紫外可見分光光度計[精品]

1、 紫外紫外可見分光光度計可見分光光度計 第一部分第一部分 紫外紫外- -可見吸收光譜法的原理可見吸收光譜法的原理 第二部分第二部分 紫外紫外- -可見分光光度計構(gòu)造與類型可見分光光度計構(gòu)造與類型 第三部分三部分 紫外紫外- -可見分光光度計的應用可見分光光度計的應用 第四部分第四部分 紫外紫外- -可見吸收光譜分析的條件和影響因素可見吸收光譜分析的條件和影響因素 第五部分第五部分 儀器的使用操作、維護儀器的使用操作、維護 第一部分第一部分 紫外紫外- -可見吸收光譜法的原理可見吸收光譜法的原理 一、基本原理一、基本原理:光的選擇性吸收光的選擇性吸收 分子中的某些基團吸收了紫外可見輻射光后， 發(fā)

2、生了電子能級躍遷，而產(chǎn)生了相應的吸收光譜。 屬分子吸收光譜。 紫外-可見吸收光譜分析是研究物質(zhì)在紫外-可 見光波下的分子吸收光譜的分析方法。 紫外-可見區(qū)可細分為： （1）10-200nm；遠紫外光區(qū) （2）200-400nm；近紫外光區(qū) （3）400-800nm；可見光區(qū) 1.朗伯比爾定律：a ak kbcbc。 表明：一定溫度下，一定波長的單色光通過均勻的、非散射的溶液 時，溶液的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。 akbc 式中: a：吸光度；描述溶液對光的吸收程度； k：摩爾吸光系數(shù)，單位 lmolcm； b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位； c：溶液的摩爾濃度，單位

3、moll； 入射光入射光 i0透射光透射光 it 二、光的吸收定律： 2.摩爾吸光系數(shù):(akbc) (1) k與入射波長、溶液的性質(zhì)以及溫度有關。 （2）吸收物質(zhì)在特定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)； （3）不隨濃度c 和光程長度b的改變而改變。在溫度和 波長等條件一定時，k僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關； （4）是物質(zhì)吸光能力的量度，可作為定性鑒定的參數(shù)； （5）同一物質(zhì)在不同波長下的 k 值是不同的。在 最大吸收波長max處的摩爾吸光系數(shù)，常以 kmax 表示。k max表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能 力，也反映了光度法測定該物質(zhì)可能達到的最大靈 敏度。 （6）kmax越大表明該物質(zhì)的吸光能力

4、越強，用光度 法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。 （7）k在數(shù)值上等于濃度為1mol/l、液層厚度為1cm 時該溶液在某一波長下的吸光度。 不飽和脂肪族有 機化合物 不飽和烴及共軛 烯烴、 羥基化合物 芳香化合物苯及其衍生物 不飽和雜環(huán)化 合物 飽和有機化合物飽和烴及其取代衍生物 三、紫外吸收光譜與分子結(jié)構(gòu)的關系三、紫外吸收光譜與分子結(jié)構(gòu)的關系 有機化合物的紫外吸收光譜常被用作結(jié)構(gòu)分析的依據(jù)： 第二部分第二部分 紫外紫外可見分光光度計可見分光光度計 基本構(gòu)造主要由光源、單色器、吸收池、檢測器和顯 示器五大部分組成。 一、紫外一、紫外-可見分光光度計的基本構(gòu)造可見分光光度計的基本構(gòu)造 光源光源 單色器單

5、色器 樣品池樣品池 檢測器檢測器 顯示器顯示器 1.1.光源光源 在整個紫外光區(qū)或可見光區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜， 具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用 壽命。 可見光區(qū)常用的光源是鎢燈或碘鎢燈，波長范 圍是350-1000 nm。 在紫外區(qū)常為氫燈或氘燈，發(fā)射的連續(xù)波長范 圍是180-360 nm。 2.單色器 單色器是將光源輻射的復合光分成單色光 的光學裝置。它是分光光度計的心臟部分。 單色器一般由狹縫、色散元件及透鏡系統(tǒng)組 成。關鍵是色散元件，最常見的色散元件是 棱鏡和光柵。 狹縫：將單色器的散射光切割成單色光。直 接關系到儀器的分辨 率。狹縫越小，光的 單色性越好。分為入射狹縫和出射

6、狹縫。 棱鏡:玻璃3503200 nm，石英185 4000 nm。 光柵:波長范圍寬，色散均勻，分辨性能好， 使用方便。 5 4 3 2 1 1.入射狹縫 2.準直透鏡 3.棱鏡 4.聚焦棱鏡 5.出射狹縫 3.3.吸收池吸收池 用于盛裝試液的裝置。吸收材料必須能夠透過所測光譜范 圍的光。一般可見光區(qū)使用玻璃吸收池，紫外光區(qū)使用石英 吸收池。 規(guī)格有0.5、1.0、2.0、5.0cm 等。 在高精度的分析測定中（紫外區(qū)尤其重要）吸收池要挑選 配對，因為吸收池材料的本身吸光特性以及吸收池的光程長 度的精度等對分析結(jié)果都有影響。 4. 檢測器 利用光電效應將透過吸收池的光信號變成 可測的電信號，

7、常用的有光電管、光電倍增管、 光電二極管、光電攝像管等。 要求靈敏度高、響應時間短、噪聲水平低、 穩(wěn)定性好的優(yōu)點。 5. 顯示器 將監(jiān)測器輸出的信號 放大并顯示出來的裝置。 常用的液晶數(shù)字指示 窗口和計算控制顯示。 (一)按儀器使用波長分類： 真空紫外分光光度計（0.1-200 nm）； 可見分光光度計（350-700 nm）； 紫外-可見分光光度計（190-1100 nm）； 紫外-可見-紅外分光光度計（190-2500 nm）； （二）按儀器使用的光學系統(tǒng)分類： 單光束分光光度計； 雙光束分光光度計 雙波長分光光度計 動力學分光光度計 二、紫外二、紫外-可見分光光度計的分類及特點可見分光光

8、度計的分類及特點 （）單光束分光光度計 經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶 液，以進行吸光度的測定。 簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般 不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。 樣品池樣品池 參比池參比池 （）雙光束分光光度計 經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為強度相等的兩束光，一 束通過參比池，一束通過樣品池。光度計能自動比較兩束光 的強度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成 吸光度并作為波長的函數(shù)記錄下來。 自動記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測 器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復 雜，價格較高。 m1

9、m4 參比池 樣品池 m2 m3 島津uv-2450 （）雙波長分光光度計 由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過兩個單色器，得到 兩束不同波長（1和2）的單色光；通過折波器以一定的頻率 交替通過同一樣品池，然后由檢測器交替接收信號，最后由顯示 器顯示出兩個波長處的吸光度差值a。 無需參比池。a就是扣除了背景吸收的吸光度。 對于多組分混合物、混濁試樣（如生物組織液）分析， 以及存在背景干擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波 長分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙 波長分光光度計，能獲得導數(shù)光譜。 雙波長 beckman-du_640 （）動力學分光光度計 解決在光化學反應、輻射

10、化學反應和酶催化反應中， 能量轉(zhuǎn)化、酶的降解、生物合成等的反應變化。 特點：時間辨別、快速掃描、測定生物化學瞬間 產(chǎn)物的吸收光譜和隨時間變化值。 （三）紫外（三）紫外- -可見分光光度計主要技術(shù)指標可見分光光度計主要技術(shù)指標 1.波長范圍：表示儀器能測定的波長范圍。波長范圍越 大，儀器越好，這與儀器使用的燈有關。 2.波長精度：表示儀器單色器波長誤差程度。波長誤差 越小，儀器精度越高，這與儀器使用的單色器有關。 3.雜散光：表示單色光的純度，這與制作單色器的材料 和加工工藝有關。 4.光度的測量精度：表示儀器每次測定顯示讀數(shù)的精 確度，即儀器能準確讀小數(shù)點后幾位。位數(shù)越多， 儀器精度越高，這與

11、儀器使用的檢測系統(tǒng)有關。 5.光度測量的重現(xiàn)性：每次a讀數(shù)的重現(xiàn)性，這與儀 器使用的檢測器的質(zhì)量有關。 6.分辨率：表示儀器分辨吸收光譜微細結(jié)構(gòu)的能力， 即指儀器對于緊密相鄰的峰可分辨的最小波長間距， 這是衡量儀器性能的一個綜合指標。 第三部分第三部分 紫外紫外- -可見吸收光譜法的應用可見吸收光譜法的應用 一、定性分析一、定性分析 通常根據(jù)吸收光譜的形狀、吸收峰的數(shù)目以及最大吸收 波長的位置和相應的摩爾吸收系數(shù)進行定性鑒定。 一般采用比較光譜法：即在相同的測定條件下，比較待 測物與已知標準物的吸收光譜曲線，如果它們的吸收光譜曲 線完全等同，則可認為是同一物質(zhì)。 在進行定性鑒定時，需要注意：

12、1.測試溶劑：應當對標準物和待測物有良好的溶解度，本身在測 定的波長內(nèi)無光的吸收，有良好的穩(wěn)定性。 2.測試的條件：標準物和待測物測試條件要完全相同，如溶劑、 ph、離子強度、溫度及所用儀器等。 3.更改測試條件：為了防止測試數(shù)據(jù)的假象，要對現(xiàn)有某些條件 進行適當?shù)淖儞Q，改變其中的某些測定條件，然后看標準物 和待測物的吸收光譜是否仍然完全相同。 二、結(jié)構(gòu)分析二、結(jié)構(gòu)分析 判斷所含官能團、有機化合物的同分異構(gòu)體。 （例如：某一化合物在250-300nm有強吸收帶，則表示存在苯 環(huán)的特征吸收；若在210-350nm有強吸收帶，則可能含有兩 個雙鍵的共軛單位。） 三、純度鑒定三、純度鑒定 根據(jù)在吸收

13、光譜最大吸收峰的位置和峰形狀、數(shù)量判斷該物質(zhì) 的純度。 四、定量分析四、定量分析 根據(jù)朗伯比爾定律，物質(zhì)在一定波長處的吸光度與它的濃度 呈線性關系。所以通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度， 便可求得溶液的濃度和含量。紫外可見分光光度法不僅用于測 定微量成分，而且用于常量組分和多組分混合物的測定。 定性分析與定量 分析的基礎 定性分析基礎 定量分析基礎 物質(zhì)對光的選擇吸收物質(zhì)的電 子結(jié)構(gòu)不同，所能吸收光的波 長也不同，這就構(gòu)成了物質(zhì)對 光的選擇吸收基礎。 a b a )( max a)( max b 在一定的實驗條件下，物質(zhì)對 光的吸收與物質(zhì)的濃度成正比。 a c 增增 大大 吸收曲線 同一種

14、物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大 處對應的波長稱為最大吸收波長max。 同一物質(zhì)的濃度不同時，光吸收曲線形狀相同，最大 吸收波長不變，只是相應的吸收度大小不同。 物質(zhì)不同，其分子結(jié)構(gòu)不同，則吸收光譜曲線不同， 最大吸收波長也不同。 所以可以根據(jù)吸收光譜曲線對物質(zhì)進行定性鑒定 和定量分析。 物質(zhì)對光的吸收特征，可以用吸收曲線來描 述。以入射光的波長為橫坐標，溶液的吸光度a 為縱坐標作圖，得到的曲線即為該物質(zhì)的紫外-可 見吸收曲線或吸收光譜。 吸收曲線表明了物質(zhì)對不同波長的入射光的 吸收能力。 (一)單波長分光光度法 1.單組分物質(zhì)的定量分析 （1）比較法：在相同的條件下配制樣品溶液和標準

15、溶液（與 待測組分的濃度近似），在相同的實驗條件和最大波長處分 別測得吸光度ax和as，然后進行比較，求得樣品溶液中待測 組分的濃度，cx= cs(ax/as)。 （2）標準曲線法：首先配制一系列已知濃度的標準溶液，在 最大吸收波長處分別測得標準溶液的吸光度，然后，做a-c的 校正曲線（理想的曲線應為經(jīng)過原點的直線）。在完全相同 的條件下測出試液的吸光度，并從曲線上求得相應的試液的 濃度。 a ccx ax 標準曲線/工作曲線制作 根據(jù)光的吸收定律:吸光 度與吸光物質(zhì)的含量成正 比，這是光度法進行定量 的基礎，標準曲線就是根 據(jù)這一原理制作的。 2.多組分物質(zhì)的定量分析 根據(jù)吸光度加和性原理，

16、對于兩種或兩種以上吸光組 分的混合物的定量分析，可不需要分離而直接測得。 a x y 1 2 根據(jù)加合性原則，解聯(lián)立方程法 yx aaa 111 a x y 1 2 y y x x bckbck 11 yx aaa 222 y y x x bckbck 22 k 為物質(zhì)的特征參數(shù)，可通過配制標準溶液 測得。 解聯(lián)立方程，可求得cx , cy a cs(x) x k 1 x k 2 （二）雙波長分光光度法 不需空白溶液作參比；但需要兩個單色器獲得兩束單色光(1和2)；以 參比波長1處的吸光度a1作為參比，來消除干擾。 對于多組分混合物、渾濁試樣分析及存在背景干擾或共存組分吸收干擾 的情況，利用雙

17、波長分光光度法靈敏度、選擇性、測量精密度等方面都比 單波長法有所提高。 a 2 a 1 （k2k1 )b c 兩波長處測得的吸光度差值與待測組 分濃度成正比。k1和k2分別表示待測組分 在1和2處的摩爾吸光系數(shù)。 關鍵問題：關鍵問題： 選擇波長組合1 、2的基本要求： 選定的波長1和2處干擾組分應具有相同吸光度。 測得的吸光度差只與待測組分的濃度呈線性關 系，而與干擾組分無關。 在選定的兩個波長1和2處待測組分的吸光度應 具有足夠大的差值。 三、示差分光光度法 常規(guī)的分光光度法是采用空白溶液作參比，對于 待測組分含量較高時，相對誤差較大，這時需采 用示差分光光度法。 示差法是以濃度稍低于待測溶

18、液濃度的標準溶液 作參比，測定待測溶液的吸光度值。 設：待測溶液濃度為cx，標準溶液濃度為 cs(cs 102 mol/l 時，溶質(zhì)間 可能發(fā)生締合、解離、配位等相互作用，形成新化合 物，直接影響了對光的吸收，導致偏離朗伯比爾定 律。 朗伯-比爾定律只適合稀溶液使用。(c 10-2 mol/l)。 研究證明： 當光吸收值小于0.1和大于1.0時，測量偏差超過 10%，而當在0.1-1.0之間時，測量偏差小于10%， 測量值有效可信。 a=-lgt= 0.434時，濃度測定誤差最小。所以通常 取 a= 0.2-0.8 （t=15%-65%）為紫外-可見光度分 析的吸光度范圍或稱濃度范圍。 介質(zhì)不

19、均勻性：朗伯比爾定律是適合于均勻，非 散射的溶液。 如果被測溶液不均勻，是膠體溶液、乳濁液或 懸浮液時，入射光通過溶液后，除一部分被試液吸 收外，還有一部分因散射現(xiàn)象而損失，使透射比減 少，因而實測吸光度增加，使標準曲線偏離直線向 吸光度軸彎曲。故在光度法中應避免溶液產(chǎn)生膠體 或混濁。 （二）實驗條件的選擇（二）實驗條件的選擇 （1）溶劑選擇 溶劑應能很好地溶解被測試樣，溶劑對溶質(zhì)應該 是惰性的。即所成溶液應具有良好的化學和光化 學穩(wěn)定性。 在溶解度允許的范圍內(nèi)，盡量選擇極性較小的溶 劑。 溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)應無明顯吸收。 （2）測量波長的選擇 為了提高測定的靈敏度，入射光的波長應選擇 被

20、測物的最大吸收波長max，如果max有干擾， 可選擇另一條靈敏度稍低，但能避免干擾的譜線， 所以，適當選擇入射光的波長，還能提高測定的靈 敏度。 （3）控制適當?shù)奈舛确秶?0.2-0.8 可從兩個方面著手解決： a.控制被測物濃度 b.改變吸收池的厚度 （4）選擇適當?shù)膮⒈热芤鹤骺瞻?用參比溶液調(diào)節(jié)儀器的零點，以消除由于樣品池 及溶劑、干擾物質(zhì)對入射光的反射和吸收帶來的 誤差，所以根據(jù)不同情況選擇不同的空白。 三、顯色反應及其影響因素（三、顯色反應及其影響因素（m+r mrm+r mr） （1）顯色劑用量 在實際選用時，一般通過實驗來確定：待測組 分的濃度和其他條件不變，分別加入不同量的顯色

21、 劑，分別測定它們的吸光度，以吸光度為縱坐標， 顯色劑用量為橫坐標作圖。在對應于吸光度恒定時 對應的顯色劑濃度區(qū)間內(nèi)確定顯色劑的用量。 (2)顯色時間和反應溫度 不同的顯色反應的速度不同，而且反應溫度對 反應的速度以及反應產(chǎn)物等均有影響。因此，需 要根據(jù)反應性質(zhì)選擇合適的顯色時間和反應溫度。 (3)反應體系的酸度 酸度對吸光光度分析的影響很復雜，它可以 影響配合反應的進行程度，改變金屬離子的存在 形式和顯色劑的顏色，為了選擇合適的ph，必須 綜合考慮各方面的影響，適宜的酸度要由實驗來 確定。 (4)采用適當?shù)氖侄蜗蓴_物質(zhì)的干擾 分離物與干擾物的分離：通過前處理，使分析物 與干擾物相互分離，

22、然后進行分析，常用的分離方 法有：萃取法、離子交換法、電解法、色譜法等。 加入掩蔽劑：在被測液中加入與干擾物質(zhì)產(chǎn)生穩(wěn) 定的無色絡合物的試劑，使干擾物不與顯色劑作用。 選擇適當?shù)牟ㄩL：一般選擇max為入射光波長。 如果max處有共存組分干擾時，應考慮選擇靈敏度 稍低但能避免干擾的入射光波長。 選擇合適的參比溶液： 1.若被測液（m），顯色液（r）及其它試劑均為無色， h2o作空白。 2.若顯色劑與其它試劑均為無色，而被測液中其它離 子有色時，不加顯色劑的被測液作參比。 3.若顯色劑、其它試劑及被測液均有色，可在被測液 中加入掩蔽劑，使被測組分掩蔽起來而不與顯色劑 作用，然后加入顯色劑的溶液作參比

23、溶液，這樣可 消除一些共有離子的干擾。 第五部分第五部分 儀器的使用操作及維護儀器的使用操作及維護 一、儀器的使用操作規(guī)程 1.準備工作 1.1打開光度計主機電源（預熱20-30 min）。 1.2開啟計算機電源。 1.3 雙擊uv-probe圖標，即啟動uv-2450的控制 程序。 1.4 單擊連接鍵，進入光度計自檢，自檢過程中 切勿開啟樣品室門。自檢完畢后，單擊確定鍵 進入檢測界面。 2. 測定 2.1 2.1 光譜掃描光譜掃描 參數(shù)和顯示的設置、空白基線校正、供試品測量、 光譜測定、數(shù)據(jù)處理 。 2.2 2.2 光度測定光度測定 參數(shù)和顯示的設置、空白基線校正、標準品測量、 供試品測量。

24、 2.3 2.3 動力學測定動力學測定 參數(shù)和顯示的設置、空白基線校正、供試品測量。 3.儀器使用完畢，取出樣品室內(nèi)吸收池，退出 uv-probe軟件系統(tǒng)。 4.關閉計算機。 5.關閉光度計電源。 6.按要求做好儀器使用登記。 二、儀器的維護 1.溫度和濕度 室溫保持在1535，相對濕度宜控制在45% 80%。 防塵、防震、防電磁干擾，儀器周圍不應有強 磁場。不要暴露在陽光直射的地方，不要放在有腐 蝕性氣體或在uv波長范圍內(nèi)有吸收的有機和無機氣 體的環(huán)境內(nèi)。 2.如果開機后鎢燈和氘燈不亮，應首先檢查保險絲。 若斷了應更換新的保險絲。注意更換保險絲時，關 閉電源開關并切斷電源。 3.為了防止光電

25、管疲勞，不測定時必須將比色皿暗箱 蓋打開，使光路切斷，以延長光電管使用壽命。 4.光度計燈源壽命有限，若長時間不測量，應通過 uvprobe軟件斷開連接（點擊“disconnect”）， 然后關閉光度計電源。 5.儀器自檢和掃描的過程中，不要打開樣品室蓋。 6.軟件不會自動保存數(shù)據(jù)，所有的數(shù)據(jù)要保存都必須 點擊“save”或者“save as”進行另存。否則數(shù) 據(jù)會丟失。 7.7.樣品室的出射和入射石英窗不應有污染，不要用手 觸摸樣品室中透光窗面，若不小心接觸過，要用無 水乙醇擦拭。 8.比色皿的使用方法 拿比色皿時，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色 皿的透光面，以免沾污。 清洗比色皿時，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。如比色 皿被有機物沾污，可用鹽酸-乙醇混合洗滌液（12）浸泡片 刻，再用水沖洗。不能用堿溶液或氧化性強的洗滌液洗比色 皿，以免損壞。也不能用毛刷清洗比色皿，以免損傷它的透 光面。每次做完實驗時，應立即洗凈比色皿，用干凈綢布或 擦鏡紙擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防塵保存。 比色皿外壁的水用擦鏡紙或細軟的