/N 01018-68704 用甲醇稀釋為1:10。 進(jìn)樣體積：5ul。 柱溫箱: 30 。 EX=246nm, EM=317nm ,PMT=10。 響應(yīng)時(shí)間=4s. 停止時(shí)間： 出峰完畢。 Excitation A: 激發(fā)波長:200-700nm,步長為1nm,或Zero Order。 Emission: 發(fā)射波長: 280-900nm, 步長為1nm,或Zero Order。 PMT: 大多數(shù)應(yīng)用適當(dāng)?shù)脑O(shè)定值為10,若高濃度樣品峰被切平頭,則減少 PMT 值。 “Peak width”：大多數(shù)應(yīng)用設(shè)為4s，只有快速分析采用小的設(shè)定值。 Multi Ex ： 多波長及光譜（激發(fā)）。 Multi Em：多波長及光譜（發(fā)射）。 同時(shí)可以輸入范圍Range、步長step、采集光譜。10、 在“ Run time checklist ”中選中“Data acquisition”，單擊Ok。11、 單擊“Method”菜單，選中“Save method as”，輸入一方法名，如“test”，單擊Ok。12、 從菜單 “View”中選中”O(jiān)nline signal” ,選中Windows 1,然后單擊Change 鈕,將所要繪圖的信號(hào)移到右邊的框中,點(diǎn)擊Ok.(如同時(shí)檢測二個(gè)信號(hào),則重復(fù)12,選中Windows 2)。13、 從“Run control ”菜單中選擇“Sample info”選項(xiàng)，如上圖所示，輸入操作者名稱，在“Data file ”中選擇“Manual”或“Prefix”。區(qū)別: Manual-每次做樣之前必須給出新名字,否則儀器會(huì)將上次的數(shù)據(jù)覆蓋掉。 Prefix在Prefix 框中輸入前綴，在Counter 框中輸入計(jì)數(shù)器的起始位，儀器會(huì)自動(dòng)命名，如vwd0001，vwd0002。14、 從Instrument 菜單選擇System on。15、 等儀器Ready，基線平穩(wěn)，從Method菜單中選擇“Run method”，進(jìn)樣。（DAD, VWD色譜圖如下所示：）（三）、數(shù)據(jù)分析方法編輯:1、 從“View”菜單中，單擊“Data analysis”進(jìn)入數(shù)據(jù)分析畫面。2、 從“File”菜單選擇“Load signal”，選中您的數(shù)據(jù)文件名，如下圖所示。單擊Ok。3、 做譜圖優(yōu)化,從“Graphics”菜單中選擇“Signal options”選項(xiàng)，。從Ranges中選擇Auto scale及合適的顯示時(shí)間，單擊ok,或選擇”Use Ranges” 調(diào)整。反復(fù)進(jìn)行，直到圖的比例合適為止。4、積分: (1)、從“Integration”中選擇 “Auto integrate”,如積分結(jié)果不理想,再從菜單中選擇“Integration Events”選項(xiàng)，選擇合適的Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。 (2)、從“Integration”菜單中選擇“Integrate”選項(xiàng)， 則數(shù)據(jù)被積分。 (3)、如積分結(jié)果不理想，則修改相應(yīng)的積分參數(shù)，直到滿意為止。 (4)、單擊左邊“”圖標(biāo)，將積分參數(shù)存入方法。 5、打印報(bào)告: (1)、從“Report”菜單中選擇“Specify report”選項(xiàng)，進(jìn)入如上畫面。(2)、單擊“Q