轉(zhuǎn)錄組測序以及常用算法簡介.docx

轉(zhuǎn)錄組測序以及常用算法簡介轉(zhuǎn)錄組測序，也被稱為“全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序”（WTSS），由于轉(zhuǎn)錄組測序的高覆蓋率，它也被稱為深度測序。它主要利用新一代高通量測序技術(shù)，對物種或組織的RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA文庫進(jìn)行測序，并得到相關(guān)的RNA信息。其研究對象為特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA。它是指用新一代高通量測序技術(shù)，對物種或組織的RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA文庫進(jìn)行測序，并得到相關(guān)的RNA信息。轉(zhuǎn)錄組測序根據(jù)有無基因組參考序列分為：有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測序，和無參考基因組的de novo測序。如果有基因組參考序列，可以把轉(zhuǎn)錄本映射回基因組，確定轉(zhuǎn)錄本位置、剪切情況等更為全面的遺傳信息，而這些遺傳信息可以廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究、臨床研究中。雖然轉(zhuǎn)錄組測序和基因組測序的步驟大體相同，但是在文庫制備和分析方法上卻有很大的區(qū)別。在生物信息學(xué)領(lǐng)域，序列比對作為識別DNA、RNA和蛋白質(zhì)相似區(qū)域的有效手段，有助于我們更好地研究其結(jié)構(gòu)、功能以及進(jìn)化方向的關(guān)系。下圖簡要說明了轉(zhuǎn)錄組測序的主要流程：首先將細(xì)胞中所有的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為cDNA文庫，再將cDNA隨機(jī)剪切為小DNA片段，并在兩端加上接頭（Adapter），所得序列通過比對（有參考基因組）或者從頭組裝de novo（無參考基因組），形成全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄譜。圖1 轉(zhuǎn)錄組測序流程圖常用算法簡介TopHat（/software/tophat/index.shtml）TopHat是Cole Trapnell等人于2009年發(fā)表在Bioinformatics上的基于Bowtie的轉(zhuǎn)錄組測序比對算法，是馬里蘭大學(xué)生物信息和計(jì)算機(jī)生物中心，以及加利福尼亞大學(xué)伯克利分校數(shù)學(xué)系和分子細(xì)胞生物學(xué)系以及哈佛大學(xué)的干細(xì)胞與再生生物學(xué)系聯(lián)合開發(fā)的結(jié)果。它通過超快的高通量短序列比對RNA序列來識別剪切位點(diǎn)。圖2 TopHat流程圖TopHat首先先用Bowtie將RNA序列與整個(gè)參考基因組進(jìn)行比對，找到匹配的序列，再用Maq合并匹配的序列，對外顯子進(jìn)行選擇性的拼接。Bowtie在進(jìn)行比對時(shí)可以兼容一定量的錯(cuò)誤（默認(rèn)值=2）。TopHat使用每個(gè)堿基2比特的編碼方法對龐大的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行了有效地儲存和管理，因此允許Bowtie在哺乳動物基因組序列比對時(shí)，只使用2GB左右的內(nèi)存。TopHat可以發(fā)現(xiàn)大部分新的剪接位點(diǎn)，但如果外顯子相距比較長，或者內(nèi)含子為非經(jīng)典內(nèi)含子，TopHat則無法有效地發(fā)現(xiàn)。RUM（/RUM）RUM（RNA-Seq Unified Mapper）是Gregory R.Grant等人于2011年發(fā)表在Bioinformatics上的轉(zhuǎn)錄組測序比對算法。運(yùn)算分為三個(gè)階段，首先先用Bowtie把所有序列（reads）分別與參考基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對，合并結(jié)果后，把無法匹配的序列再用Blat（Blast Like Alignment Tool）與參考基因組進(jìn)行比對，合并后得到最終結(jié)果。RUM很好地利用了Burrows-Wheeler壓縮算法的高效快速，以及Blat的敏感性。Blat之前被認(rèn)為不適合用作短序列的比對，而且由于速度太慢，也不適合進(jìn)行大規(guī)模運(yùn)算。但是Blat可以高效地進(jìn)行短序列比對，識別新的剪切點(diǎn)。隨著科技的發(fā)展，計(jì)算資源成本逐漸降低，比對序列的長度增加，使得Blat可以被更好地應(yīng)用。圖3 RUM流程圖MapSplice（/p/bioinfo/MapSpliceManual）MapSplice是Kai Wang等人于2010年發(fā)表Nucleic Acids Research上的具有高度特異性和敏感性的轉(zhuǎn)錄組測序比對算法。由于大多數(shù)內(nèi)含子剪切位點(diǎn)具有GT-AG模式，即經(jīng)典剪切位點(diǎn)，為保證準(zhǔn)確性并節(jié)省時(shí)間，TopHat只報(bào)告含有經(jīng)典剪切位點(diǎn)的內(nèi)含子。MapSplice并不依賴剪切位點(diǎn)的特性或內(nèi)含子的長度，它可以更好地檢測到新的經(jīng)典剪切位點(diǎn)和非經(jīng)典剪切位點(diǎn)。MapSplice在比對的質(zhì)量與序列的多樣性之間做了一個(gè)很好的權(quán)衡。算法分為兩個(gè)步驟：標(biāo)記比對（tag alignment）和拼接推理(splice inference)。在第一階段，被標(biāo)記的mRNA與參考基因組G進(jìn)行比對，產(chǎn)生可能的組合。之后，出現(xiàn)一個(gè)或者更多標(biāo)記比對的剪接位點(diǎn)被篩選出來進(jìn)行分析，根據(jù)比對的質(zhì)量和多樣性打分。STAR（/p/rna-star/）STAR（Spliced Transcripts Alignment to a Reference）是Alexander Dobin等人于2013年發(fā)表在bioinformatics上的一個(gè)快速普適的轉(zhuǎn)錄組測序比對算法。STAR可以準(zhǔn)確比對由三代測序技術(shù)產(chǎn)生的長序列。與大部分比對軟件不同，STAR不是單純的由DNA短序列比對軟件擴(kuò)展而來的（比如TopHat就是由Bowtie擴(kuò)展而來），它直接用非連續(xù)序列進(jìn)行比對，在速度方面也有所提升。算法由兩部分組成：種子搜索（seed search）和聚類、拼接、打分（clustering/stitching/scoring）。STAR進(jìn)行種子搜索的核心是MMP（Maximal Mappable Prefix）,與大型基因數(shù)據(jù)比對工具M(jìn)ummer和MAUVE的Maximal Exact Match概念相似，通過運(yùn)行非壓縮的后綴數(shù)組（suffix array, SAs）實(shí)現(xiàn)。MMP可以發(fā)現(xiàn)不同的不匹配序列，但是與Mummer和MAUVE不同，在MMP中，只有不匹配的序列進(jìn)入第二輪搜索。MMP的這一特性使得STAR的運(yùn)行速度有了非常顯著的提高。根據(jù)用戶對匹配、不匹配、插入缺失、間隔定義的分值評估比對結(jié)果并打分，選擇分值最高的結(jié)果輸出。GSNAP（/gmap/）GSNAP（Genomic Short-read Nucleotide Alignment Program）是由Thomas D.Wu等人于2010年發(fā)表在bioinformatics上的一個(gè)快速、SNP兼容的轉(zhuǎn)錄組測序比對算法。它可以利用概率模型或者已知剪接位點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)非常短的以及很長的剪接序列。值得一提的是，GSNAP是本次所介紹的五種算法中唯一使用哈希算法的（Hash Table），由于哈希算法需要較大的內(nèi)存空間，對設(shè)備的物理內(nèi)存和運(yùn)算性能要求較高。比如，SOAP需要大約14GB的內(nèi)存來運(yùn)行人類基因組的數(shù)據(jù)。為此，GSNAP采用了基因抽樣的方法（sampling the genomic oligomers），每3nt取出12mers作為索引，從而把所需內(nèi)存由14GB縮短到4GB。GSNAP采用的算法結(jié)構(gòu)決定了其比對過程是基于核苷酸寡聚物層面的，而采用Burrows-Wheeler壓縮轉(zhuǎn)換算法的算法大多是基于核苷酸層面的。ReferenceGregory R. Grant. (2011). Comparative analysis of RNA-Seq alignment algorithms and the RNA-Seq unified mapper (RUM). Bioinformatics, 27(18), 2518-2528.Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet, 2009, 10(1): 57-63.祁云霞, 劉永斌, 榮威恒. 轉(zhuǎn)錄組研究新技術(shù)：RNA-Seq及其應(yīng)用.遺傳2011，33（11）：1191-1202Zhao S, Fung-Leung W-P, Bittner A, Ngo K, Liu X (2014) Comparison of RNA-Seq and Microarray in Transcriptome Profiling of Activated T Cells. PLoS ONE 9(1): e78644. doi:10.1371/journal.pone.0078644Yiu, S. Structural Alignment of RNA with Complex Pseudoknot Structure. Journal of Computational Biology, 97-108.Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. (2013). TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletionsand gene fusions. Genome Biology, 14(4). doi:10.1186/gb-2013-14-4-r36Trapnell, C., Pachter, L., & Salzberg, S. L. (2009). TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. 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