醫(yī)學(xué)精品課件：藥分第六章

1、第六章 常用分子生物學(xué)技術(shù),第一節(jié) 分子雜交技術(shù),具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下 按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列稱探針,在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程,二、DNA變性是雙鏈解為單鏈的過程,雙鏈間氫鍵的斷裂,2、DNA變性的本質(zhì),1、DNA變性的概念,DNA變性曲線 AT區(qū)先解鏈 GC區(qū)后解鏈 階梯式曲線,DNA變性的動態(tài)變化過程,核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或R

2、NA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex),分子雜交,核酸分子雜交,探針技術(shù),探針 (probe) 一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在,一、Southern印跡,此技術(shù)由Southern 1975年首先設(shè)計。被檢測對象為DNA,帶有DNA片段的凝膠,Southern 印跡雜交的技術(shù)流程,從凝膠上轉(zhuǎn)移DNA,二、Northern 印跡,應(yīng)用DNA探針檢測特異mRNA的一種雜交技術(shù)，主要用于分析mRNA的轉(zhuǎn)錄或mRNA分子大小。其方法類似于S

3、outhern印跡雜交,三、Western 印跡,將待檢測蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì),三種 印跡比較,三種印跡技術(shù)的比較,四、原位雜交 (in situ hybridization,1、定義： 將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織中核酸按堿基配對原則進(jìn)行特異性雜交，并應(yīng)用組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位或基因表達(dá)的檢測技術(shù)稱原位雜交（hybridization in situ)。2、操作步驟： 載片的清潔與處理；組織與細(xì)胞的固定；探針； 濕盒,原位雜交,五、生物芯片chip,生物芯

4、片（biochip）是近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術(shù)，主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速與大信息量的檢測,1、生物芯片技術(shù)的特點,2、生物芯片使用步驟,芯片制作,把探針固定于載體表面,樣品處理,目標(biāo)分子富集,分子間的雜交,結(jié)果檢測與數(shù)據(jù)分析,基因芯片掃描結(jié)果,不同的顏色代表一個探針點雜交上的帶熒光標(biāo)記的核酸分子數(shù)的差異。紅黃綠蘭紫,3、生物芯片分類,1）基因芯片 （2）蛋白質(zhì)芯片 （3）細(xì)胞芯片 （4）組織芯片,基因芯片概念：基因芯片，也叫DNA芯片，是將大量特定序列的DNA片段（

5、分子探針）有序地固定在經(jīng)過處理后的尼龍膜、玻璃片、硅片等支持物上 ，從而能快速、準(zhǔn)確地對大量DNA分子序列進(jìn)行測定和分析的一種類似電腦的芯片。 原理：利用堿基的互補配對原則（DNA分子雜交） 材料：分子探針，尼龍膜，玻璃片，硅片,可在基因組水平進(jìn)行基因表達(dá)和發(fā)現(xiàn)研究、突變、序列測定等，已方泛應(yīng)用于基因組研究和人類疾病的診斷等多領(lǐng)域,4、基因芯片應(yīng)用,5、制作基因芯片的大致步驟,表達(dá)芯片的制備檢測流程,應(yīng)用基因微矩陣芯片研究宮頸癌相關(guān)基因表達(dá),DNA微點陣已廣泛和流行的用于疾病診斷、基因組比較、以及新型癌癥的分類,第二節(jié) 目的基因制備技術(shù),Kary Mullis research scienti

6、st in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize,一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR,一）PCR技術(shù)發(fā)展簡史,PCR技術(shù)最早由美國Cetus公司人類遺傳研究室Kary Mullis及同事于1985年發(fā)現(xiàn)并研制成功的；最早的應(yīng)用報道是Saiki等1985年將PCR技術(shù)應(yīng)用于-珠蛋白基因擴增和鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷。隨后使用了1976年Chien等分離的熱穩(wěn)定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大為簡化，并使PCR自動化成為可能；1987年Kary Mulli

7、s等完成了自動化操作裝置，使PCR進(jìn)行實用階段,1、PCR的基本原理,DNA半保留復(fù)制機理,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction,二）PCR技術(shù)的基本原理和操作,模板DNA 特異性引物 耐熱DNA聚合酶 dNTPs Mg2,2、PCR的基本成份,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,3、PCR的基本操作,PCR產(chǎn)物以指數(shù)形式增加，即Y = 2n (n 為循環(huán)次數(shù),是不是循環(huán)次數(shù)越多越好,PCR擴增的平臺效應(yīng),4、PCR的反應(yīng)步驟,5、引物設(shè)計,1) 序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴增區(qū)無同源序列。 （2）引物長度以15-40 b

8、p為宜。 （3）堿基盡可能隨機分布。 （4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。 （5）兩引物間避免有互補序列。 （6）引物3端為關(guān)鍵堿基；5端無嚴(yán)格限制,6、PCR技術(shù)的優(yōu)點,特異性強 靈敏度高 操作簡單、省時 對待檢原始材料質(zhì)量要求低 高效率的基因擴增技術(shù),PCR技術(shù)的特點：擴增特異的DNA片段,1、目的基因的克隆 2、基因的體外突變 3、DNA和RNA的微量分析 4、DNA序列測定 5、基因突變分析,三）PCR的主要應(yīng)用,實時PCR技術(shù)原理,目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵是限制性引物的絕對

9、量。 用途：制備核酸序列測定的模板；制備雜交探針； 基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究,不對稱PCR,高濃度引物,低濃度引物,反向PCR (reverse PCR,用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段，對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴增,未知序列,未知序列,已知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,連接酶,多重PCR,在同一PCR體系中加入若干對PCR引物，如果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應(yīng)體系可同時擴增多個DNA片段。 當(dāng)基因的外顯子發(fā)生缺失時，根據(jù)條帶缺失的數(shù)目和引物相應(yīng)的位置，可判斷基因中哪一個或哪幾個擴增部位發(fā)生缺失,電泳,引物,1,2

10、,3,4,1,2,3,4,DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因,A：無外顯子8,12,17,19對應(yīng)條帶,說明病人外顯子819缺失,B：病人A中未擴增外顯子帶的強度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者,C：正常人DMD基因外顯子的一般擴增形式,多重PCR檢測DMD基因缺失,DMD基因外顯子缺失的檢測,在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴增一份DNA樣本中多個不同序列的靶片段,LP-PCR（Labelled primers,利用同位素、熒光素等對引物進(jìn)行標(biāo)記, 用以直觀地檢測目的基因。 特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷 可同時檢測多種基因成分,標(biāo)記引物,觀察,PCR產(chǎn)物,逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR,以細(xì)胞內(nèi)總R

11、NA或mRNA為材料進(jìn)行體外擴增的技術(shù)。 主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探針，檢測RNA病毒、分析基因表達(dá)等,逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式： 以隨機進(jìn)行的PCR擴增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物以oligo(dT)作為引物，mRNA3末端polyA尾與之互補以人工合成的隨機序列六核苷酸混合物作為引物，進(jìn)行擴增,reverse transcription,逆轉(zhuǎn)錄酶,聚合酶,mRNA,cDNA,雜化雙鏈,PCR擴增,用目的基因上的一段DNA做成探針與文庫中的DNA作核酸雜交，從基因文庫中“釣出”有目的基因的克隆,二、cDNA文庫cDNA library,基因組DNA文庫 (genomic DN

12、A library) cDNA文庫 (cDNA library,基因文庫 (gene library,是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體,基因組DNA文庫,從cDNA文庫獲取目的基因,由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列,三、化學(xué)合成,第三節(jié) 基因敲除技術(shù),基因敲除（geneknockout）又稱基因剔除，或基因打靶（genetargeting）是指通過DNA定點同源重組，定向改變基因組中的某一特定基因，使機體特定基因失活或缺失，從而研究此基因的功能的一種分子生物學(xué)技術(shù),轉(zhuǎn)抗凝血酶素V基因、轉(zhuǎn)-干擾素基因羊,如何敲除其胰島素基因，成為糖病模型,猴的基因編碼與人類只有1%的差別，通

13、過轉(zhuǎn)基因猴，可以研究各種疾病對人的影響，并開發(fā)出相應(yīng)的治療方法。如引進(jìn)老年性癡呆病的基因，加快針對這種疾病疫苗的開發(fā)研究。還可引進(jìn)糖尿病、乳腺癌、帕金森氏癥等基因，為人類最終戰(zhàn)勝社些疾病提供幫助,由于胚胎干細(xì)胞的這種特殊性，ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于建立轉(zhuǎn)基因動物之中。從80年代到90年代初，小鼠ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)已發(fā)展到成熟階段。 1984年，Bradly等成功地用顯微注射法將ES細(xì)胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，獲得生殖系嵌合體，再適當(dāng)交配，獲得源于ES細(xì)胞系純系小鼠,基因敲除的發(fā)展歷程,此實驗首次證實體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞能在體內(nèi)分化發(fā)育成生殖系嵌合體并可獲得小鼠純合體子代。19

14、87年，人們利用ES細(xì)胞技術(shù)建立了次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hprt)基因敲除(Gene knockout)的動物模型。 此后，這項技術(shù)得到了普遍應(yīng)用和長足發(fā)展,一、基因敲除的一般原理,基因敲除是80年代后半期應(yīng)用DNA 同源重組原理發(fā)展起來的。80年代初，胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。1985年，首次證實的哺乳動物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。到1987年，Thompson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型,knock-out ：the gene of interest is disrupted,同源重組,抗性選擇,RB,DT-A,

15、DT-A,hpt,En,LB,Waxy,重組,整合,Waxy,hpt,En,Waxy,重組,intron1,表達(dá)載體,受體基因組,打靶結(jié)果,基因打靶（gene targeting,發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous recombination)，又稱基本重組（general recombination）。通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換,同源重組是最基本的DNA重組方式,Holliday模型的4個關(guān)鍵步驟,兩個同源染色體DNA排列整齊,一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體,通過分支移動產(chǎn)生

16、異源雙鏈DNA,Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為,Holiday中間體,5,片段重組體,拼接重組體,二、基因敲除載體構(gòu)建,1、獲得目的基因的同源片段。 2、從重組質(zhì)粒中切除目的基因同源片段的大部分同源DNA序列，只留部分序列在線性質(zhì)粒載體的兩端。 3、將新霉素抗性基因（neo）克隆到帶有同源序列的線性質(zhì)粒中。 4、在目的基因同源序列的外側(cè)線性化重組質(zhì)粒載體，引入皰疹病毒胸苷激酶（HSV-tk,1、插入性載體(gene-insertionvector)： 斷裂位點位于同源序列區(qū)域內(nèi)，選擇基因緊鄰?fù)茨康男蛄??；蛑亟M時整個載體整合到染色體靶位點上，載體DNA同源

17、序列與染色體靶位點進(jìn)行一次同源重組,2、置換型載體(gene-replacementvector)： 斷裂位點位于同源序列區(qū)域的外側(cè)或兩側(cè)，選擇基因位于同源目的序列內(nèi)部或外側(cè)?；蛑亟M時以載體的同源序列取代染色體靶位序列，載體DNA同源目的序列與染色體靶位點進(jìn)行兩次同源重組。目前，大多數(shù)基因敲除都采用置換型載體,取代型（a）或插入型（b）載體,三、基因敲除載體導(dǎo)入ES細(xì)胞,1、ES 細(xì)胞的獲得 現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細(xì)胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細(xì)胞也有使用。常用的鼠的種系是129及其雜合體，因為這類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。而其他

18、遺傳背景的胚胎干細(xì)胞系也逐漸被發(fā)展應(yīng)用,ES能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性,2、基因載體的構(gòu)建 把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA 分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組載體。基因敲除是為了使某一基因失去其生理功能，所以一般設(shè)計為替換型載體,Neo（新霉素）陽性篩選標(biāo)志 HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：單純皰疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,常用于基因敲除的靶細(xì)胞是小鼠ES細(xì)胞。導(dǎo)入方式有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法等，目前應(yīng)用較多的是顯微注射法,3、重組DNA導(dǎo)入ES

19、,1）顯微注射法 (Microinjection technique,顯微鏡下，用一根極細(xì)的玻璃針（直徑1-2微米）直接將DNA注射到胚胎的細(xì)胞核內(nèi)，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔。用這種方法生產(chǎn)的動物約有10%是整合外源基因的轉(zhuǎn)基因動物,2）電穿孔法 在高壓電場的短暫作用下，細(xì)胞膜上可出現(xiàn)可逆的孔洞，外源DNA可通過此孔洞進(jìn)入胞內(nèi),3）DNA-磷酸鈣共沉淀法 將DNA與CaCl溶液混合，再緩慢滴加入含有磷酸的HEPES溶液中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀顆粒。 小心地將顆粒加入到培養(yǎng)的靶細(xì)胞表面，保溫數(shù)小時后，使DNA被靶細(xì)胞攝取,4）DEAE-右旋糖苷法 該法先用來

20、促進(jìn)病毒DNA導(dǎo)入，后來發(fā)展為一種哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移方法。 方法：用外源DNA和DEAE-右旋糖酶的混合物處理細(xì)胞。 常用于克隆化基因的瞬間表達(dá)，不用于細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化,5）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種RNA病毒，基因大小為3-10kb。不同于其它病毒，它具有二倍體基因，即含有兩個相同的RNA分子，有典型的真核mRNA結(jié)構(gòu)（包括帽子和尾巴,四、篩選與鑒定,由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動物的重組概率為10-210-5。因此如何從眾多細(xì)胞中篩出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細(xì)胞非常重要。目前常用的方法是正負(fù)篩選法（PNS法，Positive-Negative Screening），標(biāo)記

21、基因的特異位點表達(dá)法以及PCR法。 應(yīng)用最多的是PNS法,正負(fù)雙向篩選系統(tǒng)：（positiveandnegativeselection，PNS），PNS采用置換型載體，該載體含有正負(fù)選擇基因各一個，正向選擇基因多為neo基因，插入載體的同源序列中；負(fù)向選擇基因常用HSV-tk基因，置于同源序列的外側(cè)。同源重組時，載體的同源區(qū)發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除，所以在同源重組時，tk基因?qū)⒈磺谐鴣G失。而在隨機整合時，所有序列均保留,1、正負(fù)篩選法（PNS,胸苷激酶蛋白（TK）可使無毒性的丙氧鳥苷（GANC）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘院塑账岫鴼⑺兰?xì)胞，因而可用丙氧鳥苷篩選排除隨機整合的細(xì)胞株。在同源重組時，細(xì)胞對

22、G418和GANC都有抗性，隨機整合時只對G418有抗性，而對GANC敏感，細(xì)胞將被殺死。未進(jìn)行任何方式整合的細(xì)胞則被G418殺死,用G418作正篩選，可得到含有neo基因的細(xì)胞株，然后再用丙氧鳥苷做負(fù)篩選，淘汰含有tk基因的細(xì)胞株，就可以得到不含tk基因的同源重組細(xì)胞株,正負(fù)篩選法（PNS法）篩選已發(fā)生同源重組的細(xì)胞,2、正向篩選法,正向篩選標(biāo)記基因Neo具有雙重作用，一方面導(dǎo)致了靶基因的插入突變；同時作為重組細(xì)胞的正向篩選標(biāo)志，該基因產(chǎn)物可使細(xì)胞在含有新霉素的培養(yǎng)基中生長。類似的正負(fù)基因還有一些，例如gpt(對6-巰基尿嘧啶敏感)和dta(diptheria毒素,直接毒性作用)。 正向篩選

23、法可分為無啟動子篩選法、無增強子篩選法和無polyA篩選法,1）啟動子缺失篩選法 原理是在重組基因載體的目的片段中插入一個啟動子缺失的正向選擇基因neoneomycin，同時，目的基因片段也不包含該基因的啟動序列。如果基因載體和細(xì)胞基因組發(fā)生同源重組，則正向選擇基因可以在靶位點基因啟動子的作用下得以表達(dá)，使陽性細(xì)胞具有G418抗性，從而在選擇培養(yǎng)基中得到同源重組陽性克隆,2）Poly-A缺失篩選法 Poly-A缺失篩選的載體設(shè)計與啟動子缺失的設(shè)計基本相同，當(dāng)打靶基因不能被誘導(dǎo)表達(dá)時，則考慮選用poly-A缺失敲除策略。Poly-A缺失的正向選擇基因neo位于載體目的片段中,由于neo基因轉(zhuǎn)錄終

24、止信號的缺失,其表達(dá)受到抑制。在重組陽性細(xì)胞中，neo基因通過利用基因組靶位基因的轉(zhuǎn)錄終止信號得以表達(dá)，使陽性細(xì)胞獲得G418抗性，并得以篩選出來,3、PCR篩選法,其原理是通過在目的突變基因序列中引入特定的PCR引物序列，利用PCR方法直接檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，然后根據(jù)特定擴增DNA片段的有無,來鑒別中靶陽性細(xì)胞克隆,PCR法鑒定ES細(xì)胞的引物設(shè)計,獲得基因敲除純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中，所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進(jìn)行至少兩代遺傳,五、基因敲除動物的產(chǎn)生,由嵌合體得到基因敲除的純合體小鼠,運用基因同源重組進(jìn)行基因敲除依然是構(gòu)建基因敲除動

25、物模型中最普遍的使用方法,六、基因敲除進(jìn)展與應(yīng)用,常規(guī)基因敲除的基礎(chǔ)上又發(fā)展了： 1、條件性基因敲除、 2、體細(xì)胞基因敲除、 3、基因誘捕等新技術(shù),基因誘捕（gene trapping,基因誘捕又稱隨機基因敲除，它不是利用外源基因與基因組同源序列進(jìn)進(jìn)行同源重組，而是利用隨機插入突變進(jìn)行基因敲除的新型方法。通?；虿东@載體還包括一個無啟動子的報道基因，通常是neo 基因，neo 基因插入到ES 細(xì)胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實現(xiàn)表達(dá)的ES 克隆可以很容易地在含G418 的選擇培養(yǎng)基中篩選出來,基因捕獲法的基本原理圖,中靶基因的信息可以通過篩選標(biāo)記基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來

26、獲得,根據(jù)所誘捕的表達(dá)調(diào)控序列的不同，廣義基因誘捕包括了增強子誘捕、基因誘捕、啟動子誘捕、polyA誘捕等多種類型,第四節(jié) RNA干擾技術(shù),2006年10月2日，瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院宣布將2006年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予兩名美國科學(xué)家安德魯法爾和克雷格梅洛，表彰他們發(fā)現(xiàn)了“RNA（核糖核酸）干擾”機制。 法爾和梅洛獲獎是因為他們“發(fā)現(xiàn)了控制遺傳信息流動的基本機制”。RNA干擾已被廣泛用作研究基因功能的一種手段，并有望在未來幫助科學(xué)家開發(fā)出治療疾病的新療法,梅洛(Craig Mello)生于1960年，是被恐龍骨引入科學(xué)世界的。梅洛童年時經(jīng)常跟著父親在美國西部尋找化石。從那時起，他就迷上了遠(yuǎn)

27、古時代、地球歷史和人類生命的起源等問題。高中時代，梅洛的興趣逐漸轉(zhuǎn)移到了基因工程方面,法爾(Andrew Fire)1959年出生在美國加利福尼亞州，本科在加利福尼亞大學(xué)伯克利分校主修數(shù)學(xué)，僅用3年時間就拿到學(xué)位。與梅洛類似，他逐漸對涉及生命奧秘的遺傳學(xué)產(chǎn)生興趣，并將其作為自己終身的學(xué)術(shù)追求,實驗一： Napoli (1990) 將紫色色素基因引入開紫花的矮牽牛。 期望：紫色更深。 結(jié)果： 植物產(chǎn)生了白花。 解釋：紫色色素基因被抑制了，這種現(xiàn)象稱共抑制cosuppression (Jorjensom R, 1990,一、RNAi的發(fā)現(xiàn),實驗二,1995年，康乃爾大學(xué)的Guo和Kempheus在

28、試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C. elegans）中的par-1基因時，發(fā)現(xiàn)了一個意想不到的現(xiàn)象。她們本是利用反義RNA技術(shù)特異性地阻斷上述基因的表達(dá)，而同時在對照實驗中給線蟲注射正義RNA（sense RNA）以期觀察到基因表達(dá)的增強。 但結(jié)果是二者同樣地切斷了par-1基因表達(dá)途徑。該研究小組一直沒能給這個意外以合理解釋,論文： Guo S, Kemphues KJ, Par L. Cell, 1995,81:611-620,秀麗新小桿線 蟲（C. elegans,1998年2月，華盛頓卡耐基研究院Fire和馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Mello通過大量的工作，證實，Guo博士遇到的正義RNA抑制基因

29、表達(dá)，以及反義RNA技術(shù)對基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因表達(dá)。該小組將這一現(xiàn)象稱RNA干擾（RNA interference ,簡稱RNAi,Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern o

30、f endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to

31、mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.,Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos,實驗：Fire等（1998）將dsRNA注入線蟲合胞腺體。 結(jié)論： dsR

32、NA 比反義RNA更能減少 mex-3 mRNA的量， 同時抑制信號可以從細(xì)胞到細(xì)胞進(jìn)行傳遞,dsRNA的抑制效率,在1999年短短的一年間,發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于從植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物中細(xì)胞。2000年，又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在RNA干擾現(xiàn)象。 2000年提出RNAi作用機制模型,論文： Hannond SM et al. Nature, 2000, 404(6775):293-296 Zamore PD. Cell, 2000,101(1):25-33,2001年，RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞基因

33、沉默現(xiàn)象。Nature，2001，411（6836）：494498 RNAi技術(shù)被Science評為2001年度的十大科技進(jìn)展之一,二、RNAi的作用機制,引入 dsRNA Dicer酶把 dsRNA 切成siRNAs 形成RISC 靶向 mRNA 特異 mRNA 降解,dsRNA：雙鏈RNA，包含正義鏈和反義鏈 Dicer：屬于RNase 家族，是dsRNA的特異性核酸內(nèi)切酶 siRNA：small interfering RNA ，RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子，21-23個nt大小的雙鏈RNA RISC：RNA-inducing silencing complex，具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活

34、性 RdRP：RNA-dependent RNA polymerases，依賴RNA的RNA聚合酶，是RNAi的調(diào)節(jié)因子，使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞,相關(guān)的名詞,1、起始階段,dsRNA在酶的作用下變成siRNA,Tuschl（2001,processing the dsRNA into 21-23 nt fragments,siRNAs have a defined structure,19 nt duplex,2 nt 3 overhangs,Hannon G (2002). RNA interference. Nature 418: 244-251,2、效應(yīng)階段,mRNA 降解,三、R

35、NAi的放大效應(yīng)機制,siRNA不僅可引導(dǎo)RISC切割靶RNA，而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA。 新合成的長鏈dsRNA同樣可被RNase樣核酸酶切割、降解而生成大量的次級siRNA。次級siRNA又可進(jìn)入合成-切割的循環(huán)過程，進(jìn)一步放大RNAi作用。這種合成-切割的循環(huán)過程稱為隨機降解性PCR（random degradative PCR,Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002,四、RNAi的作用特點,1、高度特異性 2、具有高效性 3、受多基因控制 4、需SiRNA介導(dǎo)

36、 5、對靶基因位點的選擇性 6、放大效應(yīng),五、RNAi的生物學(xué)意義,被稱為生物體的watchdog消滅病毒，抵抗轉(zhuǎn)座,六、RNA干擾的應(yīng)用,1、基因功能研究,由于RNAi具有高度專一性和有效性，可特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變。研究表明RNAi能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達(dá)，而抑制時間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。與傳統(tǒng)的基因敲除相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，近來RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物,2、病毒性疾病的治療-艾滋病,研究人員開發(fā)出使用RNAi技術(shù)來阻止艾滋病病毒進(jìn)入人體細(xì)胞。這個研究小組設(shè)計合成的lenti病毒載體引入siRNA

37、，激發(fā)RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5進(jìn)入人體外周淋巴細(xì)胞，而不影響另一種HIV-1主要的coreceptor-CCR4，從而使以lenti病毒載體為媒介引導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，由此治療HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加,2、病毒性疾病的治療-HBV,Shlomai 和 Shaul 設(shè)計了各針對HBV基因19nt的兩種pSUPER載體：pSUPER X-siRNA和pSUPER core-siRNA。已轉(zhuǎn)染含1.3 X wt HBV基因質(zhì)粒載體的Huh7細(xì)胞再被 X-siRNA或 core-siRNA轉(zhuǎn)染后，core蛋白水平分別降低了89

38、%、63%，轉(zhuǎn)染X-siRNA的細(xì)胞中HBsAg降低60%，但轉(zhuǎn)染core-siRNA對HBsAg表達(dá)無明顯影響（X-siRNA干擾沉默了所有的病毒轉(zhuǎn)錄物，而core-siRNA僅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA,2、病毒性疾病的治療 -HVC,Randall等證明了針對HCV RNA的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞4天后可使細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的HCV RNA降低80倍；將siRNA 轉(zhuǎn)染至已有HCV感染、復(fù)制的細(xì)胞，siRNA對98%以上可檢測到HCV抗原、HCV復(fù)制活躍的細(xì)胞有抑制作用；siRNA干擾沉默HCV RNA具有劑量依賴性和序列特異性。Kapadia等 也證明了siRNA特異抑制HCV RNA

39、復(fù)制、阻止相關(guān)蛋白表達(dá)的作用,2、病毒性疾病的治療 其它病素,RNAi還可應(yīng)用于其它病毒感染如脊髓灰質(zhì)炎病毒等，siRNA已證實介導(dǎo)人類細(xì)胞的細(xì)胞間抗病毒免疫，用siRNA對Magi細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可使其對病毒的抵抗能力增強。siRNA在感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制，病毒感染能被針對病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷，這些結(jié)果提示RNAi能勝任許多病毒的治療,3、腫瘤治療,用RNAi特異性地抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因的過度表達(dá)，使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，從而有望用這種新的手段治療各種惡性腫瘤,1)RNAi可應(yīng)用于敲除點突變激活的癌基因， (2)RNAi應(yīng)用于抑制插入基因

40、及融合基因表達(dá)， (3)RNAi可應(yīng)用于抑制基因擴增,3、腫瘤治療,Survivin基因是迄今為止克隆出的最小凋亡抑制蛋白家族成員，可通過抑制caspase級鏈反應(yīng)下游的caspase3，caspase7發(fā)揮其抗凋亡作用 ?，F(xiàn)在研究已證實survivin基因參與了肝癌的發(fā)生與發(fā)展，并且還與化療的耐藥性相關(guān)。降低survivin基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)不僅可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡、抑制肝癌細(xì)胞的生長，還可增強其對化療的敏感性，從而提高肝癌治療的整體療效,3、腫瘤治療,MDR (Muhidrug resistance)是腫瘤化療失敗的主要原因，形成MDR的最常見的因素是腫瘤細(xì)胞MDR基因編碼的糖蛋白過度

41、表達(dá)，其中，MDR1對于細(xì)胞的多重耐藥性起著重要的作用。Nieth等表明，特異siRNA可以抑制MDR1基因的表達(dá)，從而顯著降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性,4、藥物開發(fā),利用RNAi技術(shù)來研究藥物作用的特異性和機制對于加快藥物開發(fā)的研制速度大有益處，因為基因組研究成果和高通量的篩選技術(shù)，為更好更快發(fā)現(xiàn)藥靶和候選藥物提供了重要基礎(chǔ)。在藥物開發(fā)過程中，用RNAi技術(shù)可以對靶基因的功能進(jìn)行分析，有助于搞清藥物的作用機制以及與基因編碼產(chǎn)物，及與相應(yīng)化合物的相互作用，從而更正確地發(fā)現(xiàn)藥靶，開發(fā)更有效的候選藥物,21-23nt. 2-nt 3 overhangs ( UU overhangs ). G/C 含量: 30-50%. 無不配對堿基. BLAST : eliminate any target sequences with significant homology to other coding sequences. design and test 34 siRNA sequences,七、SiRNA的設(shè)計與制備,發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA中環(huán)的長度和序列,hpRNA :55% ihpRNA: 90% ihpRNA overhang :80% 、ihpRNA spac