高效液相色譜儀操作步驟.doc

高效液相色譜儀操作步驟 1. 過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。 2. 對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。 3. 打開HPLC工作站（包括計算機軟件和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。 4. 進入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。 5. 有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進樣閥，需要在manual菜單下，先點擊purge，再點擊start，沖洗時速度不要超過10ml/min。 6. 調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點擊injure，選用合適的流速，點擊on，走基線，觀察基線的情況。 7. 設計走樣方法。點擊file，選取select users and methods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點擊new method。選取需要的配件，包括進樣閥，泵，檢測器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點擊protocol。一個完整的走樣方法需要包括：a.進樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進樣閥的loading-inject轉換；d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。 8. 進樣和進樣后操作。選定走樣方法，點擊start。進樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。 9. 關機時，先關計算機，再關液相色譜。 10. 登記。一、 問:用HPLC進行分析時保留時間有時發(fā)生漂移，有時發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？ 答:關于漂移問題： 1 溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定 2 流動相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應等 3 柱子未平衡好，需對柱子進行更長時間的平衡 關于快速變化問題 1 流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設定流速，使之保持穩(wěn)定 2 泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。 3 流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內(nèi)進行適當混合 二、問:液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？ 答: 1 篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。 2 存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子 三、問：HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法 答: 1 樣品量不足，解決辦法為增加樣品量 2 樣品未從柱子中流出。可根據(jù)樣品的化學性質(zhì)改變流動相或柱子 3 樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器 4 檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。 5 檢測器時間常數(shù)太大。解決辦法為降低時間參數(shù) 6 檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。 7 檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。 8 記錄儀測壓范圍不當。調(diào)整電壓范圍即可。 9 流動相流量不合適。調(diào)整流速即可。 10 檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。 四、問：做HPLC分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？ 答：原因可能有： 1 泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進行脫氣處理； 2 比例閥失效，更換比例閥即可； 3 泵密封墊損壞，更換密封墊即可； 4 溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法； 5 系統(tǒng)檢漏，找出漏點，密封即可； 6 梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。 五、問：我購買的HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問為什么？ 答：柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。 1 拆去保護預柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查； 2 把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查； 3 將柱子的進出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查； 4 更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。 一般情況下，在進樣器與保護柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne 7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。Agilent1100液相基本操作步驟(一)、開機： 1、打開計算機,進入Windows NT （或Windows 2000）畫面,并運行Bootp Server程序。 2、打開 1100 LC 各模塊電源。 3、待各模塊自檢完成后，雙擊Instrument 1 Online圖標，化學工作站自動與1100LC 通訊，進入的工作站畫面如下所示。 4、從“View”菜單中選擇“Method and Run control”畫面, 單擊”View”菜單中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“”標志，來調(diào)用所需的界面。 5、把流動相放入溶劑瓶中。 6、打開Purge閥。 7、單擊Pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設定菜單，單擊Setup pump選項，進入泵編輯畫面。 8 、設Flow：5ml/min，單擊OK。 9、單擊Pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設定菜單，單擊Pump control選項，選中On，單擊OK，則系統(tǒng)開始Purge，直到管線內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止,切換通道繼續(xù)Purge，直到所有要用通道無氣泡為止。 10、單擊Pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設定菜單，單擊Pump Control選項，選中Off，單擊Ok關泵， 關閉Purge valve。 11、單擊Pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設定菜單，單擊Setup pump選項，進入Pump編輯畫面，設Flow：1.0ml/min。 12、單擊泵下面的瓶圖標，如圖所示（以二元泵為例），輸入溶劑的實際體積和瓶體積。也可輸入停泵的體積。單擊Ok。（二）數(shù)據(jù)采集方法編輯： 1、開始編輯完整方法： 從“Method”菜單中選擇“Edit entire method” 項，如上圖所示選中除“Data analysis ”外的三項，單擊Ok，進入下一畫面。 2、方法信息： 在“Method Comments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。 單擊Ok 進入下一畫面。3、泵參數(shù)設定：（以二元泵為例） 在“Flow”處輸入流量,如1ml/min，在“Solvent B”處輸入70.0,(A=100-B) ,也可Insert 一行”Timetable” ,編輯梯度。在“Pressure Limits Max”處輸入柱子的最大耐高壓，以保護柱子。 單擊Ok進入下一畫面。4、自動進樣器參數(shù)設定: 選擇合適的進樣方式, 如圖所示，進樣體積 1.0ul ,洗瓶位置為6號?！癝tandard Injection”-只能輸入進樣體積，此方式無洗針功能?！癐njection with Needle Wash”-可以輸入進樣體積和洗瓶位置，此方式針從樣品瓶抽完樣品后，會在洗瓶中洗針?！癠se injector program”-可以點擊Edit 鍵進行進樣程序編輯。 點擊Ok進入下一畫面。5、柱溫箱參數(shù)設定: 在”Temperature”下面的方框內(nèi)輸入所需溫度,并選中它,點擊”more” 鍵,如圖所示,選中”Same as left”-使柱溫箱的溫度左右一致。 點擊ok進入下一畫面。6、VWD檢測器參數(shù)設定: 在”Wavelength”下方的空白處輸入所需的檢測波長,如254nm, 在”Peak width (Response time)”下方點擊下拉式三角框,選擇合適的響應時間, 如0.1min (2s)。 在Timetable 中可以“Insert”一行，輸入隨時間切換的波長，如1min ，波長=300nm。點擊ok進入下一畫面。 7、DAD檢測器參數(shù)設定: 檢測波長: 254nm,BW=30nm, 參比波長=350nm,BW=100nm; 檢測波長：一般選擇最大吸收處的波長。樣品帶寬BW： 一般選擇最大吸收值一半處的整個寬度。參比波長：一般選擇在靠近樣品信號的無吸收或低吸收區(qū)域。參比帶寬BW：至少要與樣品信號的帶寬相等，許多情況下用100nm作為缺省值。Peak width（Response time）：其值盡可能接近要測的窄峰峰寬。Slit狹縫窄，光譜分辨率高；寬時，噪音低。同時可以輸入采集光譜方式，步長，范圍，閾值。選中所用的燈。 點擊Ok進入下一畫面。8、 RID檢測器參數(shù)設定: 色譜條件: 進樣體積: 20ul 。 光學單元溫度: Off 。 極性: 正 。 峰寬(響應時間) : 4s 。 如圖所示: “Optical Unit Temperature”-若環(huán)境溫度控制在2,設定為Off, 若環(huán)境溫度不穩(wěn)定,則設定光學單元溫度為高于環(huán)境溫度5度,以防樣品在池中沉淀。“Peak width”-大多數(shù)分析設為4S，只有在高速分析下設為更短?！癆utomatic recycling after analysis”-在不進行分析時可以讓流動相循環(huán)，節(jié)省流動相，檢測器連續(xù)運行，可隨時投入使用。 * 點擊RID圖標，選擇RID Control ：Heater 設為On，若要循環(huán)流動相，必須將“Recycling Valve”設為ON。手動purge 參比池，將其設為On，并輸入Purge 時間。 9、 FLD檢測器參數(shù)設定: 色譜條件： 樣品：P/N 01018-68704 用甲醇稀釋為1:10。 進樣體積：5ul。 柱溫箱: 30 。 EX=246nm, EM=317nm ,PMT=10。 響應時間=4s. 停止時間： 出峰完畢。 Excitation A: 激發(fā)波長:200-700nm,步長為1nm,或Zero Order。 Emission: 發(fā)射波長: 280-900nm, 步長為1nm,或Zero Order。 PMT: 大多數(shù)應用適當?shù)脑O定值為10,若高濃度樣品峰被切平頭,則減少 PMT 值。 “Peak width”：大多數(shù)應用設為4s，只有快速分析采用小的設定值。 Multi Ex ： 多波長及光譜（激發(fā)）。 Multi Em：多波長及光譜（發(fā)射）。 同時可以輸入范圍Range、步長step、采集光譜。10、 在“ Run time checklist ”中選中“Data acquisition”，單擊Ok。11、 單擊“Method”菜單，選中“Save method as”，輸入一方法名，如“test”，單擊Ok。12、 從菜單 “View”中選中”O(jiān)nline signal” ,選中Windows 1,然后單擊Change 鈕,將所要繪圖的信號移到右邊的框中,點擊Ok.(如同時檢測二個信號,則重復12,選中Windows 2)。13、 從“Run control ”菜單中選擇“Sample info”選項，如上圖所示，輸入操作者名稱，在“Data file ”中選擇“Manual”或“Prefix”。區(qū)別: Manual-每次做樣之前必須給出新名字,否則儀器會將上次的數(shù)據(jù)覆蓋掉。 Prefix在Prefix 框中輸入前綴，在Counter 框中輸入計數(shù)器的起始位，儀器會自動命名，如vwd0001，vwd0002。14、 從Instrument 菜單選擇System on。15、 等儀器Ready，基線平穩(wěn)，從Method菜單中選擇“Run method”，進樣。（DAD, VWD色譜圖如下所示：）（三）、數(shù)據(jù)分析方法編輯:1、 從“View”菜單中，單擊“Data analysis”進入數(shù)據(jù)分析畫面。2、 從“File”菜單選擇“Load signal”，選中您的數(shù)據(jù)文件名，如下圖所示。單擊Ok。3、 做譜圖優(yōu)化,從“Graphics”菜單中選擇“Signal options”選項，。從Ranges中選擇Auto scale及合適的顯示時間，單擊ok,或選擇”Use Ranges” 調(diào)整。反復進行，直到圖的比例合適為止。4、積分: (1)、從“Integration”中選擇 “Auto integrate”,如積分結果不理想,再從菜單中選擇“Integration Events”選項，選擇合適的Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。 (2)、從“Integration”菜單中選擇“Integrate”選項， 則數(shù)據(jù)被積分。 (3)、如積分結果不理想，則修改相應的積分參數(shù)，直到滿意為止。 (4)、單擊左邊“”圖標，將積分參數(shù)存入方法。 5、打印報告: (1)、從“Report”菜單中選擇“Specify report”選項，進入如上畫面。(2)、單擊“Q