EST-SSSR分子標(biāo)記的建立

1、.姓名： 謝奕 王鵬潮 學(xué)號： 3120100285 310 日期： 2015.03.19 地點(diǎn)： 農(nóng)生環(huán)A253 課程名稱： 分子育種學(xué) 指導(dǎo)老師： 崔海瑞 成績： 實(shí)驗(yàn)名稱： EST-SSR標(biāo)記的開發(fā) 實(shí)驗(yàn)類型： 綜合型 分工： 謝奕-EST獲取+結(jié)果分析+引物設(shè)計(jì) 王鵬潮-SSR篩選+SSR統(tǒng)計(jì)+結(jié)果分析 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?1、了解SSR標(biāo)記的開發(fā)策略；2、明確EST-SSR標(biāo)記的特點(diǎn)和建立EST-SSR標(biāo)記的原理；3、熟悉EST-SSR標(biāo)記的過程，掌握EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理1、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容通過從現(xiàn)有的EST文庫中獲取序列，再用軟件對其進(jìn)行SSR查找與引物設(shè)計(jì)。2

2、、實(shí)驗(yàn)原理1）微衛(wèi)星DNA真核基因組中存在著大量的串聯(lián)重復(fù)序列, 按重復(fù)單位的大小, 串聯(lián)重復(fù)可分為衛(wèi)星（重復(fù)序列70bp）、小衛(wèi)星（670bp）和微衛(wèi)星DNA（1-6bp）。微衛(wèi)星（Microsatellite, MS）是指基因組中以少數(shù)幾個核苷酸（多數(shù)為24個）為單位多次串聯(lián)重復(fù)組成的長達(dá)幾十個核苷酸的序列，又稱簡單序列重復(fù)（Simple Sequence Repeats , SSR）或短串聯(lián)重復(fù)（Short Tandem Repeats , STR）、或簡單序列長度多態(tài)性（Simple Sequence Length Polymorphism，SSLP）。重復(fù)數(shù)目是可變的，重復(fù)序列兩側(cè)都

3、有物種特異性的保守序列，所以通過設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，就可以檢測到不同的DNA 區(qū)域重復(fù)數(shù)目的多態(tài)性。2）SSR標(biāo)記的開發(fā)策略SSR包括基因組SSR（genomic SSR或gSSR）和表達(dá)區(qū)EST-SSR（genic-SSR或EST-SSR）。gSSR是基于基因組序列開發(fā)的，開發(fā)起來費(fèi)時費(fèi)力，而且因?yàn)樘结樀木壒?，種類比較局限。而ESTSSR則是存在于表達(dá)的基因序列內(nèi)的SSR，不包括內(nèi)含子及非表達(dá)的調(diào)控區(qū)等之中的SSR，通常三個堿基重復(fù)的占多數(shù)，與不引起基因翻譯過程中移碼現(xiàn)象的發(fā)生相一致。建立SSR標(biāo)記的前提是必需知道重復(fù)序列兩列的DNA序列。與其他標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有如下特點(diǎn)：（1）

4、數(shù)量較為豐富，覆蓋整個染色體組；（2）具有多等位基因特性，信息含量高；（3）以孟德爾方式遺傳，呈共顯性；（4）易于利用PCR技術(shù)分析，對DNA數(shù)量和純度要求不高，結(jié)果重復(fù)性好；（5）每個位點(diǎn)由引物序列決定，便于交換。近年來，EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)引起關(guān)注。數(shù)量迅速增加的ESTs為開發(fā)新的SSR標(biāo)記提供了寶貴的資源，各種植物中約有5-10%的EST含有可用于建立標(biāo)記的SSR。建立EST-SSR標(biāo)記要經(jīng)濟(jì)得多，而且EST-SSR標(biāo)記來源于DNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，比gSSR標(biāo)記具有更高的通用性，此外，標(biāo)記-信息量高。開發(fā)EST-SSR原理基于生物信息學(xué)手段的可開發(fā)SSR的方法。在數(shù)據(jù)庫中已存在大量的可免

5、費(fèi)下載EST序列數(shù)據(jù)并剔除冗余EST序列，再通過SSR搜索軟件獲得SSR位點(diǎn)信息，然后根據(jù)SSR位點(diǎn)兩側(cè)的核酸序列信息的統(tǒng)計(jì)與分析，利用軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的SSR引物，進(jìn)而開發(fā)SSR標(biāo)記，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測。3）不同的SSR標(biāo)記開發(fā)方法比較傳統(tǒng)方法開發(fā)SSR：傳統(tǒng)的SSR 分子標(biāo)記開發(fā)方法簡單、易掌握。這種方法在許多作物的SSR 標(biāo)記開發(fā)中被廣泛應(yīng)用，現(xiàn)已獲得的基因組SSR 標(biāo)記中，四分之三以上的是利用傳統(tǒng)開發(fā)方法獲得的。但必須對每個克隆進(jìn)行篩選鑒定，工作量大，需花費(fèi)大量人力，財(cái)力，而且效率較低，植物中已報道的陽性克隆比率約為2 %3 % ，成功獲得引物的機(jī)率則更低。圖1 傳統(tǒng)SS

6、R開發(fā)方法流程圖通過富集策略開發(fā)SSR標(biāo)記：為簡化技術(shù)環(huán)節(jié)，提高效率，降低開發(fā)成本，通過研究建立了多種采取富積策略的SSR標(biāo)記開發(fā)方法?；赗APD 的開發(fā)策略：將RAPD 隨機(jī)引物與SSR連接，作為PCR擴(kuò)增引物或者將RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物條帶用SSR探針進(jìn)行Southern雜交，可以有效富集重復(fù)序列。雖然目前尚不清楚RAPD有利于SSR 富集的機(jī)理,但這一發(fā)現(xiàn)大大激發(fā)了人們探求富集SSR方法的興趣。PIMA ( PCR Isolation of Microsatellite Arrays)方法：先用RAPD引物從基因組中獲得隨機(jī)擴(kuò)增片段，擴(kuò)增片段經(jīng)載體克隆后，用特異SSR及載體引物對克隆陣列進(jìn)行

7、PCR檢測篩選含SSR克隆，對陽性克隆測序。以上兩種利用RAPD 富集SSR的報道，避免了基因組文庫的構(gòu)建，有利于節(jié)省時間和人力、物力，但基于此方法進(jìn)行大量SSR 分離的成功報道并不多。4）PCR引物設(shè)計(jì)原則引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高；太長則比較浪費(fèi)，且難以合成。引物擴(kuò)增跨度：1kb之內(nèi)是理想的擴(kuò)增跨度，2kb左右是有效的擴(kuò)增跨度，而超過3kb 就無法得到有效的擴(kuò)增. 特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避

8、免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處。引物5端對擴(kuò)增特異性影響不大，可在引物設(shè)計(jì)時加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等。通常應(yīng)在5端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個保護(hù)堿基。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性所擴(kuò)增產(chǎn)

9、物本身無穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，影響產(chǎn)量。引物量：每條引物的濃度0.11umol或10-100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。三、主要儀器設(shè)備計(jì)算機(jī)四、操作方法與實(shí)驗(yàn)步驟1、EST序列的獲取可從數(shù)據(jù)庫中直接下載，主要的數(shù)據(jù)庫有：美國國立生物技術(shù)信息中心 GenBank/NCBI ( National Center for Biotechnology Information )：；目前有72098808條EST序列，其中 植物EST序列241583

10、63條，涉及到895個物種。其中單子葉植物：7263423條：玉米-2019114；水稻-1333022；小麥-11116126。歐洲生物信息研究所 European Bioinformatics Institute (EBI)：http:/www.ebi.ac.uk/index.html ，包含European Nucleotide Archive；日本DNA數(shù)據(jù)庫DDBJ（DNA Data Bank of Japan）：http:/www.ddbj.nig.ac.jp/；先以從NCBI下載EST序列為例：首先下直接填寫植物名稱后按search，再在下搜索欄直接填寫植物種屬名稱后按searc

11、h，出現(xiàn)以下界面時選EST并點(diǎn)擊植物名后，按上述方法下載即可。2、去冗余（EST序列前處理，在本次實(shí)驗(yàn)中由于軟件收費(fèi)略去）采用EST分析軟件前處理和剔除冗余EST：直接獲取的EST中包含一些低質(zhì)量片段（100 bp），少量載體序列及末端存在polyA/T“尾巴”的序列，在開發(fā)標(biāo)記之前應(yīng)去除這些“噪音”去冗余。這些處理可通過一些軟件來進(jìn)行：cross-match（/）或EST-trimmer （http:/www.pgrc.ipk-gathersleben.de/misa/download/est-trimmer.pl），去除“尾巴”和屏蔽載體序列。可用生物

12、信息學(xué)軟件去冗余：如Cluster W、CD-HIT /cd-hi/（若只考慮建立標(biāo)記而不求統(tǒng)計(jì)相關(guān)參數(shù)，也可搜索后聚類，剔除冗余的SSR）。3、SSR的搜尋可利用以下一些軟件在線搜索SSR：（1）RepeatMasker(/cgi-bin/WEBRepeatMasker) （2）SSRIT(/db/searches/ssrtool)：選擇搜索參數(shù)：最大值；粘貼序列 （100Kb）；獲得結(jié)果和統(tǒng)計(jì)相關(guān)參數(shù)。（3）Sputnik (http:/cbi.

13、labri.fr/outils/Pise/spumik.html)也可利用MISA、DNAman、ssrhunter或ssrfinder等進(jìn)行本地化搜索SSR，注意制定搜索SSR的標(biāo)準(zhǔn)。4、設(shè)計(jì)SSR引物利用軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的SSR引物，常用引物設(shè)計(jì)軟件有primerpremier 5.0和oligo 6.0。也可以用在線設(shè)計(jì)軟件，如primer3.0 （http:/frodo.wi.mitedu/cgi-bin/primer3/primer3_www. Cgi）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。5、建立標(biāo)記（略去）PCR實(shí)驗(yàn)：溫度、濃度、混合模板擴(kuò)增多態(tài)性及其檢測：不同材料、聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄

14、和處理選取NCBI的EST數(shù)據(jù)庫中小麥Triticum aestivum中的前1000條進(jìn)行SSRIT分析，后選取5條用primeprime5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，得到如下結(jié)果。表1 1000條小麥EST中SSR的出現(xiàn)頻率 重復(fù)類型基元種數(shù)SSR數(shù)目占全部SSR比例（%）出現(xiàn)頻率（%）單核苷酸2510.60.5二核苷酸41123.41.1三核苷酸182961.72.9四核苷酸224.30.2總計(jì)26471004.7表2 1000條小麥EST二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元分析 重復(fù)基元數(shù)量發(fā)生頻率（%）所占比例（%）單核苷酸c/g30.360.0t20.240.0二核苷酸t(yī)c/ga80.872.7tg1

15、0.19.1at10.19.1ag10.19.1三核苷酸ggc/gcc60.620.7cgg/ccg40.413.8gcg30.310.3tcg/cga20.26.9ggt/acc20.26.9gca20.26.9gag20.26.9ctg20.26.9tcc10.13.4gac10.13.4cac10.13.4ata10.13.4agc10.13.4aag10.13.4表3 1000條小麥EST中SSR的重復(fù)長度和性質(zhì) 重復(fù)基元長度（bp）重復(fù)性質(zhì)變化范圍平均長度完全重復(fù)不完全重復(fù)總計(jì)二核苷酸14-2414.411011三核苷酸15-14122.329029四核苷酸2020202合計(jì)14-1

16、411847047表4 對小麥EST-SSR設(shè)計(jì)的引物（其中5對） 引物編號重復(fù)基元預(yù)期產(chǎn)物bpTmGC%序列(53)gi|324575488tg（12）34356.150GGAGTATGTATGTCGAGCCAGT54.257.9CCTCTTGACCTACCCGTTCgi|383748333gcg（5）34660.466.7TAGAACCACCCGCCCGTC5857.9GTGCTGCTGTGCTGATGGAgi|383748249gcc（5）28258.564.7CTGTCGTGGCGGTCCAA56.457.9CTTCAGCCAGCAGCAAGTCgi|383748634gag（6）27

17、651.550GATGGGTCCTTGGATTTC49.260CGCCGTGATAAACCCgi|383748369ga（6）18556.639.1TGAGAAATTCAGGGTAAACAGTG57.261.1CCACCGCCGACTACTGAA六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析從結(jié)果中可以得知，小麥EST序列中的SSR種類較為豐富，達(dá)到26種之多，主要以三核苷酸重復(fù)為主（推測三核苷酸重復(fù)類型居多的可能是因?yàn)镋ST編碼區(qū)序列以三核苷酸重復(fù)類型為主，而遺傳密碼子均為三聯(lián)體核苷酸類型），其中g(shù)/c組合成的SSR所占比例較高，但SSR整體的出現(xiàn)頻率并不高，不足5%，平均長度為18bp。由于使用的軟件采用的程序問題，

18、并沒有檢測到不完全重復(fù)，而由于樣本數(shù)量的限制，很可能還有其他堿基組合類型，甚至?xí)兴暮塑账嵋陨系闹貜?fù)，上述統(tǒng)計(jì)的結(jié)果并不能完全代表小麥EST中的SSR的性質(zhì)。七、討論、心得表5 基于PCR的SSR標(biāo)記分離方法綜述方法概述優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)傳統(tǒng)構(gòu)建基因組文庫，獲得高覆蓋率的微衛(wèi)星位點(diǎn)需要同位素標(biāo)記，對人有害，成本高生物素標(biāo)記，獲得富集文庫的方法相對高效重復(fù)片段多，操作復(fù)雜且假陽性高從ISSR擴(kuò)增片段中篩選SSR方法（SSR本身作為引物擴(kuò)增2個SSR間的序列）成功率較高，且大部分為多態(tài)性較高的完全性微衛(wèi)星需要2次測序分別獲得SSR兩側(cè)序列和引物，在成本上不是最優(yōu)化RAPD隨機(jī)擴(kuò)增的微衛(wèi)星分離法PIMA不需要

19、重新找對應(yīng)克隆、擴(kuò)大培養(yǎng)和提取質(zhì)粒DNA的過程序列標(biāo)簽微衛(wèi)星STMP（利用SAGE原理獲得含SSR位點(diǎn)的序列標(biāo)簽文庫，以此來分離基因組中的目標(biāo)位點(diǎn)）大通量的測序獲得多個SSR位點(diǎn)，避免同位素標(biāo)記方法篩選文庫的復(fù)雜過程，降低了成本選擇性擴(kuò)增微衛(wèi)星分析SAMPL（AFLP隨機(jī)酶切基因組，選擇性擴(kuò)增含SSR位點(diǎn)的片段，需要捕獲鏈霉親和素包被的磁珠，5錨定SSR引物增加了SSR在DNA中的比例）擴(kuò)增產(chǎn)物的復(fù)雜性降低，SSR比例增大，節(jié)省成本利用熒光標(biāo)記的ISSR-PCR方法（熒光標(biāo)記的通用ISSR錨定引物在PCR擴(kuò)增）檢測PCR產(chǎn)物時比一般電泳的信息量高、更敏感、快速微衛(wèi)星擴(kuò)增文庫MAL（結(jié)合擴(kuò)增片段

20、長度的多態(tài)性和基于PCR富集文庫的方法）避免了通過雜交富集的步驟，較少的平臺就能實(shí)現(xiàn)對SSR的分離，實(shí)驗(yàn)周期短需要進(jìn)行兩次測序，測定的重復(fù)率較高，相應(yīng)得率下降，不能顯示SSR的分布情況和出現(xiàn)頻率上表整理自課件與文獻(xiàn)調(diào)研的總結(jié)。SSR作為生物標(biāo)記的優(yōu)勢：1）均勻、隨機(jī)、廣泛地分布在整個基因組中，可揭示的多態(tài)性高。微衛(wèi)星常見的有二、三、四核苷酸重復(fù)序列，約占真核基因組的 5%; 其基本構(gòu)成單位為 2 6 bp，多位于編碼區(qū)附近，也可位于基因內(nèi)的間隔區(qū)、內(nèi)含子和調(diào)控區(qū)域；微衛(wèi)星在基因組中數(shù)目巨大，據(jù)估計(jì)，真核基因組中平均每6 kb就存在一個微衛(wèi)星序列；人類基因組中約有(5104)(10104)個(CA)重復(fù)，重復(fù)次數(shù)一般為1560次，重復(fù)單位相同，其長度一般小于200 bp。2）具有多等位基因，提供的信息量大。有研究對96個大豆材料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)平均每個座位有11 26 個等位位點(diǎn)。3）共顯性，以孟德爾方式遺傳，可鑒