《如何寫標(biāo)書》PPT課件.ppt

1、如何申請國家自然科學(xué)基金,第一部分基金委面上項目評審基本程序及重要環(huán)節(jié),初 審： 由各學(xué)科處組織實施。 申請者不具備申請資格或違反有關(guān)規(guī)定； 手續(xù)不完備或申請書不符合要求; 內(nèi)容不符合資助范圍或超出資助能力; 申請者以往資助項目執(zhí)行不利。,查 重：由基金委信息中心組織實施。 高職申請與承擔(dān)（含參加）面上、重點、重大 累計不超過3項； 在職研究生不作為限項申請的條件但只可申請 面上項目； 申請者同期只能申請一項，每個項目申請者限 為一人; 高職申請者當(dāng)年申請及承擔(dān)的在研面上項目累 計不超過3項; 不具有高職的申請者申請及負責(zé)的在研面上項 目不超過一項; 青年基金只能獲得一項資助。,同行評議（一審

2、）： 由基金委各學(xué)科處組織實施?；境绦颍?每份申請書選擇同行評議專家（5位）； 函請同行評議：對項目進行定性定量評價； 收回評議卡； 對定量部分進行計算機判讀、打分、排序； 據(jù)學(xué)科資助項目數(shù)130確定第二輪評審項目。,專家評審組或?qū)I(yè)委員會評審（二審）。 主要對一審?fù)扑]項目進行評議，篩除 30。 再次對二審會確定資助項目進行審查： 進一步查重； 以往承擔(dān)項目是否按期完成； 是否有違反基金委有關(guān)申請規(guī)定。 基金委員會委務(wù)會審議。 下發(fā)批準(zhǔn)、未批準(zhǔn)通知。,第二部分 如何撰寫國家自然科學(xué)基金申請書,一、摘 要（限400字）包括：研究方法、內(nèi)容、目標(biāo)、科學(xué)意義等,如：“用方法（手段）進行研究，探索/

3、證明問題，對闡明機制 揭示規(guī)律有重要意義，為奠定基礎(chǔ)提供思路 ”,探索肺炎鏈球菌感受態(tài)形成 對毒力表達的影響 細菌在自然狀態(tài)下可獲得感受態(tài)而發(fā)生轉(zhuǎn)化，這種基因重組方式是許多重要生命現(xiàn)象和生命過程的起始和源頭。本研究通過插入復(fù)制失活或替代失活的方法，構(gòu)建肺炎鏈球菌感受態(tài)缺陷菌株，用體內(nèi)環(huán)境信號探討肺炎球菌的致病是否與其感受態(tài)的形成和轉(zhuǎn)化有關(guān)。為揭示轉(zhuǎn)化過程對于肺炎鏈球菌致病能力的影響機制提供理論依據(jù)。,二、立論依據(jù) 對基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國際科學(xué)發(fā)展趨勢，論述項目科學(xué)意義 對應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿，圍繞國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中的重要科技問題論述其應(yīng)用前景,在研究領(lǐng)域（疾病防治）層面,從研究方向

4、展開,圍繞本項目擬解決的問題 進行歸納分析,提出設(shè)想,從研究領(lǐng)域（疾病防治）切入,研究意義,立論依據(jù),1、項目的研究意義 存在問題：對科學(xué)意義闡述不足或夸大。 撰寫方法：從疾病入手，簡述其特點、危害，目前 主要的治療方法及其存在的問題。 簡要分析該病發(fā)病機理和主要研究熱點，引出目前存在的主要問題，也就是本項目要解決的問題，以此為切入點提出假設(shè)，闡述如果實現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)，對該病甚至相關(guān)疾病的預(yù)防、治療具有的理論意義和臨床價值。,基因的轉(zhuǎn)移，是基因重組最原始的方式。我們可以從腫瘤組織中找到病毒的基因，也可以發(fā)現(xiàn)某些病原體的DNA在不同宿主之間的傳遞過程中發(fā)生著變異，例如耐藥性在細菌中的傳播，這都是自然

5、界中普遍存在的基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。而細菌基因的轉(zhuǎn)移包括結(jié)合（conjugation）、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）、融合（fusion）及轉(zhuǎn)化（transformation）四種方式，我們這里所要討論的是轉(zhuǎn)化。,什么叫做轉(zhuǎn)化呢？它是指細菌在一定狀態(tài)（感受態(tài)-指細菌能夠攝取外來游離或質(zhì)粒DNA的一種狀態(tài)，它可以在實驗室中誘導(dǎo)產(chǎn)生，也可發(fā)生于細菌自然生長的某一階段）下攝取外來DNA的過程。已發(fā)現(xiàn)有五種細菌可以在自然狀態(tài)下產(chǎn)生感受態(tài)而發(fā)生轉(zhuǎn)化：肺炎鏈球菌(S.pneumoniae，S.pn)、枯草桿菌（B.subitilus）、流感嗜血桿菌（H.influenzia）、血鏈球菌（S.sanguis）和

6、淋病奈瑟氏菌（N.gonorrhea ），其中肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化效率最高,轉(zhuǎn)化的結(jié)果是細菌的遺傳特征發(fā)生變化，表現(xiàn)出與親代不同的遺傳性狀。,1928年Griffth發(fā)現(xiàn)了肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)莢膜轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，1944年Arery等證實了轉(zhuǎn)化物的化學(xué)本質(zhì)是DNA，證明生命的遺傳物質(zhì)是DNA。細菌轉(zhuǎn)化不僅是許多重要生命現(xiàn)象的起始和源頭，轉(zhuǎn)化機理的研究也一直是生命科學(xué)中一個非常重要的問題。本研究從肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化入手來探討其對細菌毒力表達的影響。,盡管肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化機制尚不十分清楚，但其過程大致可分為6個階段：1）肺炎鏈球菌被誘導(dǎo)成為感受態(tài)；2）外來DNA吸附于細菌壁上；3）核酸酶

7、與外來DNA結(jié)合；4）核酸酶降解其中一條鏈，使之成為單鏈（ssDNA）；5）ssDNA被攝入細菌胞內(nèi)6）進入細胞內(nèi)的ssDNA以同源重組的方式整合于肺炎鏈球菌的染色體上。,肺炎鏈球菌作為一種自然界廣泛存在的致病菌，肺炎鏈球菌可引起腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎和敗血癥等疾病。在70年代，未經(jīng)治療肺炎球菌感染死亡率為30-35%1，經(jīng)幾十年的研究，其感染引起的菌血癥死亡率仍高達25-30%2?？股氐膽?yīng)用由于耐藥菌的迅速增加而越來越失去治療價值。而最新的肺炎鏈球菌多價結(jié)合疫苗的特異性和有效性遠遠未達到令人滿意的程度3。尋找體內(nèi)新的毒力基因，揭示肺炎球菌致病機理，才能從根本上解決其感染的治療問題。,2、國

8、內(nèi)外現(xiàn)狀分析（綜述） 存在問題： 文獻復(fù)習(xí)不夠，對國內(nèi)外現(xiàn)狀缺乏真正了解， 提出的問題別人已解決-低水平重復(fù)。 對研究方法不熟悉，簡單移植或夸大其作用， 缺乏實際應(yīng)用的可行性-無法實現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)。 對國內(nèi)外現(xiàn)狀只是簡單羅列，缺乏歸納分析， 缺乏邏輯性和針對性-總結(jié)與表達不夠。,(,撰寫方法：要緊緊圍繞本次申請項目的主題。 1、從疾病切入，簡要論述國內(nèi)外研究成果， 并引出當(dāng)前的熱點研究方向。 2、從研究方向展開，較詳細地分析國內(nèi)外在 本方向的研究進展，引出闡明疾病發(fā)病機理或發(fā)明 新的治療方法的關(guān)鍵問題所在。 3、圍繞關(guān)鍵問題，詳細論述國內(nèi)外以往的研 究結(jié)果、當(dāng)前的現(xiàn)狀及今后的發(fā)展趨勢。綜合分析 后

9、提出目前尚未解決的問題。,4、對擬采用的技術(shù)方法進行介紹和分析。 成熟的方法要簡要介紹，重點闡明可以應(yīng)用于本研究的依據(jù)。 新方法要詳細介紹其原理，并闡明可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實驗依據(jù)。 要特別注意的問題：必須對項目中所運用的技術(shù)方法的原理、流程及在實際應(yīng)用中可能出現(xiàn)的問題要十分清楚，絕不能是一種簡單的移植。 例如：蛋白質(zhì)的融合表達，理論上可以實現(xiàn)融合， 但存在“活性、表達載體選擇、純化”等問題。 5、提出本項目的研究設(shè)想。,肺炎鏈球菌在正常情況下并不致病，40%的健康人咽喉部都有寄生2，其只是在一定條件下引起疾病，如病毒引起上呼吸道感染時、小兒高燒時常轉(zhuǎn)為肺炎。已經(jīng)肯定環(huán)境信號控制著細菌

10、毒力基因表達4。問題是肺炎鏈球菌致病是否與環(huán)境因素誘導(dǎo)其感受態(tài)的形成和轉(zhuǎn)化有關(guān)？從我們目前掌握的資料來看，國內(nèi)外尚未見到類似報道或想法。,目前對肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化機理的研究概況：操縱子comCDE為多種環(huán)境因素如Ca2+、O2濃度、生長階段、細菌密度等調(diào)節(jié)其感受態(tài)發(fā)生的唯一共同調(diào)控點5，6，7，也是肺炎鏈球菌控制許多蛋白質(zhì)基因表達的開關(guān)8。而已有文獻報道當(dāng)S.pn進入感受態(tài)后，可啟動一些蛋白包括自溶素的表達9，而自溶素是S.pn的一種比較重要的毒力因子,當(dāng)其被激活后可釋放細胞壁毒力因子和溶血素；最新研究發(fā)現(xiàn)，有三個可被感受態(tài)刺激蛋白（Csp）誘導(dǎo)表達的蛋白基因變異時，肺炎鏈球菌的毒力減弱10。,根

11、據(jù)以上研究背景，我們的研究思路為：采用插入失活的手段，分別使基因comC、D、E失活，從而構(gòu)建一系列感受態(tài)缺陷菌株。通過體內(nèi)毒力實驗及體外粘附實驗比較其與野生菌株的致病能力，以確定自然條件下形成的感受態(tài)與細菌致病的關(guān)系。,本研究從轉(zhuǎn)化過程中感受態(tài)的形成方面探討其對肺炎鏈球菌毒力影響，意義在于: 1.由于感受態(tài)的發(fā)生與細菌多種蛋白的表達調(diào)控有關(guān)，而其形成與多種環(huán)境因素相關(guān)，因此本課題為從體內(nèi)研究環(huán)境因素對于肺炎鏈球菌致病性的影響開辟了一條新的途徑。 2.同時感受態(tài)的形成可引起細菌發(fā)生轉(zhuǎn)化，可能會導(dǎo)致外源基因的整合，使肺炎鏈球菌的生物性狀發(fā)生改變，這也可能與其致病相關(guān)，本研究探討轉(zhuǎn)化過程對于肺炎鏈

12、球菌致病能力的影響，為進一步深入理解細菌的致病機理提供新的依據(jù)。,注意事項,注意邏輯性和層次感，并隨時點題。 文字表達要精雕細琢，避免假大空。 參考文獻必須提供作者全名、出處。 參考文獻必須引用近年的文獻。 要注意參考國內(nèi)相關(guān)專業(yè)知名專家的論著。 文獻回顧不能回避國內(nèi)外最新研究進展。,三、研究方案,1、研究目標(biāo) 存在問題： 目標(biāo)過大 撰寫要求： 有限目標(biāo)，與研究內(nèi)容相呼應(yīng),如：探索問題，明確關(guān)系，揭示規(guī)律， 闡明原理（機制），建立方法等,本研究的目標(biāo)是： 探討S.pn的感受態(tài)發(fā)生是否與其致病相關(guān)，重點闡明: 1） 體內(nèi)環(huán)境是否誘導(dǎo)S.pn的轉(zhuǎn)化過程（感受態(tài)的發(fā)生）。 2） S.pn毒力因子的表

13、達是否與體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)細菌感受態(tài)形成與轉(zhuǎn)化過程相關(guān)。,2、研究內(nèi)容： 存在問題：內(nèi)容過多，一個研究周期難以完成； 內(nèi)容分散，不能集中闡明研究目標(biāo)。 撰寫要求：內(nèi)容要適當(dāng)，確保研究周期內(nèi)完成； 與目標(biāo)相輔相成，為研究目標(biāo)服務(wù)。 篇幅要適度，注意與技術(shù)路線區(qū)別。 確定研究目標(biāo)、內(nèi)容的依據(jù)： 回答一個科學(xué)問題； 根據(jù)研究周期、資助強度來確定。,研究內(nèi)容(一)：通過S.pn的操縱子comCDE的基因失活及體外轉(zhuǎn)化實驗得到感受態(tài)缺陷的S.pn菌株。 1.分別設(shè)計S.pn的基因comC、comD、comE的中游PCR引物，構(gòu)建含有S.pn的comC、comD、comE中游基因序列的pEVP3質(zhì)粒。 2.將構(gòu)

14、建的pEVP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化S.pn得到感受態(tài)缺陷菌，并通過體外轉(zhuǎn)化實驗以確定其感受態(tài)缺陷。,研究內(nèi)容(二)：構(gòu)建可被熒光報告是否發(fā)生感受態(tài)的菌株。（cinA是S.pn感受態(tài)發(fā)生之后表達的蛋白基因，與外源基因的同源重組有關(guān)，因此將熒光蛋白基因接于其后，熒光表達可報告感受態(tài)的發(fā)生）1) 將綠色熒光蛋白（gfp）基因替代pEVP3質(zhì)粒中的LacZ基因，得到熒光報告質(zhì)粒。 2) 設(shè)計S.pn的cinA基因下游的PCR引物，構(gòu)建含有cinA基因下游序列的熒光質(zhì)粒(pEVP4)。將pEVP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)缺陷和非缺陷的S.pn，得到轉(zhuǎn)化菌株。,研究內(nèi)容(三)：體外轉(zhuǎn)化實驗以驗證感受態(tài)缺陷菌不能發(fā)生轉(zhuǎn)化，且熒光

15、表達的確可報告感受態(tài)的發(fā)生。 1)做體外轉(zhuǎn)化實驗，驗證所構(gòu)建的菌株能被熒光表達報告感受態(tài)的發(fā)生，且感受態(tài)缺陷菌不能發(fā)生轉(zhuǎn)化。 2)檢測基因comC、D、E的表達情況，進一步佐證所構(gòu)建的菌株為需要的菌株。,研究內(nèi)容(四)：通過感受態(tài)缺陷和非缺陷菌的粘附實驗及體內(nèi)毒力實驗分析細菌的感受態(tài)發(fā)生是否與其致病毒力相關(guān)。 1)分別用感受態(tài)缺陷和非缺陷菌處理A549細胞,觀察二者處理后細胞粘附的菌落的多少變化。 2)分別將感受態(tài)缺陷和非缺陷菌注射入BALB/ct小鼠體內(nèi)，觀察二者感染小鼠的致死率是否不同。 3) 分別將感受態(tài)缺陷和非缺陷菌滴入QS小鼠的鼻黏膜上，觀察二者感染小鼠的致死率是否不同。,研究內(nèi)容(

16、五)：檢測感受態(tài)缺陷及非缺陷菌基因comC、D、E在體外和體內(nèi)的表達情況，以進一步驗證細菌毒力的改變是否與其感受態(tài)的形成有關(guān)。 1) 合成基因comC、D、E的探針，做northern blot。 2）制備基因comC、D、E蛋白的抗體，做western blot。,3、擬解決的關(guān)鍵問題： 存在問題：未能抓住關(guān)鍵問題或抓得不準(zhǔn)。 撰寫要求：找出關(guān)鍵問題，寫出解決辦法。 什么是關(guān)鍵問題 ？ -研究過程中對達預(yù)期目標(biāo)有重要影響的 某些研究內(nèi)容或因素。 -為達預(yù)期目標(biāo)所必須掌握的關(guān)鍵技術(shù)或 研究手段。,4、研究方法 存在問題： 過于簡單：在實驗方案中只有方法名稱而無具體步驟。 過于繁雜：大量羅列一些

17、常規(guī)的實驗方法。 撰寫要求：以研究項目的需求為前提，盡量采用目前 最先進的方法和手段，并將其操作步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)體 現(xiàn)在技術(shù)路線當(dāng)中。,5、技術(shù)路線 存在問題： 不清楚，不詳細。 撰寫要求： 清晰、詳細、注意邏輯性。 撰寫方法： 以時間順序為主線設(shè)計技術(shù)路線 以研究內(nèi)容為主線設(shè)計技術(shù)路線 分大小標(biāo)題，突出邏輯關(guān)系。 詳細地寫清楚每個具體步驟。,6、可行性分析 理論分析 研究手段、方法分析 預(yù)實驗結(jié)果分析 所用特殊實驗材料（試劑）的分析 對所具備的實驗條件進行分析 對項目組成員搭配及其運用技術(shù)方法的能力分析,CP1250肺炎鏈球菌及質(zhì)粒pEVP3由Morrison教授贈送，人肺癌上皮A549細胞已

18、從中科院上海細胞所購得，流式細胞儀熒光記數(shù)測定在我校兒童醫(yī)院完成，PCR引物由北京賽北盛生物有限公司合成。 研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌在感受態(tài)產(chǎn)生后可使一些蛋白表達，其中包括自溶素，這表明其感受態(tài)的產(chǎn)生與細菌毒力的改變相關(guān)，因此研究轉(zhuǎn)化過程與細菌致病之間的關(guān)系是有事實基礎(chǔ)的。,目前的研究表明肺炎鏈球菌的感受態(tài)形成都受到操縱子comCDE的調(diào)控，因此失活基因comC或comD或comE可使菌株不能產(chǎn)生感受態(tài)，已有通過失活這幾種基因構(gòu)建感受態(tài)缺陷菌株的文獻報道。cinA為轉(zhuǎn)化相關(guān)基因，因此用它為報告基因以確定肺炎鏈球菌在體內(nèi)是否發(fā)生感受態(tài)，已有構(gòu)建cinA-LacZ融合基因菌株的報道。 本實驗室已掌握肺

19、炎鏈球菌體外轉(zhuǎn)化的方法，而粘附及毒力實驗的方法已有多篇報道。因此本研究的技術(shù)路線從理論上講是合理的，而方法是成熟的。,7、創(chuàng)新性 對創(chuàng)新的理解：創(chuàng)新性與先進性是有根本區(qū)別的。 原始創(chuàng)新： 填補空白或修改傳統(tǒng)的理論； 新技術(shù)、新方法的發(fā)明創(chuàng)造。 跟蹤創(chuàng)新： 在前人工作基礎(chǔ)上補充、完善現(xiàn)有理論； 對原有技術(shù)、方法進行修改后產(chǎn)生112的 效果。,細菌在宿主體內(nèi)是處于一個生存競爭的戰(zhàn)場，其是否致病取決于機體內(nèi)環(huán)境與細菌相互斗爭、相互適應(yīng)的結(jié)果。在體內(nèi)尋找細菌毒力因子的表達是目前研究病原菌致病機理的熱點。細菌致病機理已研究多年，由環(huán)境信號誘導(dǎo)細菌感受態(tài)形成影響毒力表達的路線，國外鮮見報道。本研究從缺失肺

20、炎鏈球菌感受態(tài)形成的關(guān)健環(huán)節(jié)comC、D、E基因入手，深入探討環(huán)境信號、細菌轉(zhuǎn)化過程與毒力表達的關(guān)系，這是該項研究的特色和創(chuàng)新之處。通過本項研究可完成：,1）分析肺炎鏈球菌感受態(tài)的形成是否受到comCDE操縱子調(diào)控。 2）感受態(tài)的形成是否可改變體內(nèi)肺炎鏈球菌毒力，從而導(dǎo)致其致病能力的改變。 本研究為進一步尋找毒力基因、理解細菌的致病機理提供了理論依據(jù)，在研究思路上有所創(chuàng)新。,8、年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果 年度研究計劃： 按年度列出：研究內(nèi)容及其階段目標(biāo)；擬組織 的重要學(xué)術(shù)交流活動、國際合作與交流計劃等。 預(yù)期研究結(jié)果： 理論成果：建立/豐富/補充/填補 . 技術(shù)方法：建立/完善 . 專 利：

21、可望獲得 論 文：國際、國內(nèi) 人才培養(yǎng)：青年科技骨干、博碩研究生,研究計劃及預(yù)測進展(略) 預(yù)期的研究成果,預(yù)期的研究成果 1闡明體內(nèi)環(huán)境信號是否可誘導(dǎo)S.pn的轉(zhuǎn)化過程（感受態(tài)的發(fā)生）。 2. S.pn毒力因子的表達是否與體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程有關(guān)。 3. 通過對感受態(tài)缺陷菌在小鼠體內(nèi)毒力的研究，為進一步尋找毒力因子以及研究轉(zhuǎn)化對肺炎鏈球菌的致病影響提供理論和實驗依據(jù)。 4. 本研究完成后可提供一定數(shù)量的較高水平論文在國內(nèi)外發(fā)表。,四、研究基礎(chǔ) 1、工作基礎(chǔ) 存在問題： 內(nèi)容過簡； 與申請項目無關(guān)。 撰寫要求： 要介紹與申請項目直接相關(guān)的研究結(jié)果； 提供有關(guān)的研究論文、成果及專利等材料； 以往

22、應(yīng)用與申請項目有關(guān)的技術(shù)方法的經(jīng)歷。 工作積累也要包括項目組成員的所有信息。,2、工作條件 包括已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和 擬解決的途徑，包括利用國家重點實驗室和部門開 放實驗室的計劃與落實情況。 3、申請者及項目組成員簡歷 所有項目組成員的工作簡歷及發(fā)表相關(guān)論著均 應(yīng)介紹，尤其是要針對項目組成員的分工介紹研究 工作經(jīng)歷。,第三部分 科 研 選 題,一、科研選題的意義 “提出一個問題往往比解 決一個問題更重要，因為解決一個問題也許僅僅是一個數(shù)學(xué)上或?qū)嶒炆系募寄芏?。而提?新的問題，新的可能性，以新的角度去看舊的問題，卻需要創(chuàng)造性的想象力，而且標(biāo)志著科學(xué)的真正進步。” 選擇課題、確定主攻方向是科學(xué)研究中具 有戰(zhàn)略意義的首要問題。 重大生命現(xiàn)象、生命事件的起始、源頭和過程。,二科研選題的原則 1、需要性原則：