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HPV的分型檢測及相關(guān)介紹 內(nèi)容 宮頸癌與HPV HPV分型檢測的意義 HPV檢測相關(guān)產(chǎn)品介紹 一 宮頸癌與HPV 1 1宮頸癌的概況 宮頸癌是目前威脅女性健康的主要疾病 在全世界范圍內(nèi)也是導(dǎo)致女性死亡的第二大癌癥 世界上每2分鐘就有一位婦女死于宮頸癌 我國宮頸癌兩率很高 屬于最嚴(yán)重的腫瘤之一 每年有15萬新發(fā)病例 每年約有10萬名婦女死于宮頸癌 發(fā)病年齡一般在40 60歲 與公共衛(wèi)生狀況直接相關(guān) 上世紀(jì)70年代末 HaraldzurHausen首先提出人乳頭瘤病毒 HPV 可能是宮頸癌的致癌病毒 1 2宮頸癌與HPV的研究歷程 1977年 Laverty在電鏡中觀察到宮頸癌活檢組織中存在人乳頭瘤病毒顆粒 1989年左右 KeertiShah等發(fā)現(xiàn)99 7 的宮頸癌與HPV感染有關(guān) 證實了宮頸癌與HPV感染有直接關(guān)系 HPV的感染使宮頸癌的相對危險性增加250倍 1995年國際癌癥研究機構(gòu) IARC 專題討論會通過 HPV感染是宮頸癌的主要原因 2005年IARC WHO推薦HPV檢測可以用于宮頸癌篩查 2008年10月6日公布HaraldzurHausen獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎 哈拉爾德 楚爾 豪森 1 3宮頸癌的致病因素 主要致病因素 高危型HPV的持續(xù)感染 性接觸傳播 丈夫陰莖HPV的存在可使妻子宮頸受染的危險增加9倍 相同的HPV型別可以在性伴侶中檢出 與此相反 處女通常是檢測不到HPV感染 非性直接接觸感染 通過接觸病變部位及病人分泌物感染 間接接觸 通過病人的衣物和用品感染 母嬰傳播 在分娩過程中通過產(chǎn)道直接接觸傳播 還可以通過血液 羊水及胎盤傳播 或者可能通過嬰兒出生后與攜帶HPV的母親密切接觸傳染 1 4HPV的傳播途徑 高危人群 性行為 過早 過頻 多性伴月經(jīng)及分娩因素 經(jīng)期衛(wèi)生不良 經(jīng)期延長 早婚 早育 多產(chǎn) 密產(chǎn)等性傳播疾病導(dǎo)致的宮頸炎癥對宮頸的長期刺激 吸煙 攝入尼古丁降低機體的免疫力 影響對HPV感染的清除 導(dǎo)致宮頸癌特別是鱗癌的風(fēng)險增加 長期服用口服避孕藥 服用口服避孕藥8年以上宮頸癌特別是腺癌的風(fēng)險增加兩倍免疫缺陷與抑制 HIV感染導(dǎo)致免疫缺陷和器官移植術(shù)后長期服用免疫抑制藥物導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生率升高其它病毒感染 皰疹病毒II型 HSV II 與宮頸癌病因的聯(lián)系不能排除 HPV感染潛伏期與發(fā)病期 低危型HPV感染平均持續(xù)時間是4 8個月高危型HPV感染平均持續(xù)時間是8個月HPV感染的最常見的結(jié)局是沒有明顯的臨床表現(xiàn) 絕大部分會被機體免疫力自動清除只有持續(xù)的高危型的HPV感染才會發(fā)生癌前病變或?qū)m頸癌 一般平均8 24月可發(fā)生輕度 中度和重度的宮頸癌前病變 CIN1 CIN2和CIN3 再平均5 10年才可發(fā)生浸潤癌 只要早查早治 是完全可以避免死于宮頸癌的 唯一病因明確唯一可以早期預(yù)防和治療唯一可以徹底根除的癌癥 1 5HPV病毒學(xué)知識 小環(huán)狀雙鏈DNA病毒 約8Kb顆粒直徑為50 55nm 無包膜由72個病毒殼粒包被在自然界中穩(wěn)定性好 廣泛分布較高的種依賴性嗜上皮性 在基底層細(xì)胞中潛伏在鱗狀上皮細(xì)胞中復(fù)制 轉(zhuǎn)錄和翻譯 增殖 HPV humanpapillomavirus 是一組病毒的總稱 早期區(qū) earlyregion E 含有E1 E2 E4 E5 E6 E7共6個基因 是維持病毒復(fù)制 編碼病毒蛋白 維持細(xì)胞內(nèi)病毒的高拷貝數(shù)的基因晚期區(qū) lateregion L 長控制區(qū) longcontrolregion LCR HPV16 L1 主要衣殼蛋白 是疫苗研發(fā)的主要成分 L2 次要衣殼蛋白 是抗體的主要識別位點 E4 結(jié)合并破壞中表層細(xì)胞角蛋白網(wǎng) 形成中表層細(xì)胞的挖空外觀 HPV的主要致癌基因E6通過抑制p53而阻斷凋亡E7通過抑制pRB使細(xì)胞周期失控 p53是一種核蛋白 負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化 p53的降解失活阻礙了細(xì)胞對DNA損傷的反應(yīng) 由此導(dǎo)致細(xì)胞遺傳學(xué)性狀改變的積累 進而產(chǎn)生惡變的基因型 pRB是重要的抑癌基因 直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控 pRB功能失效 改變了細(xì)胞生長周期的調(diào)控機制 使細(xì)胞永生化 并對惡性病變的防御機制進一步影響 1 6HPV的侵入 復(fù)制和釋放 侵入 病毒微創(chuàng)口皮膚黏膜表層感染 副 基底層細(xì)胞附加體形式在宿主細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制復(fù)制 依賴于上皮細(xì)胞的分化 在基底層上層細(xì)胞中開始復(fù)制釋放 在表皮細(xì)胞中完成裝配并釋放完整病毒顆粒 當(dāng)表皮細(xì)胞脫落時 在皮膚表面可發(fā)現(xiàn)病毒顆粒 1 7宮頸組織與宮頸組織病變 輕度不典型增生 CIN 中度不典型增生 CIN 重度不典型增生 CIN CIN 宮頸上皮內(nèi)瘤變 是一組病變的統(tǒng)稱 包括宮頸不典型增生和原位癌 為宮頸浸潤癌的癌前期病變 通常將CIN分為3級 以輕 中 重級不典型增生來區(qū)分 1 8HPV感染引起的疾病 HPV 感染例數(shù) 總病 例數(shù) 宮頸 咽 肛門 口腔 喉 外陰 陰莖 每年病例數(shù) 0 100 000 2 00 000 3 00 000 4 00 000 5 00 000 二 HPV分型檢測的意義及應(yīng)用 2 1乳頭瘤病毒的分類依據(jù) 主要以病毒基因組中L1區(qū)的DNA同源性作為分類依據(jù) 屬 病毒全基因組DNA同源性23 43 同時病毒基因組L1區(qū)DNA同源性在60 以下 種 病毒基因組L1區(qū)DNA同源性介于60 70 型 病毒基因組L1區(qū)DNA同源性介于71 89 亞型及變異株 L1區(qū)DNA同源性在90 100 HPV的型別 目前已發(fā)現(xiàn)超過200種型別的人乳頭瘤病毒 HPV 依據(jù)與生殖道腫瘤相關(guān)性 將HPV分為 低危型常引起外生殖道濕疣等良性病變 6 11 42 43 44等 高危型與子宮頸癌及子宮頸上皮內(nèi)瘤變 CIN2 3 的發(fā)生相關(guān) 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 68等 中國人常見型別 53 66 CP8304 2 2HPV分型檢測的意義 1 預(yù)測受檢者發(fā)病的風(fēng)險度 確定篩查間隔 女性感染HPV16或18型患宮頸癌及癌前病變的風(fēng)險 對丹麥哥本哈根11088名登記在冊的婦女進行了為期數(shù)年的跟蹤隨訪研究 對受檢人群進行了宮頸細(xì)胞涂片檢查 HPV檢測和組織病理檢查 該研究中假定連續(xù)兩次HPV檢測陰性的危險系數(shù)為1 0 各種持續(xù)感染情況的危險系數(shù)是其與1 0的比值 SusanneKKjaer etal Typespecificpersistenceofhighriskhumanpapillomavirus HPV asindicatorofhighgradecervicalsquamousintraepitheliallesionsinyoungwomen populationbasedprospectivefollowupstudy BMJVOLUME32514SEPTEMBER2002 2 區(qū)分持續(xù) 重復(fù) 感染與一過性感染 HPV持續(xù)感染的危險性評定 對巴西1611名婦女在4個月間隔2次檢測HPV HPV16 18持續(xù)陽性致HSIL風(fēng)險性大于其他高危型HPV持續(xù)陽性 NicolasF Schlecht et al JAMA 2001 286 24 3106 3114 宮頸癌的必要條件 高危型的HPV感染 HPV持續(xù)感染 3 區(qū)分單一感染和多重感染 早期的文獻(xiàn)報道 HPV的多重感染與宮頸癌直接相關(guān) 現(xiàn)在越來越多的報道發(fā)現(xiàn) HPV的多重感染與宮頸癌之間 不存在顯著性的關(guān)系 例如 一個病人的HPV檢測結(jié)果是18 51的多重感染 但隨訪后18型被免疫清除了 只有51型 由于51型的風(fēng)險低 那么繼續(xù)隨訪并給予相應(yīng)的干預(yù)即可 如果采用定量的方法 兩次結(jié)果的載量都很高 沒有型別的輔助 很容易就會判讀為高危亞型持續(xù)感染而給予過度的治療 4 針對不同型別的感染采取不同的處理方案 據(jù)統(tǒng)計約有70 以上的生育年齡的婦女都曾有HPV感染90 以上婦女能自動清除HPV感染宮頸癌是一種常見感染的罕見結(jié)局相同細(xì)胞及組織學(xué)類型HPV陽性與陰性要區(qū)別對待不同HPV感染型別要區(qū)別對待例如 建議HPV16 18型的患者直接進行陰道鏡檢查 而對于其他型別的感染 要結(jié)合細(xì)胞學(xué)診斷 一般不需要采取任何治療方法 但需要按時隨訪 2 3HPV分型檢測的應(yīng)用 篩查 陰道鏡適應(yīng)癥 ASCUS分流 HPV分型檢測 宮頸病變隨訪 指導(dǎo)疫苗的使用 1 篩查 從癌前病變發(fā)展到宮頸癌需要多年的時間 5 8年以上 而且病情的發(fā)展具有可逆性 如果篩查和治療的及時 徹底 病變就會消失 身體恢復(fù)健康 反之 就會朝癌癥發(fā)展 宮頸病變的三階梯診斷技術(shù)是在國內(nèi)廣泛推行的針對宮頸癌及宮頸癌前病變的規(guī)范化診治流程 由HPV檢測 宮頸細(xì)胞學(xué) 陰道鏡與組織病理學(xué)組成 宮頸病變的三階梯診斷 篩查方法 巴氏涂片敏感性差 假陰性率高 2 50 假陽性率高 漏診多 可重復(fù)性差 受閱片人主觀影響 液基細(xì)胞學(xué)檢測 LCT TCT 敏感度 準(zhǔn)確性有所提高用途廣泛沒有改變傳統(tǒng)的閱片方式 與人為主觀因素直接相關(guān) HPV檢測靈敏度高 特異性強 均高于95 可預(yù)測宮頸癌的風(fēng)險陰性預(yù)測值高 99 9 HPV和細(xì)胞學(xué)檢測在子宮頸癌篩查中的對比 最佳篩查方案 一般篩查方案 2006 11第18屆FIGO會議正式提出 現(xiàn)在的各種細(xì)胞學(xué)技術(shù)與巴氏涂片相比并沒有提高宮頸癌的早期檢出率 在WHO的協(xié)調(diào)下 南非和美國的研究提示 有條件的地區(qū)應(yīng)以HPV檢測為首選 2006consensusguidelinesformanagementofwomenwithabnormalcervicalcancerscreeningtests 推薦的子宮頸癌篩查方案 適合篩查的人群 任何有三年以上性行為或21歲以上有性行為的婦女均為篩查對象 因為21歲以下子宮頸癌患者極為罕見 而且從HPV感染到CIN需要3 8年時間 高危人群 有多個性伴侶 性生活過早 HIV HPV感染 免疫功能低下 衛(wèi)生條件差 性保健知識缺乏的婦女對決定妊娠的婦女 在妊娠前應(yīng)進行HPV檢查 2 陰道鏡適應(yīng)癥 波特蘭的一項研究表明 30歲細(xì)胞學(xué)陰性的女性中 HPV16或18陽性的女性在10年隨訪中出現(xiàn)CIN3的比率分別為21 和18 與此相比 其他高危型HPV陽性的女性中 CIN3的風(fēng)險性僅1 5 不同型別致CIN3的風(fēng)險不同 2009年 美國陰道鏡和宮頸病理學(xué)會 簡稱ASCCP 發(fā)布了HPV基因分型檢測指南 明確指出 30婦女 細(xì)胞學(xué)未見上皮內(nèi)病變和惡性細(xì)胞 HPV16 18建議陰道鏡 其他HPV高危型 則在12個月后重復(fù)HPVDNA檢測和細(xì)胞學(xué)檢查 AmericanSocietyforColposcopyandCervicalPathology 2009 3 ASCUS分流 atypicalsquamouscellsofunknownsignificance 診斷意義不明的不典型鱗狀上皮細(xì)胞 直接陰道鏡檢查或多點病理活檢 引起創(chuàng)傷和過度診治 40 60 重復(fù)細(xì)胞學(xué)檢查 有25 失訪率 此外復(fù)檢會增加病人經(jīng)濟及精神負(fù)擔(dān)457例細(xì)胞學(xué)診斷為ASCUS LSIL 進行HPV檢測和活檢 LSIL且高危HPV陽性者 22 7 為CINII III LSIL但高危HPV陰性者 僅1 為CINII III LeeNak Woo etal IstheHumanPapillomavirusTestinCombinationWiththePapanicolaouTestUsefulforManagementofPatientsWithDiagnosesofAtypicalSquamousCellsofUndeterminedSignificance Low GradeSquamousIntraepithelialLesions ArchPatholLabMed 2001 125 1453 HPV檢測為目前的最優(yōu)方法 HPV檢測陰性 可列入常規(guī)篩查人群 HPV檢測陽性 則考慮配合陰道鏡檢查 4 宮頸病變隨訪 據(jù)瑞典的一項研究 針對完成宮頸錐切術(shù)后 術(shù)后隨訪結(jié)果有26例CIN復(fù)發(fā) 22例未復(fù)發(fā) 術(shù)后3個月用PCR方法檢測宮頸細(xì)胞涂片HPV 其中 26例復(fù)發(fā)者 25例為HPV陽性22例對照組 全部為HPV陰性實驗說明 宮頸病變治療后檢測HPV DNA 可預(yù)測殘余病變 估計療效 Chua K L Hjerpe A Humanpapillomavirusanalysisasaprognosticmarkerfollowingconizationofthecervixuteri GynecolOncol 1997 66 1 108 113 宮頸病變治療后的隨訪 5 指導(dǎo)疫苗的使用 HPV感染后可以激發(fā)機體產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫針對衣殼蛋白 L1 的IgG和IgA中和抗體在病毒感染的早期較為重要 預(yù)防性疫苗針對早期蛋白 E6E7 的細(xì)胞免疫反應(yīng)對最終清除病毒可能更為重要 治療性疫苗 默沙東 Gardasil 6 11 16 18 43 94 葛蘭素史克 Cervarix 16 18 26 47 約200種HPV 中國HPV數(shù)據(jù)庫的目的和意義 收集積累HPV不同型別感染數(shù)據(jù)和中國HPV基因研究資料 形成具有中國特色的開放數(shù)據(jù)平臺 應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù) 對HPV流行趨勢開展長期監(jiān)測 積極探索HPV與宿主 基因多態(tài)性及與腫瘤的發(fā)生發(fā)展演變的關(guān)系 解決宮頸癌的發(fā)生 發(fā)展 轉(zhuǎn)瘤等重大科學(xué)問題 指導(dǎo)適合中國人群HPV治療性和預(yù)防性疫苗的研制 為制定宮頸癌相關(guān)的公共衛(wèi)生政策提供理論基礎(chǔ) 三 HPV檢測相關(guān)產(chǎn)品介紹 核酸擴增檢測技術(shù) nucleicacidamplificationtests NAATs 屬于分子醫(yī)學(xué)范疇 是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)革命性的發(fā)展 具有高靈敏度 高特異性的特點 3 1實驗原理 自主創(chuàng)新技術(shù) 導(dǎo)流雜交技術(shù)將PCR和低密度基因芯片技術(shù)結(jié)合成綜合工作平臺 具有高效 快速 靈敏 準(zhǔn)確的特點 3 2宮頸細(xì)胞樣本的采集 月經(jīng)期不可采集標(biāo)本 減少給受檢者的損傷 月經(jīng)正常婦女 在月經(jīng)來潮后10 18天為最佳檢查時間不可在碘試驗和醋酸試驗之后采集樣本 可能會抑制PCR反應(yīng) 檢查前48小時內(nèi)不要作陰道沖洗 不要用避孕藥膏等陰道內(nèi)用藥物 可能會抑制PCR反應(yīng) 檢查前48小時最好不要行性生活 一過性假陽性 樣本采集后 注意避免交叉污染 子宮頸的鱗狀上皮細(xì)胞與柱狀上皮細(xì)胞的連接處 轉(zhuǎn)化帶 TransformationZone 是HPV的易感部位 HPV DNA檢測樣本是子宮頸轉(zhuǎn)化帶的脫落細(xì)胞 被檢者脫掉褲子 然后按醫(yī)生指示仰臥于一張檢查床上 由醫(yī)生以窺陰器或陰道張開器暴露宮頸 然后使用專用的凱普HPV采樣刷置于宮頸口采集標(biāo)本 最好在取樣前先用棉簽擦去宮頸分泌物 操作步驟 將專用宮頸刷置于宮頸口 輕輕搓動宮頸刷使其旋轉(zhuǎn)5圈 慢慢取出宮頸刷 將其放入標(biāo)有病人編號的取樣管中 取樣管內(nèi)已加有專用細(xì)胞保存液 折斷其刷頭入管中 擰緊瓶蓋 樣品收集中注意事項 取樣管上標(biāo)簽的名稱須與患者一一對應(yīng) 使用凱普專用取樣器及保存液 可抑制細(xì)菌生長 保持DNA完整性 宮頸保存系統(tǒng)包裝打開后 必須立即進行采樣 并連同刷頭置于取樣管中 樣本收集中為保留足夠的宮頸細(xì)胞標(biāo)本 注意切勿將宮頸刷頭丟棄 宮頸刷頭折斷 試驗取樣時 請小心操作 切忌大力震蕩取樣管 造成試劑及樣本濺出