HBSAg測定和ABO血型鑒定.ppt

1、ABO血型鑒定及HBSAg測定,廖振林 食品學院 2006年秋,凝集反應,實驗目的】 1了解凝集反應的原理、基本類型及其臨床意義。 2掌握玻片凝集實驗、間接凝集實驗的實驗方法和結果分析,概述,在一定濃度的電解質(zhì)溶液中，顆粒性抗原與相應抗體結合后，出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，稱為凝集反應。凝集反應是一種定性的檢測方法，也可以進行半定量檢測。凝集反應可分為直接凝集反應和間接凝集反應。由于凝集反應方法簡便，目前在臨床檢驗中仍被廣泛應用,一、直接凝集反應 細菌、細胞等顆粒性抗原，在適當電解質(zhì)參與下可直接與相應抗體結合出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應 。常用的凝集試驗有玻片法和試管法兩種。 玻片凝集試驗ABO血型鑒

2、定 玻片凝集試驗為定性試驗，一般用已知抗體作為診斷血清，與受檢顆?？乖?，如菌液或紅細胞抗原各加一滴在玻片上，混勻，數(shù)分鐘后即可用肉眼觀察凝集結果，出現(xiàn)凝集顆粒的為陽性。此法簡便，快速，適用于從病人標本中分離得到的菌種的診斷或分型，也可用于紅細胞ABO血型的鑒定,實驗原理】 人類ABO血型抗原主要有A和B兩種，根據(jù)紅細胞表面這兩種抗原的有無可把血型分為四種。據(jù)此，將抗A和抗B抗體分別與待測紅細胞混合，抗A或（和）抗B抗體與紅細胞表面上的相應抗原結合而引起紅細胞凝集，據(jù)其凝集情況便可判定出受試者的血型。 ABO血型的劃分,實驗材料】 1ABO血型鑒定試劑盒內(nèi)含抗A分型試劑和抗B分型試劑各1支。 2

3、一次性采血針1枚、潔凈玻片2塊、75酒精、滅菌棉簽。 384消毒液,二、間接凝集反應 將可溶性抗原或抗體先吸附于適當大小的顆粒性載體表面（這種載體與免疫無關），然后與相應抗體或抗原結合，在適量的電解質(zhì)存在下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應。 根據(jù)載體的不同可將間接凝集反應分為：間接血細胞凝集試驗、間接乳膠凝集試驗（及間接乳膠凝集抑制試驗）和金黃色葡萄球菌協(xié)同凝集試驗等,間接凝集抑制試驗妊娠試驗 【實驗原理】 可溶性抗原致敏的乳膠顆粒與相應抗體作用可使乳膠顆粒凝集，此為間接乳膠凝集試驗。若使抗體先與可溶性抗原作用，再加入該抗原致敏的乳膠顆粒，則乳膠凝集被抑制，此為間接乳膠凝集抑制試驗。 孕

4、婦尿中絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。HCG與抗HCG抗體先作用后，再加入HCG致敏的乳膠顆粒，不出現(xiàn)凝集反應，此為妊娠試驗陽性；非孕婦尿中HCG含量不足以消耗掉抗HCG抗體，抗體與后加入的HCG致敏乳膠結合呈現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則妊娠試驗陰性,實驗材料】 1妊娠診斷試劑盒：內(nèi)含抗血清（抗HCG）、乳膠抗原（HCG致敏） 各一支 2待檢尿、孕婦尿、正常尿。 3有格玻片和毛細吸管等,實驗方法】 1在玻片的第1、第2和第3格內(nèi)分別加1滴正常尿、待檢尿及孕婦尿。 2每格內(nèi)加入妊娠診斷試劑抗血清1滴。輕輕搖動12 min使其充分混勻。 3每格加入乳膠抗原1滴，輕輕搖動玻片35 min后觀察結果，記錄各

5、標本有無凝集現(xiàn)象,實驗結果】 孕婦尿格呈均勻渾濁乳狀液，無凝集，妊娠試驗陽性；正常尿格出現(xiàn)白色細小凝集物，隨時間延長凝集物變成小塊狀，妊娠試驗陰性。待檢尿若為乳狀液，妊娠試驗陽性；若出現(xiàn)凝集，則妊娠試驗陰性,注意事項】 1試驗所用診斷試劑用前應充分搖勻，而且應在有效期內(nèi)使用。 2加樣用的滴管及混勻用的牙簽不能共用。 3加樣不宜太多，玻片應始終保持水平，以防兩格之反應液相混,實驗思考】 1記錄血型鑒定試驗、乳膠妊娠診斷試驗的材料、方法及結果判定（可用圖示或表格方式表示）。 2直接凝集試驗與間接凝集試驗有何不同？ 3在各凝集試驗中都設有相應對照，有何意義？若對照出現(xiàn)異常如何分析及解決,沉 淀 反

6、應,實驗目的】 1掌握對流免疫電泳的基本原理、方法。 2熟悉瓊脂單向擴散，雙向擴散的基本原理、方法、結果分析及臨床用途。 3了解火箭免疫電泳的基本原理、方法,概述】 可溶性抗原如血清、毒素、細菌浸出液等與相應抗體結合，當兩者比例合適、并有適量電解質(zhì)存在時，形成肉眼可見的沉淀物或沉淀線，稱為沉淀反應。 沉淀反應是臨床上最常用、最基本的方法之一。它的種類較多，可分為瓊脂擴散試驗、免疫電泳試驗、環(huán)狀沉淀試驗及絮狀沉淀試驗等,一、瓊脂擴散試驗 利用可溶性抗原與相應抗體在半固體瓊脂內(nèi)進行擴散，當兩者比例合適時，就出現(xiàn)白色沉淀線，為陽性反應。本試驗可在試管內(nèi)、平皿中以及玻片上的瓊脂內(nèi)進行操作。 瓊脂擴散試

7、驗可分為單向瓊脂擴散試驗和雙向瓊脂擴散試驗。 (一)單向瓊脂擴散試驗 (二)雙向瓊脂擴散實驗,二、對流免疫電泳 【實驗原理】 帶電的膠體顆?？稍陔妶鲋幸苿樱苿臃较蚺c膠體顆粒所帶電荷有關。多數(shù)蛋白質(zhì)抗原在堿性緩沖液中帶負電荷，在電泳時從負極向正極移動?？贵w屬球蛋白，在堿性緩沖液只帶微弱的負電荷，而且相對分子質(zhì)量較大，電泳力較小，在瓊脂電滲力作用下反而由正極向負極移動。這樣就使抗原和抗體定向?qū)α?，在兩孔間相遇時發(fā)生反應，并在比例合適處形成肉眼可見的白色沉淀線。這種將雙向瓊脂擴散和電泳技術結合在一起的方法稱為對流免疫電泳,實驗材料】 1電泳緩沖液：pH 8.6巴比妥-鹽酸緩沖液。 2抗體：抗AFP

8、。 3抗原：AFP陽性血清、待檢病人血清。 41瓊脂 用pH 8.6巴比妥-鹽酸緩沖液配制，冰箱保存?zhèn)溆谩?5電泳儀、電泳槽、載玻片、打孔器、10 ml吸管、移液器、移液頭,實驗方法】 1制板 2打孔 3加樣 將抗原加入瓊脂板上有標記孔側的小孔中，抗體加入另一側小孔中，以加滿為度，不可溢出孔外。(如圖示) 4電泳 將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上，抗原側置陰極端，抗體孔側置陽極端。搭好橋后，接通電源，控制電壓610 V/cm板長，電泳約3060 min。 5關閉電源，取出瓊脂板，觀察結果,實驗結果】 將玻片對著強光源，先觀察AFP陽性血清孔與抗體孔之間的白色沉淀線，然后再觀察待檢血清孔與抗體孔之間

9、是否也有沉淀線出現(xiàn)，如有沉淀線，則表示AFP試驗陽性，否則AFP試驗為陰性,注意事項】 1電泳時電流不宜過大，以免蛋白變性。 2抗原和抗體的電極方向不能搞錯。 3抗原和抗體的濃度要適當，抗原太濃或太稀都不易出現(xiàn)沉淀線。 4電泳所需時間與孔間距離有關，距離越大，電泳時間越長,實驗思考】 1單向擴散與火箭電泳、雙向擴散與對流免疫電流比較各有何特點？ 2對流免疫電泳中，抗原為何放陰極端，抗體為何放陽極端,ELISA夾心法檢測HBsAg,實驗目的】 1熟悉ELISA的原理、夾心法。 2了解免疫標記技術的原理。 【實驗原理】 采用多克隆抗-HBS包被反應板，加入待測標本，同時加入單克隆抗-HBs-HRP

10、，如待測標本中含有HBsAg時就與包被抗-HBs、抗-HBs-HRP結合形成復合物，加入TMB底物（3，3 ，5，5“-四甲基聯(lián)苯胺）產(chǎn)生顯色反應，反之就無顯色反應,實驗材料】 1乙肝病毒HBsAg酶聯(lián)免疫診斷試劑盒（由廠商供應）。 預包被微孔條（用純化的抗-HBs包被）。 酶聯(lián)試劑（用HRP標記的抗HBs）。 HBsAg陽性對照。 HBsAg陰性對照。 洗滌液(濃縮液)。 顯色劑A、B。 終止液（2 mol/L H2SO4）。 2微量加樣器，混合振蕩器，酶標測定儀，恒溫箱，吸水紙，蒸餾水等,實驗方法】 1配液 濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水25倍稀釋使用。 2編號 將微孔條固定于支架，按序編號

11、。 3加樣 分別用加樣器加待檢血清和陰、陽性對照50 1（1滴）于相應孔中，設空白對照孔（加50 1洗滌液）。 4加酶 除空白對照外，每孔加酶聯(lián)試劑50 l（1滴）。 5溫育 振蕩混勻，置37 30 min后取出。 6洗滌 甩去孔內(nèi)液體，扣干，用洗滌液注滿各孔，靜置2 s，甩干，重復5次后拍干。 7顯色 每孔加顯色劑A、B各50 l（1滴）振蕩混勻，37暗置15 min,實驗結果】 1目測 在白色背景下觀察各孔顯色情況，有明顯藍色者為陽性，無色者為陰性。 2酶標儀檢測 每孔加終止液50 l（1滴）混勻，用酶標儀450 nm波長測各孔A值。 計算P/N值： 結果判斷：P/N值2.1者為陽性，2.1者判為陰性（陰性對照孔A值小于0.05時以0.05計,注意事項】 1試