細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞

1、第十四章 細(xì)胞增殖調(diào)控與癌細(xì)胞,檢驗(yàn)點(diǎn)（checkpoint,在細(xì)胞周期中，決定細(xì)胞周期能否繼續(xù)向前運(yùn)轉(zhuǎn)的某一特定時期，稱為檢驗(yàn)點(diǎn),細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)是細(xì)胞周期調(diào)控的一種機(jī)制, 主要是確保周期每一時相事件的有序、全部完成并與外界環(huán)境因素相聯(lián)系,G1/S檢驗(yàn)點(diǎn) ：啟動DNA的復(fù)制,S期檢驗(yàn)點(diǎn)：檢驗(yàn)DNA復(fù)制是否完畢,G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)：能否開始分裂,中-后期檢驗(yàn)點(diǎn)：紡錘體組裝的檢驗(yàn),細(xì)胞周期中的主要的檢驗(yàn)點(diǎn),1、MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用 成熟促進(jìn)因子(maturation promoting factor，MPF）, 又稱有絲分裂因子(Mitosis-promoting factor), 早期稱為M期促進(jìn)因

2、子(M-phase promoting factor, MPF)，是指M期細(xì)胞中存在的促進(jìn)細(xì)胞分裂的因子,1970年，Johnson and Rao將同化的不同細(xì)胞周期的細(xì)胞誘導(dǎo)融合 早熟染色體凝集（染色體超前凝集）(Premature chromosome condensation,PCC)超前凝集染色體,卵細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)移植實(shí)驗(yàn),2、MPF與 CDK激酶 (周期蛋白依賴性蛋白激酶) (1) MPF的構(gòu)成 1988年， Maller實(shí)驗(yàn)室的Lohka將非洲爪蟾的MPF純化。由兩個不同的亞基組成的異質(zhì)二聚體: p32和p45(非洲爪蟾)，使蛋白質(zhì)底物磷酸化。 1983年 Tim Hunt發(fā)現(xiàn)海膽的

3、卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期振蕩，命名為周期蛋白(cyclin A和B)。后來發(fā)現(xiàn)各類動物來源的細(xì)胞周期蛋白mRNA均能誘導(dǎo)蛙卵的成熟,MPF：cyclin-Cdk 周期蛋白稱為調(diào)節(jié)亞基 催化亞基從ATP上轉(zhuǎn)移磷酸到絲氨酸和蘇氨酸殘基上,催化亞基 是絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶 其活性有賴于周期蛋白，故該蛋白稱為周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent protein kinases,Cdks); 調(diào)節(jié)亞基：周期蛋白(cyclin,1960s Leland Hartwell,1970s Paul Nurse 分別以芽殖酵母和裂殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料，利用溫度敏感突變株，發(fā)現(xiàn)許多與細(xì)胞

4、分裂有關(guān)的基因(cell division cycle gene, cdc基因)。 裂殖酵母cdc2、芽殖酵母cdc28突變型在限制溫度下無法分裂； cdc2和cdc28都編碼一個34KD的蛋白激酶，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行。 MPF=p34cdc2(p34cdc28)+ p56cdc13 (cyclinB) weel和cdc25分別表現(xiàn)為抑制和促進(jìn)CDC2的活性。 wee1突變型則提早分裂，cdc25突變型細(xì)胞體積增大而不分裂,Cdc 25 M期: A, B,含有周期蛋白框：介導(dǎo)與不同CDK結(jié)合,含有破壞框：將泛素（遍在蛋白）連接到破壞框上,cell cycle regulation,4、細(xì)胞周期

5、運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控,1）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用 M期CDK1（p34cdc2）的激活起始于分裂期cyclinB的積累。 結(jié)合cyclin B的CDK1被Wee1/mik1激酶將Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK1/cyclin B不斷積累。 在M期，Wee1/mik1激酶的活性下降，在蛋白水解磷酸酶cdc25c使CDK1的Thr14和Tyr15去磷酸化，去除了CDK1活化的障礙。 CDK1的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK活化激酶(CDK1 activating kinase CAK)的作用下完成的,CDK activating,G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激

6、酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用,CDK1的調(diào)節(jié)與活化; CAK=CDK1-Activiting Kinase,2）M期周期蛋白與細(xì)胞分裂中期向后期轉(zhuǎn)換,在中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時，激活后期促進(jìn)因子復(fù)合體 (Anaphase Promoting Complex，APC)將泛素連接在cyclinB上，cyclinB被蛋白酶體(proteasome)降解，完成一個細(xì)胞周期。 分裂期周期蛋白N端有一段序列與其降解有關(guān)，稱降解盒(destruction box)。 泛素由76個氨基酸組成，高度保守。共價結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識別和降解，這是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑。 26S蛋白酶體是一個

7、大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽,APC活性調(diào)節(jié)：兩類 正調(diào)控因子：cdc20/Fizzy, cdh1/Fzy等 負(fù)調(diào)控因子：Emi1, Emi2, Mad2, BubR1等,APC種類：15種，如cdc16, cdc23, cdc27和BimE等,泛素與周期蛋白的降解：多聚泛素化作用(polyubiquitination) 泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme, E1) 泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2) 泛素連接酶(ubiquitin ligase, E3,APC的活性調(diào)節(jié)控制周期蛋白B的降解 當(dāng)MPF的活

8、性在有絲分裂中期達(dá)到最高峰時, 它被CDK所激活，即APC磷酸化后被激活； 接著發(fā)生周期蛋白B遍在蛋白多聚化, 引起周期蛋白B的降解； 由于周期蛋白B是MPF的一個必需亞基, 它的降解勢必導(dǎo)致MPF的失活； 在G1期的后期,APC失活,使得周期蛋白B的濃度升高,同時提高M(jìn)PF的活性, 以便進(jìn)入下一個有絲分裂期,3）G1/S期轉(zhuǎn)化與G1期周期蛋白依賴性CDK,G1期，在生長因子的刺激下，cyclin D表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb蛋白（成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白）磷酸化而失活，釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。 在G1-S期，c

9、yclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)由G1期向S期轉(zhuǎn)化，并直接參與中心體復(fù)制與調(diào)控。TGF抑制cyclinE-CDK2的活性使細(xì)胞抑制在G1期。CyclinE的抗體能使細(xì)胞停滯于G1期。CDK2催化p107磷酸化，釋放E2F。 在S期，cyclinA與CDK2結(jié)合為S期的主要激酶，參與DNA復(fù)制，使復(fù)制因子RF-A磷酸化而活性增強(qiáng),G1期周期蛋白降解通過SCF（Skp-cullin-F-box protein）泛素化途徑實(shí)現(xiàn)。 G1期周期蛋白不含破壞框序列，而含PEST序列，對G1期周期蛋白降解起促進(jìn)作用。 參與復(fù)制的調(diào)控因子，如p21, p27和p57等通過泛素化途徑降解。 SCF具有E3

10、泛素連接酶的功能，由Skp1, Cul1和Rbx1三種亞基構(gòu)成。 SCF的底物特異性由F-box蛋白決定,DNA復(fù)制活動調(diào)控 復(fù)制起始點(diǎn)識別復(fù)合物：6個亞基，ORC1-6 cdc6 和cdc45也是復(fù)制所必需的 “DNA復(fù)制執(zhí)照因子學(xué)說”：存在于細(xì)胞質(zhì)中，隨細(xì)胞分裂進(jìn)行，“執(zhí)照”信號與減弱直到消失。 DNA復(fù)制執(zhí)照因子的本質(zhì)為Mcm蛋白，分為6種,4） S/G2/M期轉(zhuǎn)換與DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn),包括S期內(nèi)部檢驗(yàn)點(diǎn)和DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)。 S期內(nèi)部檢驗(yàn)點(diǎn)通過染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白SMC1磷酸化實(shí)現(xiàn)（ATM-MDC1-MRNC等中介物的系列催化過種實(shí)現(xiàn)），或通過ATM/ATR介導(dǎo)的cdc25A磷酸酶過磷酸化而

11、降解。 復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)由ATR/CHK1激活實(shí)現(xiàn)。 ATR/CHK1介導(dǎo)cdc25A降解，抑制cyclin E/A-CDK2通路,DNA damage checkpoint: Cell-cycle progression is blocked by DNA damage and p53,How DNA damage arrests the cell cycle in G1,有兩個這樣的限制點(diǎn): 1.一個在晚G1期: 阻止進(jìn)入期; 2.一個在晚G2期: 阻止進(jìn)入期; P53: 基因調(diào)控蛋白.DNA破壞通過間接機(jī)制激活p53。 Mdm2 作為ubiquitin ligase起作用，導(dǎo)致p53用于蛋白酶

12、體（proteasomes）引發(fā)的降解. P53磷酸化降低了對Mdm2的連接. P21(CKI protein) 結(jié)合到 G1/S-Cdk和S-Cdk，抑制其活性，因而 阻斷了期進(jìn)入期,Current model for regulation of the eukaryotic cell cycle,第二節(jié) 癌細(xì)胞,癌癥是一種嚴(yán)重威脅人類生命安全的疾病。動物體內(nèi)細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)失控而無限增殖的細(xì)胞稱為腫瘤細(xì)胞(tumor cell)。 良性腫瘤：生長緩慢，與周圍組織邊界明顯。 惡性腫瘤：癌癥(cancer)，生長快、具有遷移性。 單一細(xì)胞癌變就會形成癌癥,一癌細(xì)胞的基本特征,癌細(xì)胞有三個顯著的基本

13、特征即：不死性，遷移性和失去接觸抑制。 不死性，遷移性，失去接觸抑制，生長信號的自給自足，對程序性細(xì)胞死亡的逃逸，增長血管的能力。最新研究表明，腫瘤還具備第七種特征：腫瘤相關(guān)性炎癥。 如何判別？癌細(xì)胞還有許多不同于正常細(xì)胞的形態(tài)特征和生理、生化特征,1、癌細(xì)胞的形態(tài)特征,癌細(xì)胞大小形態(tài)不一，通常比它的源細(xì)胞體積要大，核質(zhì)比顯著高于正常細(xì)胞。 出現(xiàn)巨核、雙核或多核現(xiàn)象。核內(nèi)染色體呈非整倍態(tài)（aneuploidy），某些染色體缺失，而有些染色體數(shù)目增加。 線粒體表現(xiàn)為不同的多型性、腫脹、增生。 細(xì)胞骨架紊亂，某些成分減少，骨架組裝不正常。 細(xì)胞表面特征改變，產(chǎn)生腫瘤相關(guān)抗原（tumor assoc

14、iated antigen,染色體非整倍性,2、癌細(xì)胞的生理、生化特征,1）細(xì)胞周期失控，生長和分裂失控； 具有無限增殖能力，成為“永生”細(xì)胞。 2）具有擴(kuò)散性（遷移性）； 癌細(xì)胞的細(xì)胞間粘著性下降，具有侵潤性和擴(kuò)散性，這是癌細(xì)胞區(qū)別于良性腫瘤細(xì)胞的主要特征。 在分化程度上癌細(xì)胞低于良性腫瘤細(xì)胞(一定程度的去分化)，且失去了許多原組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,擴(kuò)散性,癌細(xì)胞的遷移,體外培養(yǎng)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞,3）細(xì)胞間相互作用改變； 識別改變；表達(dá)水解酶類；產(chǎn)生新的表面抗原。 4）表達(dá)譜改變或蛋白活性改變； 往往有胚胎細(xì)胞蛋白表達(dá)，胎兒甲種球蛋白（甲胎蛋白）是胎兒所特有的。但在肝癌細(xì)胞中表達(dá)，因此可做肝癌

15、早期檢定的標(biāo)志特征。 端粒酶活性升高； 纖連蛋白減少； 蛋白質(zhì)合成及分解代謝都增強(qiáng)， 5）體外培養(yǎng)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞特征,體外培養(yǎng)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征,惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞同癌細(xì)胞一樣具有無限增殖的潛能； 在體外培養(yǎng)時貼壁性下降； 失去接觸抑制； 培養(yǎng)時對血清依賴性降低； 當(dāng)將惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞注入易感動物體內(nèi)，往往會形成腫瘤,二、癌基因與抑癌基因腫瘤形成的內(nèi)因,涉及到兩大類與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因的突變： 促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因突變：原癌基因(proto-oncogene)突變形成癌基因(oncogene) 抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因突變：腫瘤抑制基因(tumor-suppressor gene)，抑癌基因 細(xì)胞癌變是基

16、因突變累積和自然選擇的結(jié)果，所以患者多為年長者。 原癌基因與腫瘤抑制基因產(chǎn)物協(xié)調(diào)作用，避免細(xì)胞癌變,1、癌基因( oncogenes,癌基因 oncogenes, onc ：可引起細(xì)胞癌變的基因，是調(diào)控細(xì)胞增殖、分裂和生長的正常基因（原癌基因）的突變形式。 原癌基因proto-oncogenes：細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞增殖、分裂和生長的一類正?；颍ù龠M(jìn)因子），當(dāng)其突變會促進(jìn)癌癥的發(fā)生（即變成癌基因）。 癌基因按其來源可分為兩類： 細(xì)胞癌基因(原癌基因突變而來): c-onc ; 病毒癌基因(致腫瘤病毒中攜帶): v-onc,研究歷史 早在1911年Rous發(fā)現(xiàn)雞肉瘤無細(xì)胞濾液能引起雞產(chǎn)生新的肉瘤，幾

17、十年后，他證實(shí)了病原體為勞氏肉瘤病毒（Rouss sarcoma virus, RSV），為此獲得1966年的諾貝爾獎（是年Rous已87歲）。 1970年Temin 和Batimore證實(shí)RSV是反轉(zhuǎn)錄病毒，獲1975年諾貝爾獎。 1970s H. Varmus和J. M. Bishop發(fā)現(xiàn)RSV中的致瘤基因是src，編碼一種胞質(zhì)酪氨酸激酶，參與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 用src的cDNA（complementary DNA）和其他基因組DNA雜交，發(fā)現(xiàn)src的同源物普遍存在于動物細(xì)胞（如雞、鴨、果蠅）。原來src編碼一種胞質(zhì)酪氨酸激酶，參與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是細(xì)胞的正常組分,原癌基因

18、的產(chǎn)物主要包括： 生長因子，如sis； 生長因子受體，如fms（受體酪氨酸激酶，CSF-1 受體）、erbB（受體酪氨酸激酶，EGF 受體）； 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分，如src、ras、raf； 細(xì)胞周期蛋白，如cyclin D； 細(xì)胞凋亡調(diào)控因子，如bcl-2； 轉(zhuǎn)錄因子，如myc、fos、jun,原癌基因編碼蛋白,原癌基因激活往往是顯性突變兩個等位基因中的一個激活即會致腫瘤,Ras oncogene: Retain bind GTP,Bcl-2 oncogene: Prevent apoptosis,2、抑癌基因(Tumor-suppressor genes,抑癌基因是正常細(xì)胞增殖過程中的負(fù)調(diào)控因子

19、，其產(chǎn)物抑制細(xì)胞增殖；促進(jìn)細(xì)胞分化；和抑制細(xì)胞遷移。 通常發(fā)生于功能喪失性突變(隱性突變,抑癌基因失活往往是隱性突變兩個等位基因都失活時才會致腫瘤,抑癌基因的種類,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（控制細(xì)胞周期或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡）：如Rb、p53。Rb基因突變導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤形成；P53基因突變將導(dǎo)致細(xì)胞癌變或凋亡。 負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子：如WT； 周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDKI），如p21； rasGTP酶活化蛋白(GAP)：如NF-1； DNA修復(fù)因子：如BRCA1、BRCA2； 磷酸脂酶： 如PTEN； 細(xì)胞粘附分子： 如DCC,Rb基因突變導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤形成,Rb作用機(jī)理： 其產(chǎn)物成視網(wǎng)膜瘤蛋白（pRb

20、）是轉(zhuǎn)錄因子E2F的抑制因子； G1期CDK激活后將pRb磷酸化，從而解除它對E2F的抑制； 相關(guān)基因表達(dá)，細(xì)胞周期由G1向S期運(yùn)轉(zhuǎn),Rb基因最早發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,P53基因突變將導(dǎo)致細(xì)胞癌變或凋亡,p53作用機(jī)理： p53基因產(chǎn)物（p53蛋白）在G1期檢查DNA損傷； 如有損傷，就暫停周期運(yùn)轉(zhuǎn)，待損傷DNA修復(fù)后繼續(xù)； 如修復(fù)失敗， P53蛋白引發(fā)細(xì)胞凋亡,三、致癌因素腫瘤形成的外因,1、生物性因素 2、物理因素 3、化學(xué)致癌物,1、生物性因素,腫瘤病毒：逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒（HBV）、人乳頭瘤狀病毒（HPV）等 霉菌：目前已知有數(shù)十種霉菌毒素對動物有致癌性。 如黃曲霉毒素（aflatoxin）, 是一類雜環(huán)化合物，其中黃曲霉毒素B1是已知最強(qiáng)的化學(xué)致癌物之一，可引起肝癌,2、物理因素,電離輻射； 紫外線，可引起細(xì)胞DNA斷裂、交聯(lián)和染色體畸變，抑制皮膚的免疫功能，誘發(fā)皮膚癌、基底細(xì)胞癌和黑色素瘤,3、化學(xué)致癌物,亞硝胺類，能引起消化系統(tǒng)腫瘤； 多環(huán)芳香烴類，如苯并芘。 芳香胺類，如乙萘胺、誘發(fā)泌尿