第二章蛋白質化學(賞析)

1、第二章蛋白質化學(賞析) 第五節(jié)第五節(jié) 蛋白質的重要性質蛋白質的重要性質 n一、蛋白質的膠體性質一、蛋白質的膠體性質 n 真溶液的溶質分子的顆粒大小1nm； n 膠體溶液中溶質分子的顆粒大小在1-100nm； n 蛋白質分子的相對分子量在1-100萬，其顆粒 大小(2-20nm)屬于膠體粒子的范圍。 n n另外，蛋白質分子表面有許多極性基團，親 水性極強，易溶與水形成穩(wěn)定的親水膠體溶液。 第二章蛋白質化學(賞析) n1 1、穩(wěn)定蛋白質膠體溶液的兩個因素、穩(wěn)定蛋白質膠體溶液的兩個因素 (1) 表面電荷(在非等電點時)與雙電層； (2) 水化膜 蛋白質膠體溶液具有一般膠體溶液的性質蛋白質膠體溶液具

2、有一般膠體溶液的性質 丁道爾現(xiàn)象、布朗運動丁道爾現(xiàn)象、布朗運動、半透膜不透性、半透膜不透性、 吸附性、膠凝性、粘性。吸附性、膠凝性、粘性。 第二章蛋白質化學(賞析) n2 2、蛋白質的膜分離技術、蛋白質的膜分離技術（Membrane Separation Technique ） n 利用蛋白質的半透膜不透性，將蛋白質中所含的、 可以通過半透膜將低分子物質(如鹽等小分子)分離的 技術稱為膜分離技術(或膜過濾技術)。 n 膜分離技術可分為膜分離技術可分為透析（透析（dialysis ） n 超濾（超濾（ultrafiltration ） 第二章蛋白質化學(賞析) 第二章蛋白質化學(賞析) 第二章蛋

3、白質化學(賞析) 超濾膜孔徑與截留蛋白質分子量的對應關系超濾膜孔徑與截留蛋白質分子量的對應關系 膜孔平均直徑（108cm） 分子量截留值 膜孔平均直徑（108cm） 分子量截留值 10 500 22 3104 12 1000 30 5104 15 1104 55 10104 18 2104 140 30104 第二章蛋白質化學(賞析) n 二、蛋白質的兩性解離與等電點二、蛋白質的兩性解離與等電點 n蛋白質中可解離的酸性基團 nGlu的-COOH nAsp的-COOH nTyr的酚羥基 nCys的-SH n 堿性基團 nLys的-NH2 nHis的咪唑基 nArg的-胍基 第二章蛋白質化學(賞析

4、) n蛋白質分子的總解離可用下式表示蛋白質分子的總解離可用下式表示 n NH+3-P-COOH (P+) n NH+3-P-COO- (P+-) n n NH2-P-COO- (P-) n n蛋白質的等電點蛋白質的等電點蛋白質溶液在特定的蛋白質溶液在特定的pHpH下，下， 其分子所帶的正、負電荷相等，凈電荷為零，這其分子所帶的正、負電荷相等，凈電荷為零，這 一一pHpH稱為稱為 ( (用用pIpI表示表示) )。 n 第二章蛋白質化學(賞析) n蛋白質的等電點不是一個恒定值，它受溶液 的離子種類和離子強度的影響。 n蛋白質在純水中的帶電狀態(tài)不受其它離子的 干擾，完全由H+的解離和結合來決定，這

5、種條件 下的等電點稱為蛋白質的等離子點蛋白質的等離子點(isoionic point) 。 n 蛋白質的等離子點是特性常數(shù)。蛋白質的等離子點是特性常數(shù)。 第二章蛋白質化學(賞析) n 蛋白質等電點的大小與其氨基酸組成有關。蛋白質等電點的大小與其氨基酸組成有關。 n 對于變性的蛋白質，可由其酸性氨基酸與堿對于變性的蛋白質，可由其酸性氨基酸與堿 性氨基酸的比例來判斷。性氨基酸的比例來判斷。 n 對于天然蛋白質，由于其對于天然蛋白質，由于其R R基團不能完全暴基團不能完全暴 露在外，故不易判斷。露在外，故不易判斷。 第二章蛋白質化學(賞析) 幾種蛋白質的等電點 蛋白質 等電點 蛋白質 等電點 胃蛋白

6、酶 1.0 卵清蛋白 4.6 血清蛋白 4.7 -乳球蛋白 5.2 胰島素 5.3 血紅蛋白 6.7 -胰凝乳蛋白酶 8.3 核糖核酸酶 9.5 細胞色素C 10.7 溶菌酶 11.0 第二章蛋白質化學(賞析) 在等電狀態(tài)下，蛋白質分子物理性質有所改變，在等電狀態(tài)下，蛋白質分子物理性質有所改變， 最顯著的是溶解度最小。最顯著的是溶解度最小。 （a）高pH：蛋白質溶解（去質子化）；（b）等電點：蛋白質絮凝 （靜電排斥最小） 第二章蛋白質化學(賞析) （c）低pH：蛋白質溶解（質子化）；（d）-乳清蛋白的溶解度與pH的關系 第二章蛋白質化學(賞析) n 根據(jù)蛋白質兩性解離和等電點兩性解離和等電點的

7、性質發(fā)展起來 的蛋白質純化方法有 n蛋白質電泳蛋白質電泳 n離子交換法離子交換法 n等電點沉淀法等電點沉淀法 n 第二章蛋白質化學(賞析) n三、蛋白質的變性作用三、蛋白質的變性作用 n（ protein denaturation ） n1 1、概念、概念 n天然的蛋白質在受到某些物理或化學因素的作用，有 序的空間結構被破壞空間結構被破壞，致使生物活性喪失，并伴隨發(fā) 生一些理化性質的異常變化，但一級結構并未破壞，但一級結構并未破壞， 這種現(xiàn)象稱為蛋白質的變性作用。這種現(xiàn)象稱為蛋白質的變性作用。 第二章蛋白質化學(賞析) 2 2、蛋白質變性的可逆性、蛋白質變性的可逆性 可逆變性可逆變性 是指使蛋

8、白質變性的條件解除 后，能恢復其原有性質。 不可逆變性不可逆變性 是指使蛋白質變性的條件解除 后，仍不能恢復其原有性質。 第二章蛋白質化學(賞析) 蛋白質復性（蛋白質復性（renaturation） n去除變性因素后，可逆變性的蛋白恢復原來的空去除變性因素后，可逆變性的蛋白恢復原來的空 間結構，恢復生物活性的現(xiàn)象為間結構，恢復生物活性的現(xiàn)象為復性復性 第二章蛋白質化學(賞析) 3 3、蛋白質的變性因素及其作用機理、蛋白質的變性因素及其作用機理 n物理因素 n熱、UV、超聲波、X-射線、高壓、表面張力、攪拌、劇烈振 蕩、研磨。 n例如 皮膚粗糙、白內障、殺菌皮膚粗糙、白內障、殺菌 n化學因素 n

9、酸、堿、有機溶劑、重金屬鹽、脲、胍、表面活性劑、生物 堿 。 n作用機理 n重金屬重金屬與與-SH-SH生成不溶性的硫化物生成不溶性的硫化物 n濃乙醇、去污劑濃乙醇、去污劑破壞疏水作用力破壞疏水作用力 第二章蛋白質化學(賞析) 4 4、變性蛋白質的性質、變性蛋白質的性質 變性蛋白質與天然蛋白質性質的差別主要表現(xiàn)變性蛋白質與天然蛋白質性質的差別主要表現(xiàn) (1)(1)理化性質的變化理化性質的變化 如：旋光性改變、粘度增加粘度增加、光吸收性質增加光吸收性質增加、失去 結晶能力、溶解度下降溶解度下降、易發(fā)生凝聚和沉淀易發(fā)生凝聚和沉淀。 (2) (2) 生化性質的變化生化性質的變化 變性后的蛋白質易被酶

10、水解。 (3) (3) 生物活性喪失生物活性喪失 這是蛋白質變性的重要標志。 第二章蛋白質化學(賞析) n 四、蛋白質的變構作用四、蛋白質的變構作用 n （protein allosteric effect ) n對于具有四級結構、含有亞基的蛋白質來講，當對于具有四級結構、含有亞基的蛋白質來講，當 一個亞基的構象發(fā)生變化，而引起其余亞基和整一個亞基的構象發(fā)生變化，而引起其余亞基和整 個蛋白質分子構象、性質和功能發(fā)生改變的作用個蛋白質分子構象、性質和功能發(fā)生改變的作用 稱為蛋白質的變構作用稱為蛋白質的變構作用( (或稱別構作用）?；蚍Q別構作用）。 n 如如血紅蛋白的變構作用 第二章蛋白質化學(賞

11、析) n五、蛋白質的沉淀作用五、蛋白質的沉淀作用（precipitation） n1 1、概念、概念 n蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的、相對的， 若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和表面電荷，蛋 白質親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮凝沉淀的現(xiàn) 象，就稱為蛋白質的沉淀作用。就稱為蛋白質的沉淀作用。 第二章蛋白質化學(賞析) 蛋白質的沉淀可分為蛋白質的沉淀可分為 不變性沉淀不變性沉淀 用于分離活性的天然蛋白質產品。 如： 酶、抗體等。 變性沉淀變性沉淀 用于生物制品中除去蛋白質。 第二章蛋白質化學(賞析) n2 2、沉淀的方法、沉淀的方法 n(1) (1) 等電點沉淀等電點沉淀 n蛋白質分子在其等電點時，

12、容易相互吸引，聚合成沉淀蛋白質分子在其等電點時，容易相互吸引，聚合成沉淀 n(2) (2) 中性鹽沉淀中性鹽沉淀 n鹽析（鹽析（salting out) salting out) 在蛋白質溶液中加入高濃度的中性鹽在蛋白質溶液中加入高濃度的中性鹽 后，它與蛋白質膠體粒子競爭水份，使蛋白質膠體粒子表面后，它與蛋白質膠體粒子競爭水份，使蛋白質膠體粒子表面 的水化層破壞而失去穩(wěn)定性，同時降低了蛋白質與水的親和的水化層破壞而失去穩(wěn)定性，同時降低了蛋白質與水的親和 力而使蛋白質沉淀的現(xiàn)象。力而使蛋白質沉淀的現(xiàn)象。 n鹽溶（鹽溶（salting in)salting in)在鹽濃度很低時，大多數(shù)蛋白質的溶解

13、在鹽濃度很低時，大多數(shù)蛋白質的溶解 度隨著鹽濃度的增加而增加，這種現(xiàn)象稱為蛋白質的鹽溶。度隨著鹽濃度的增加而增加，這種現(xiàn)象稱為蛋白質的鹽溶。 n 第二章蛋白質化學(賞析) 低濃度的鹽可增加蛋白質表面的電荷數(shù)量低濃度的鹽可增加蛋白質表面的電荷數(shù)量 和與水分子的相互作用。和與水分子的相互作用。 第二章蛋白質化學(賞析) 鹽析 鹽濃度高時，中和了蛋白質分子表面的電荷、破壞了鹽濃度高時，中和了蛋白質分子表面的電荷、破壞了 水化層，使疏水區(qū)域暴露，疏水基團發(fā)生相互作用而水化層，使疏水區(qū)域暴露，疏水基團發(fā)生相互作用而 沉淀。沉淀。 第二章蛋白質化學(賞析) 不同的蛋白質的帶電性質、分子量不同，不同的蛋白質

14、的帶電性質、分子量不同， 水膜厚度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同。水膜厚度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同。 分級鹽析分級鹽析 一般來講，分子量越大的蛋白質分子，越容 易鹽析，所需鹽濃度也越低。因此，對于不同分 子大小的蛋白質，可采用不同的鹽濃度進分級沉 淀。 常用的鹽是常用的鹽是(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4 第二章蛋白質化學(賞析) n(3) (3) 有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀 n一些極性的有機溶劑極性的有機溶劑(如乙醇、丙酮等)能破壞蛋白質 膠粒的水化層，使疏水基團暴露使蛋白質沉淀。 n(4) (4) 重金屬鹽沉淀重金屬鹽沉淀 n蛋白質在堿性溶液中帶負電，可與重金屬離子如Zn+

15、2、 Cu+2、Hg+2、Pb+2、Fe+3等作用，產生重金屬蛋白鹽 沉淀。 n(5) (5) 熱變性沉淀熱變性沉淀 第二章蛋白質化學(賞析) n(6) (6) 生物堿試劑沉淀生物堿試劑沉淀 n生物堿試劑（如單寧酸、鉬酸、鎢酸、三氯醋酸等） 具有酸性，而蛋白質在酸性溶液中帶正電荷，故能與 帶負電的酸根相結合，成為溶解度很小的鹽類。 第二章蛋白質化學(賞析) 六、蛋白質的沉降作用（六、蛋白質的沉降作用（sedimentation) 1 1、概念、概念 蛋白質由于其比重大于水，而水中下沉，這就是蛋蛋白質由于其比重大于水，而水中下沉，這就是蛋 白質的沉降作用。白質的沉降作用。 蛋白質蛋白質膠體粒子在

16、靜止溶液中膠體粒子在靜止溶液中，因重力，因重力F=mg F=mg 很小，很小， 沉降沉降1 1cmcm需需幾年的時間。為了便于觀察和利用這一現(xiàn)象，幾年的時間。為了便于觀察和利用這一現(xiàn)象， 通常外加一定的力（如通常外加一定的力（如離心力）離心力），來加速沉降過程。，來加速沉降過程。 蛋白質的沉降速度與分子大小和密度有關。蛋白質的沉降速度與分子大小和密度有關。 蛋白質的沉降性能通常用單位離心力場中的沉降速度蛋白質的沉降性能通常用單位離心力場中的沉降速度 沉降系數(shù)來表示沉降系數(shù)來表示 （沉降系數(shù)的測定詳見后面的蛋白質分子量測定） 第二章蛋白質化學(賞析) n七、蛋白質的水解反應七、蛋白質的水解反應

17、n可分為 完全水解完全水解，產物是氨基酸。 n 不完全水解不完全水解，產物可以是胨、小肽、 n 二肽和氨基酸。 第二章蛋白質化學(賞析) n八、蛋白質的顏色反應八、蛋白質的顏色反應 n（1 1）一般顏色反應：）一般顏色反應： n氨基酸所具有的顏色反應一般情況下蛋 白質都有。 n一些氨基酸地一些氨基酸地R R基團具有特殊地顏色反應：基團具有特殊地顏色反應： n米倫反應米倫反應 紅色 酚基 n黃色反應黃色反應 黃色 苯基 n酚試劑反應酚試劑反應 藍色 酚基、吲哚基 n坂口反應坂口反應 紅色 胍基 第二章蛋白質化學(賞析) （2 2）特殊顏色反應）特殊顏色反應雙縮脲反應 兩個以上肽鍵兩個以上肽鍵（雙

18、縮脲）在堿性溶液中與硫 酸銅結合。生成紫紅色或紅色物質。 第二章蛋白質化學(賞析) 九、蛋白質的紫外吸收性質九、蛋白質的紫外吸收性質 一般蛋白質在280nm波長具有最大吸收，這 是由于蛋白質分子中的Trp、Tyr和Phe存在共軛雙 鍵的緣故。 第二章蛋白質化學(賞析) 十、蛋白質的免疫學性質 抗原Ag：刺激機體免疫系統(tǒng)產生特異免疫反應的物質 ，特點是異物性、大分子性和特異性抗體。Ab：抗原刺激 機體產生能與抗原特異結合的蛋白質，存在于電泳-區(qū) （ -、免疫球蛋白Ig）,抗體的特異性決定于抗原的表面基團， 免疫產生抗體多種，多克隆抗體 免疫反應：抗原與抗體結合引起的反應，是人類對疾病具有抵 抗力

19、的重要標志 正常免疫反應：機體保護作用；異常免疫反應：機體有害的病 理性免疫反應 半抗原：不具抗原性的小分子物質，與蛋白結合后具有抗原性 ，這里小分子為半抗原 此性質在食品加工中也具有重要應用 第二章蛋白質化學(賞析) n蛋白質的相對分子質量一般在蛋白質的相對分子質量一般在60006000至至100100萬萬 n常用的測定方法有常用的測定方法有: : n1 1、根據(jù)化學組成測定最低相對分子質量、根據(jù)化學組成測定最低相對分子質量 n2 2、滲透壓法測定相對分子質最、滲透壓法測定相對分子質最 n3 3、凝膠過濾法測定相對分子質量、凝膠過濾法測定相對分子質量 n4 4、凝膠電泳法測定相對分子質量、凝

20、膠電泳法測定相對分子質量 n5 5、沉降法測定相對分子質量、沉降法測定相對分子質量 第六節(jié)第六節(jié) 蛋白質相對分子質量的測定蛋白質相對分子質量的測定 第二章蛋白質化學(賞析) 1 1、凝膠過濾法、凝膠過濾法 原理：將具網(wǎng)狀結構的葡聚糖凝膠裝柱，原理：將具網(wǎng)狀結構的葡聚糖凝膠裝柱， 對分子量不同的蛋白質，由于進入多孔性對分子量不同的蛋白質，由于進入多孔性 凝膠顆粒的能力不同而在流動相流動過程凝膠顆粒的能力不同而在流動相流動過程 中所走路徑不同，從而有不同的洗脫體積，中所走路徑不同，從而有不同的洗脫體積， 來達到分離。來達到分離。 凝膠法只適于測定球狀蛋白分子的相對質量凝膠法只適于測定球狀蛋白分子的

21、相對質量 第二章蛋白質化學(賞析) 第二章蛋白質化學(賞析) 洗脫體積與相對分子質量的關系洗脫體積與相對分子質量的關系 相對分子質量的對數(shù) 洗脫體積（mL） 第二章蛋白質化學(賞析) 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠具網(wǎng)狀結構，作為電泳介質電泳介質 SDS十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉【CH3(CH2)11OSO3Na】 它是一種陰離子表面活性劑，也是一種有它是一種陰離子表面活性劑，也是一種有 效的蛋白變性劑效的蛋白變性劑 通常在待測分子量的蛋白質樣品中加入巰基乙醇和通常在待測分子量的蛋白質樣品中加入巰基乙醇和SDS。 巰基乙醇打開蛋白質分子二硫鍵；巰基乙醇打開蛋白質分子二硫鍵； SDS破壞蛋白質分

22、子的氫鍵和疏水鍵，并與之形成破壞蛋白質分子的氫鍵和疏水鍵，并與之形成 Pr-SDS復合物復合物 2 2、SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 第二章蛋白質化學(賞析) 十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉 原態(tài)蛋白質變性 ？ 磺酸基磺酸基 極性親水極性親水 烷基烷基 親油（蛋白質疏水區(qū)）親油（蛋白質疏水區(qū)） 第二章蛋白質化學(賞析) nSDS-Pr復合物的特點： n復合物帶大量負電，使得不同Pr電荷密度相同 n使球狀Pr變成雪茄狀，長軸MW n電泳時遷移率僅與蛋白質分子量（MW或分子的長 軸）有關，而與分子形狀和帶電狀態(tài)無關。 第二章蛋白質化學(賞析) 第二章蛋白質化學(賞析) 第二章

23、蛋白質化學(賞析) 第二章蛋白質化學(賞析) 原理：原理： 不同分子量的不同分子量的PrPr顆粒會以不同的速度沉降下顆粒會以不同的速度沉降下 來。用特殊的光學系統(tǒng)可觀察到沉降界面，從而得來。用特殊的光學系統(tǒng)可觀察到沉降界面，從而得 prpr沉降速度。沉降速度。 3、超離心沉降法超離心沉降法 第二章蛋白質化學(賞析) n蛋白質的沉降常數(shù)蛋白質的沉降常數(shù)(沉降系數(shù), Svedberg Unite) n不同的蛋白質由于其分子大小不同，在一定 的離心力場中沉降的速度也不同。 n沉降的速度是蛋白質在單位時間內下沉的距離沉降的速度是蛋白質在單位時間內下沉的距離， 即即v=dx/dtv=dx/dt。 n沉降常數(shù)沉降常數(shù)(s(s小寫小寫)單位引力場中沉降分子的下沉 速度。它表示沉降分子的大小特性。 ns=v（沉降速度）/2（角速度）x（顆粒距中心距離） n沉降常數(shù)是蛋白質的特征性常數(shù)，它反應蛋白質沉降常數(shù)是蛋白質的特征性常數(shù)，它反應蛋白質 分子的大小。分子的大小。 第二章蛋白質化學(賞析) n n由于已知的蛋白質分子的沉降常數(shù)在110-13 20010-13秒之間，把110-13s這一沉降系數(shù)值 定為一個斯維德伯(Svedberg)氏單位(s)，沉降常 數(shù)為110-13 ( (簡寫為簡寫為1S1S，大寫，大寫) )。 n n蛋白質的相對分子質