般毒性作用及其試驗與評價方法.ppt

1、,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,第六章 一般毒性作用及其試驗與評價方法,第一節(jié) 急性毒性作用及其試驗與評價 第二節(jié)亞慢性毒性作用及其試驗與評價方法 第三節(jié) 蓄積毒性作用及其試驗與評價 第四節(jié) 慢性毒性作用及其試驗與評價,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,外來化學物在一定劑量、一定接觸時間和接觸方式下對試驗動物產(chǎn)生的綜合毒效應稱為一般毒性作用。 一般毒性作用根據(jù)接觸毒物的時間長短又可分為急性毒性、亞慢性毒性和慢性毒性。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,

2、下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,一、急性毒性的概念 二、急性毒性試驗的目的 三、急性毒性試驗方法的要點 四、急性毒性分級和評價,第一節(jié) 急性毒性作用及其試驗與評價方法,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,一、急性毒性的概念 急性毒性是指機體（實驗動物或人）一次或24h內(nèi)多次接觸外源化學物后在短期內(nèi)所產(chǎn)生的毒性效應，包括一般行為和外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應。,第一節(jié) 急性毒性作用及其試驗與評價方法,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,1、急性接觸的次數(shù) （一次或多次） 24h內(nèi) 2、中毒效應出現(xiàn)的時間（

3、一般為7-28d） 急性毒性效應一般是指機體接觸化學物后，在較短時間內(nèi)觀察到的毒性癥狀。 3、中毒效應的強度,急性毒性概念中的幾個問題,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,1、測試和求出毒物的致死劑量以及其他急性毒性參數(shù)，通常以LD50為最主要的參數(shù)； 2、初步評價毒物對機體的毒效應特征、靶器官、劑量-反應（效應）關系和對人體產(chǎn)生損害的危險性； 3、研究受試物在動物體內(nèi)的動力學變化規(guī)律； 4、為亞慢性、慢性毒性試驗研究以及其他毒理試驗提供接觸劑量和觀察指標選擇的依據(jù)。,二、急性毒性試驗的目的,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主

4、目錄,包括實驗動物、染毒途徑、染毒劑量、觀察周期、觀察指標的選擇、計算方法和評價等。 一般來說，一個新化學物在研制初期就要進行急性毒性試驗。 如果急性毒性試驗通不過，則后面的所有試驗都不必進行了。,三、急性毒性試驗設計,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,（一）實驗動物的選擇和要求 盡量選擇急性毒性反應與人近似的動物； 易于飼養(yǎng)管理、試驗操作方便的動物； 繁殖生育力較強，數(shù)量較大能夠保障供應； 價格較低，易于獲得的動物。 實驗動物的選擇包括物種和品系、年齡、體重、數(shù)量等方面，必須按照其規(guī)范要求進行。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)

5、容,回主目錄,1、實驗動物的物種和品系 急性毒性試驗一般首先選擇哺乳動物，選擇兩種或兩種以上的動物。包括嚙齒類和非嚙齒類。嚙齒類以大鼠、小鼠為最常用。非嚙齒類以犬或猴最常用。 急性毒性試驗所用大鼠的品系以Sprague-Dawley（SD）、Wistar為主，小鼠則以昆明種、NIH、ICR為多。,（一）實驗動物的選擇和要求,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,2、實驗動物的年齡和體重 通常要求剛成年的動物，且為健康未受孕的動物。 通常大鼠180240g、小鼠1825g、家兔22.5kg、豚鼠200250g、Beagle犬46kg、雜種犬815kg。,（一）實

6、驗動物的選擇和要求,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,3、實驗動物的性別 通常要求為雌雄各半。 但如有資料或預試驗發(fā)現(xiàn)試驗品對雌、雄動物毒效應有明顯的性別差異，則應單獨分別試驗并求出雌性和雄性動物各自的LD50值。,（一）實驗動物的選擇和要求,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,4、實驗動物的預檢 應先進行動物的給藥前檢疫觀察。 大鼠、小鼠、豚鼠、兔的檢疫期為1周，犬、猴等適當?shù)匮娱L至23周。 設定檢疫期有兩個主要目的： 一是讓外購來的實驗動物要適應一段時間，減少環(huán)境和生理條件變化對試驗結果的影響； 二是篩檢健康等不符合

7、試驗要求的動物,（一）實驗動物的選擇和要求,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,5、實驗動物的給藥前禁食處理 采用經(jīng)口途徑染毒，實驗動物胃腸道內(nèi)食物存留量對化學毒物的毒性可產(chǎn)生較明顯的干擾，因此在試驗給藥前應作禁食處理。 大鼠在前一天傍晚下班時或晚間將飼料撤掉。 小鼠由于其消化吸收和代謝速度較快，可隔夜禁食也可禁食4h以上。,（一）實驗動物的選擇和要求,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,（一）實驗動物的選擇和要求,6.試驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境 恒定的溫度：223 濕度：3070% 光照度：晝夜各半 飼料合格、飲水合格、墊料合格

8、,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,不同的LD50計算方法對動物組數(shù)的要求有所不同，一般為57組。 大、小鼠等小動物每組數(shù)量通常為不少于10只，家兔每組不少于8只，犬等大動物每組不少于6只。 嚴格按照隨機分組進行。,（二）實驗動物分組與數(shù)量,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,受試物的接受、分樣、保管、稱量、配制以及在此過程中嚴格的質(zhì)量保證是急性毒性試驗成功與否的重要環(huán)節(jié)。 受試物的化學結構、純度、雜質(zhì)成分、理化性質(zhì)特別是揮發(fā)性、溶解性等均需了解。 計算試驗所需受試物的總量，一次備齊全部實驗的用量。應以同一批號為宜。,（

9、三）受試物及處理,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,（四）染毒劑量及分組,一般推薦，染毒最大量為： 經(jīng)口20ml/kg（對空腹動物）； 經(jīng)皮2ml/kg（根據(jù)體表面積計算，限于染毒的準確性）； 靜脈1ml/kg（5min以上）； 肌內(nèi)注射0.5ml/kg（一個部位）； 每眼0.01ml； 直腸0.5ml/kg； 吸入2mg/L； 鼻：猴或犬每鼻孔0.1ml。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,染毒途徑（exposure routes）的選擇需考慮： 1. 模擬人在生活和生產(chǎn)環(huán)境中實際接觸受試物的途徑和方式； 2. 有利

10、于不同化學物之間急性毒性大小的比較； 3. 受試物的性質(zhì)和用途； 4. 各種受試物毒性評價程序的要求等。,（五）染毒方法,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。 吸收速率依次排列，一般是靜脈注射吸入肌內(nèi)注射腹腔注射皮下注射經(jīng)口皮內(nèi)注射經(jīng)皮。,（五）染毒方法,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,1、經(jīng)口（胃腸道）染毒 灌胃 喂飼 吞咽膠囊,（五）染毒方法,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,2、經(jīng)呼吸道染毒 研究生產(chǎn)條件下以氣體、蒸氣、粉塵、

11、煙、霧等形式存在于車間空氣中的工業(yè)毒物，評價環(huán)境空氣污染物，以吸入為給藥途徑的藥物，常常采用經(jīng)呼吸道染毒的途徑。,（五）染毒方法,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,3、經(jīng)皮膚染毒 經(jīng)皮膚染毒的方式：先使用化學法脫毛（常用脫毛劑為硫化鋇加滑石粉1：4或硫化鈉加淀粉1：4）或機械法脫毛（剪剃去毛），將動物脊柱兩側(cè)背毛脫去，去毛面積常為體表面積的10。 局部涂敷受試物并以玻璃紙覆蓋固定一定時間接觸染毒。,（五）染毒方法,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,4、經(jīng)注射途徑染毒 對注射藥品或需作比較毒性觀察的藥品進行急性毒性試驗時

12、，須作經(jīng)注射途徑染毒。 注射途徑可分為靜脈注射或滴注、腹腔注射(ip)、肌內(nèi)注射(im)、皮下注射(sc)、皮內(nèi)注射(id)、椎管內(nèi)注射等。,（五）染毒方法,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,查閱文獻 了解化學毒物的結構式、分子量、常溫常壓下的狀態(tài)、熔點、沸點、密度、閃點、揮發(fā)度、蒸氣壓、水溶性和脂溶性等理化特性，生產(chǎn)批號及純度，雜質(zhì)成分與含量等。 確定使用哪一種計算方法求LD50，然后再設計劑量分組。LD50的計算方法常用改良寇氏法、概率單位法、霍恩氏法等。 找出與受試化學毒物結構與理化性質(zhì)近似的化學物的毒性資料，并以文獻資料中相同的動物種系和相同接觸途

13、徑所測得的LD50(LC50)值作為受試化學物的預期毒性中值。,（六）劑量選擇,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,一般來說，化學結構和性質(zhì)比較近似的毒物，毒性也比較近似。通過以上資料從而對受試物毒力做出估計，以預期毒性劑量設計預實驗方案。 每個劑量組間的組距可大些，以便尋找出受試物的致死劑量范圍。,（六）劑量選擇,目的是找出0及100估計致死量。更確切地說是找到一個0死亡的最大劑量和100死亡的最小劑量的估值以決定實驗中采用的最大劑量(Dm)和最小劑量(Dn)，這在測定中非常重要，是實驗成敗的關鍵。,預試驗,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)

14、容,下一內(nèi)容,回主目錄,預試驗,設定以此預期值作為待測化學物的中間劑量組，并在該劑量的上下各設計l2個劑量組作為預試驗劑量； 根據(jù)確定的劑量組進行染毒； 根據(jù)預試驗的死亡資料確定組距。 可根據(jù)以下公式計算出劑量分組： i=(lgLD90-lgLD10)(n-1) 或： i=(lgLD100-lgLD0)(n-1) 公式中i為組距(相鄰的兩個劑量組對數(shù)劑量之差)；n為設計的劑量組數(shù)。,一般來說、根據(jù)試驗設計所選用的LD50計算方法來確定組數(shù)。例如寇氏法、幾率單位法一般設610個劑量組；霍恩法固定設4個劑量組。求得i值后，以最低劑量組(LD0或LD10)的對數(shù)劑量加上一個i值，即是第二個劑量組的對

15、數(shù)劑量，依此類推直至最高劑量組，查各自的反對數(shù)即得出各組劑量的真實值。,正式試驗,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,對未知毒性的化學物，估計毒性較低時，預試驗也可以5g/kg劑量進行摸索，來決定是否需正式求LD50。一般來說，化學物LD50如大于5g/kg已表明毒性不大。 我國藥品的毒理研究指導原則規(guī)定要以最大容積最高濃度給予動物后未見死亡，方可不進一步試驗求出LD50值。 急性毒性試驗除設立幾個劑量組外，是否設正常和溶劑對照組，根據(jù)需要確定。,（六）劑量選擇,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,急性毒性試驗一般是以死亡

16、為主要記錄內(nèi)容。 除此之外還要注意： 中毒體征及發(fā)生過程； 死亡情況和時間分布； 體重 病理形態(tài)學變化。,（七）毒性作用觀察,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,1、中毒體征及發(fā)生過程 應詳細觀察和記錄動物出現(xiàn)的中毒體征、發(fā)生時間和體征發(fā)展的經(jīng)過。 機體對毒物作用的反應可以表現(xiàn)出各個系統(tǒng)的特征。,（七）毒性作用觀察,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,2、死亡情況和時間分布 急性毒性試驗中實驗動物的死亡數(shù)是計算LD50值的依據(jù)，動物死亡數(shù)量每增加或減少

17、一只都會對LD50值產(chǎn)生明顯影響，因此應認真觀察和記錄。 分析中毒死亡時間的分布規(guī)律，也可以提供重要信息。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,3、體重 實驗動物體重變化指標，可以反映動物中毒后綜合性整體變化，是一個比較客觀簡便的量化指標。 因此在觀察實驗動物中毒體征的同時，對存活動物應定期多次稱量動物的體重變化，一般為每周1次或2次。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,體重可以反映動物中毒后的整體變化。 對存活動物尤其是對低于LD50劑量組的存活動物。應在觀察期28天內(nèi)稱量其體重的變化,以便了解受試物引起毒效應的持續(xù)時

18、間。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,4、病理檢查 對死亡動物應及時進行大體解剖，肉眼觀察大體病理變化，如臟器外觀、大小、色澤的變化，有無充血、出血、水腫或其他改變，如有改變須取材作組織病理學檢查。 對存活動物在觀察期結束時亦應進行解剖檢查，必要時做組織病理學檢查。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,高劑量組動物染毒后常在數(shù)分鐘或數(shù)十分鐘內(nèi)出現(xiàn)死亡，染毒以后應即刻開始觀察動物的中毒表現(xiàn)和死亡情況。 給藥當天應連續(xù)或多次觀察，以后可根據(jù)情況，每天2次或多次觀察直到試驗周期結束。 急性毒性試驗觀察周期一般為7-28天。,

19、（八）觀察時間和周期,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,改良寇氏法（Karber） 霍恩氏法（Horn） 威爾氏法（Weil） 概率單位法 其他計算方法,（九）LD50的計算方法,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,四、急性毒性分級和評價,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,四、急性毒性分級和評價,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,四、急性毒性分級和評價,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,四、急性毒性分級和評價

20、,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,四、急性毒性分級和評價,LD50標志著一個化合物毒性的大小，所以常用作急性毒性分級。 毒性大小于LD50值成反比，LD50越小，毒性越大，反之，毒性越小。 除了LD50以外，還應當報告LD50 95%可信限范圍、急性毒作用帶等指標，并盡可能詳盡描述中毒特征、癥狀表現(xiàn)、出現(xiàn)時間、死亡前兆、毒性作用的發(fā)生、發(fā)展、恢復經(jīng)過，以及體重、剖檢和病理學變化等。從而全面的對急性毒性做出評價。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,五、經(jīng)典急性毒性試驗的局限性,1.消耗的動物量大 2.獲得的信息有限 3

21、.測得的LD50僅僅是一個近似值 4.在安全性評價中僅評價動物死亡和簡單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學、血液學及其它化驗檢查所提供的深入細致的毒性信息。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,一、基本概念 二、試驗目的 三、亞慢性毒性試驗設計及其評價,第二節(jié) 亞慢性毒性作用及其試驗與評價方法,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,一、基本概念,亞慢性毒性作用是指試驗動物連續(xù)多日接觸較大劑量的外來化學物所出現(xiàn)的中毒效應。 試驗染毒期限應為36個月，或一般為實驗動物生命期的1/101/30。 如用小鼠，試驗期通常為3個月，大

22、鼠36個月，狗412個月。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,二、試驗目的,（1）進一步探索受試物的毒作用特點和靶器官； （2）了解受試物有無蓄積作用，是否產(chǎn)生耐受性； （3）分析受試物的劑量-效應關系； （4）初步估計不出現(xiàn)毒性作用的最大耐受劑量（NOEL或NOAEL）和出現(xiàn)毒性的最小有作用劑量（MED）； （5）為慢性毒性試驗的劑量設計和觀察指標提供依據(jù)； （6）為受試物的毒理機制提供基礎資料。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,三、亞慢性毒性試驗設計,在遺傳毒理學及一些前期的試驗難以做出明確評價時需要進行亞慢性毒

23、性試驗。 根據(jù)前期的試驗結果來設計亞慢性毒性試驗，其試驗的周期從幾個月到一年不等。 在整個亞慢性試驗期間，動物均應攝食試驗飼料。受試物可摻入飼料中，也可摻入飲水中。不得巳時可采用灌胃法進行。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,1、實驗動物的選擇 （l）物種和品系 一般要求兩種實驗動物，一種是嚙齒類，一種是非嚙齒類，以便全面地了解受試物的毒性。 基本上均使用大鼠和犬，有時用猴，這取決于受試物的重要性和試驗條件。亞慢性經(jīng)皮毒性試驗，可用兔或豚鼠。 大鼠常用Wistar和Sprague-Dawley。 犬的亞慢性毒性試驗多使用Beagle犬。,三、亞慢性毒性試驗

24、設計,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,（2）性別、年齡和動物數(shù) 性別：一般每組雌雄各半； 年齡：剛斷乳不就得動物 大鼠68周齡（體重80100g） 動物數(shù)：大鼠、小鼠每組不少于20只； 犬、猴每組不少于6只。,三、亞慢性毒性試驗設計,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,（3）微生物學寄生蟲學等級和飼養(yǎng)環(huán)境： 亞慢性毒性試驗周期較長，觀察指標較多，實驗動物的質(zhì)量、喂飼條件和試驗環(huán)境明顯影響受試物的毒性反應。 實驗動物分四級：普通級、清潔級、無特定病原體級（SPF級）、無菌級。 犬和猴分為普通級和SPF兩級。 亞慢性毒性試

25、驗，應使用清潔級及以上等級大小鼠，并飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)進行試驗。,三、亞慢性毒性試驗設計,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,2、染毒方式 一是應當盡量選擇和人類接觸途徑相似的方式； 二是應當與預期進行的慢性毒作用研究的接觸途徑相一致。 一般以經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮染毒為多。 染毒頻率通常每日一次，連續(xù)給予，如試驗期為3個月或超過3個月時，也可每周6次。,三、亞慢性毒性試驗設計,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,3、染毒途徑 （l）經(jīng)口染毒：灌胃法、喂飼法、膠囊法。 （2）經(jīng)呼吸道染毒： （3）注射： （4）特殊途徑： （5

26、）在進行亞慢性毒性試驗時，最好結合進行毒代動力學血藥濃度的監(jiān)測。,三、亞慢性毒性試驗設計,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,4、劑量選擇和分組 一般至少應設3個劑量組和1個陰性（溶劑）對照組。 陰性對照組 低劑量組 中劑量組 高劑量組 組距：310倍，最低不小于2倍,三、亞慢性毒性試驗設計,高劑量組應能引起明顯的毒性或少量動物的死亡（少于10%）。 低劑量組應無中毒反應，相當于未觀察到有害作用劑量（NOAEL）。 高低劑量組間設置1個中劑量組，比較理想的中劑量組約相當于觀察到有害作用的最低劑量（LOAEL）。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一

27、內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,原則是，盡量控制在受試動物在整個試驗期既不發(fā)生死亡，又有明顯毒性反應。 各組劑量設計的依據(jù)： 高劑量組：以急性毒性的閾劑量作為亞慢性毒性試驗的最高劑量。 或以該受試物LD50的1/201/5作為最高劑量 一般在LD50的1/101/50之間按等比級數(shù)設計其它各組。,三、亞慢性毒性試驗設計,4. 觀察指標,1,2,3,4,三、亞慢性毒性試驗設計,（1）一般性指標,包括每日采食量、體重變化（定期稱量）、外觀特征（被毛光澤、精神狀態(tài)、呼吸動作、分泌物、排泄物、飲食、活動、行為等）、異常表現(xiàn)和中毒癥狀等。,（2）實驗室檢查：,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容

28、,下一內(nèi)容,回主目錄,l）血液學檢查 2）血液生化檢查 通常為血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、清蛋白（ALB）、血糖（GLU）、總膽紅素（T-BIL）、肌酐（Crea）、總膽固醇（T-CHO）等。 尿液檢查包括外觀、pH值、蛋白、糖、潛血和沉淀物鏡檢等，可提供與毒物有關的靶器官毒性和中間代謝產(chǎn)物的信息。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,（3）系統(tǒng)尸解和組織病理學檢查,l）臟器重量和臟器系數(shù)：一般稱取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、卵巢或睪丸、腦等臟器濕重，并計算其臟器系數(shù)

29、。 2）病理學檢查：目的是確定化學毒物對機體毒作用的靶部位、損害的性質(zhì)和程度。 病理學檢查包括：大體檢查、常規(guī)組織病理學檢查、酶組織化學檢查、免疫組織化學檢查、細胞超微結構檢查等，,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,（4）分子生物學和免疫學指標,分子生物學和分子免疫學手段可應用于測定許多具有毒理學意義的指標。 活性氧增加、細胞凋亡、免疫功能異常 選擇相關指標進行測定，有利于探討有害作用的機理和對安全性的評價。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,（5）分析劑量-效應關系,生物體產(chǎn)生的某種效應只有與其接觸的化學物劑量之間呈

30、現(xiàn)相關關系，才能確定此種效應是該接觸物引起的。否則，可能另有原因。 對于進一步的毒理學試驗觀察指標的選擇和毒理機制的研究具有一定的指導意義。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,（6）其他指標的檢查,心電圖、血壓、眼底檢測； 對神經(jīng)系統(tǒng)有影響，可進行神經(jīng)行為、神經(jīng)反射等檢查； 對電解質(zhì)、微量元素代謝有毒作用，則檢測血鈣、血磷等含量； 還可增加眼科、骨髓象檢查等。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,四、亞慢性毒性作用評價,亞慢性毒性作用評價： 如某物質(zhì)的亞慢性毒性無作用劑量小于或等于人的可能攝入量的100倍，則表示毒性很強

31、，應放棄該化學物的使用： 在100300倍之間者，可進行慢性毒性試驗； 若大于或等于300倍者則不必進行慢性試驗，可直接進行毒性評價。,第三節(jié) 蓄積毒性作用 一、蓄積毒性作用的基本概念 二、蓄積作用的研究方法,一、基本概念 多次間隔給予小劑量受試物，當給予受試物的時間間隔和劑量超過機體的解毒和排泄能力時，導致受試物在體內(nèi)蓄積，由此引起的毒性作用稱為蓄積性毒性作用。,（二）目的： 1. 了解受試物是否具有蓄積作用及蓄積性大小如何; 2. 評定該化合物是否可引起潛在的慢性毒性危害; 3. 為制訂該物質(zhì)在食品中的衛(wèi)生限量標準時,安全系數(shù)的選擇提供依據(jù)。 4. 確定該受試物是否可以用于食品供人類長期食

32、用。,物質(zhì)蓄積：是指機體少量反復多次接觸毒物后，該毒物在機體內(nèi)逐漸積累。可以用一定的分析方法檢測出體內(nèi)該物質(zhì)或其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的增加過程，這種累計隨著時間延長而含量增加，當達到中毒閾值時而產(chǎn)生毒性作用。 功能蓄積：是指機體少量反復多次接觸化學毒物或其他形式的危害物，每次引起的輕微功能損害逐漸積累，當積累到一定程度時出現(xiàn)毒性效應，而這時用檢測手段卻查不出體內(nèi)毒物的的存在或增加。,蓄積毒性作用產(chǎn)生的因素,（1）與接觸劑量大小和時間間隔有關 （2）與毒物本身的性質(zhì)有關 脂溶性物質(zhì) 水溶性物質(zhì) 貯存庫：如血漿蛋白、脂肪組織、肝臟、腎臟、骨骼等是某些毒物的常見貯存庫。 （3）與動物種屬的代謝特點有關,上

33、一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,二、蓄積作用的研究方法 蓄積毒性作用的研究方法有多種，常用方法有蓄積系數(shù)法和生物半減期法。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,（一）蓄積系數(shù)法 蓄積系數(shù)是多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)效應（或死亡）的蓄積劑量ED50(n)與一次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)相同效應（或死亡）的劑量ED50(1)的比值，即：,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,在毒理學中研究化學毒物蓄積作用多選擇動物來進行，以動物死亡一半為效應指標，那么上式可改寫為：,LD50(n) K= LD50(1)

34、,K值越小，表示化學毒物的蓄積性越大。 實驗動物對化學毒物發(fā)生過敏現(xiàn)象，則可能出現(xiàn)K1。隨著化學毒物蓄積作用減弱，K值增加，通常認為K5，其蓄積毒性極弱。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,1、固定劑量法測定蓄積系數(shù)法,常選用大、小鼠等小型實驗動物，染毒途徑多用經(jīng)口灌胃或腹腔注射。 先求出某毒物的LD50，然后選取相同條件的40只（或更多）實驗動物，隨機分為兩組：染毒試驗組和對照組，每組至少20只，雌雄各半。 在1/201/5 LD50的范圍內(nèi)選定一個劑量，每日以固定劑量，定時和相同途徑對試驗組進行染毒，觀察記錄動物死亡數(shù)。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一

35、內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,當試驗組累積發(fā)生一半動物死亡即可終止試驗。此時，計算累積總接觸劑量，根據(jù)公式計算K值，然后依上表進行評價。 若接觸劑量已累積達到5個LD50劑量，也可終止試驗，此時計算出K5。 固定劑量法試驗期為25100天。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,2、劑量遞增法,試驗方案同上，實驗開始時按0.1LD50劑量給予試驗組染毒，以4天為一期，每期增加1.5倍。 第一個四天按0.1LD504天 第二個四天按0.15LD504天 第三個四天按0.22LD504天 依次類推。 這一方案試驗期最長28天。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回

36、,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,在試驗期間，當化學毒物引起動物累積死亡一半時即可終止試驗，計算K值進行評價。 一般來說，在試驗第21天也可結束試驗，因為這之前如果動物沒有死亡或死亡數(shù)不足一半，說明其累積量已達5.26LD50，即K5。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,3、劑量固定的20天蓄積法,該法是基于蓄積系數(shù)的原理而設計的。它通常采用經(jīng)口灌胃染毒方式，將動物隨機分為5個組，包括陰性對照組和1/20LD50、l/10LD50、l/5LD50和1/2LD50四個劑量組，每組動物數(shù)10只，雌雄各半。每日染毒一次，連續(xù)染毒20天。觀察每組雌雄

37、合計的死亡動物數(shù)量。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,試驗結束時根據(jù)下列標準進行評定： 1/20LD50組有死亡，且各組呈劑量-反應關系，則為強蓄積性； 1/20LD50組無死亡，且各組呈劑量-反應關系，則為中等蓄積性； 1/20LD50組無死亡，各組也不呈劑量-反應關系，則為無明顯蓄積性； 如僅1/2LD50組有死亡，其他組均無死亡，則為弱蓄積性。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,二、蓄積作用的研究方法,（二）生物半減期法 生物半減期(Biological Half-life, BL, T1/2)，指化學物質(zhì)進入

38、體內(nèi)以后，在體內(nèi)每減少一半所需的時間。對同一化合物在同一種動物體內(nèi)是一恒值。 生物半減期法（t1/2）是用毒物動力學原理描述化學毒物在機體內(nèi)的蓄積作用。 化學毒物在體內(nèi)蓄積的速度和量與機體單位時間內(nèi)吸收該物質(zhì)的速度以及清除速度有關。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,一般來說，tl/2較短的化學毒物達到蓄積極限所需的時間也短，t1/2長者達到蓄積極限的時間也長。 一種化學毒物若以tl/2相等的時間間距染毒，其在體內(nèi)經(jīng)過6個t1/2的接觸期就可以基本上達到蓄積的極限，此時理論蓄積量達到極限的98.4。此后即使繼續(xù)接觸該物質(zhì)，機體內(nèi)的蓄積量基本上也不會增加。,

39、上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,蓄積過程: 第一個BL(T1/2)末蓄積量=L50% 第二個BL(T1/2)末蓄積量=L75% 第三個BL(T1/2)末蓄積量=L87.5% 第四個BL(T1/2)末蓄積量=L93.75% 第五個BL(T1/2)末蓄積量=L96.88% 第六個BL(T1/2)末蓄積量=L98.44% 一般經(jīng)過6個生物半減期 即可達蓄積極限值,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,根據(jù)tl/2=0.693Ke，通過動物血漿中化學毒物濃度求得tl/2。 蓄積極限值,A蓄積極限值（mg） a 單位時間內(nèi)毒物的吸

40、收量（mg/d） T1/2生物半減期（d）,應用： 可根據(jù)一個化合物的t1/2值，計算出它在人體內(nèi)達到的A值，并可計算出達到值所需的時間,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,（三）蓄積率測定法,常用的動物為小鼠或大鼠，首先將受試動物分成蓄積試驗組和對照組兩大組，每組動物數(shù)6070只。蓄積性試驗組動物每次以一定劑量（低于最小致死量）按同一染毒途徑預先給受試物，經(jīng)過一定時間之后，按常規(guī)方法測定蓄積性試驗組和對照組的LD50，并按下列公式計算蓄積率。 蓄積率=,蓄積組給予受試物的總劑量,蓄積組給予受試物的總劑量,蓄積組給予受試物的總劑量,蓄積組給予受試物的總劑量,

41、蓄積率應標明預先給予受試物的時間及劑量。在相同時間及劑量條件下，蓄積率越大表示該物質(zhì)在體內(nèi)的蓄積作用越強；反之，蓄積性則越弱。,蓄積組給予受試物的總劑量,對照組LD50-蓄積組LD50,蓄積組給予受試物的總劑量,100%,對照組LD50-蓄積組LD50,蓄積組給予受試物的總劑量,對照組LD50-蓄積組LD50,100%,蓄積組給予受試物的總劑量,對照組LD50-蓄積組LD50,蓄積組給予受試物的總劑量,對照組LD50-蓄積組LD50,蓄積組給予受試物的總劑量,一、慢性毒性的概念 二、慢性毒性試驗的目的 三、慢性毒性試驗方法要點 四、慢性毒件試驗的注意事項,第四節(jié) 慢性毒性試驗設計,上一內(nèi)容,回

42、主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,一、慢性毒性的概念 是指實驗動物或人長期（甚至終生）反復接觸外源化學物所產(chǎn)生的毒性效應。 所謂“長期”，一般是指2年。 對大鼠相當于終生染毒，對兔相當于生命期的36%，對犬為20%，對猴為13。對于有些遠期毒性評價，試驗期要求達到710年，甚至在有些動物上要包括若干代試驗。,上一內(nèi)容,回主目錄,返回,下一內(nèi)容,返回,上一內(nèi)容,下一內(nèi)容,回主目錄,1、研究慢性毒性劑量-反應（效應）關系。 確定長期接觸造成有害作用的最低劑量（LOAEL)或閾劑量和未造成有害作用的劑量（NOAEL)； 2、為制定外來化學物質(zhì)在食品中的安全限量，如人體ADI值，最高殘留限量MRL值，以及為危險度評價與管理提供毒理學依據(jù)； 3、