聲動力治療巨噬細胞通過促進ATP釋放趨化單核細胞科研訓練論文1

1、哈爾濱醫(yī)科大學七年制學生基礎(chǔ)階段科研訓練論文題目：聲動力治療巨噬細胞通過促進ATP釋放趨化單核細胞學科、專業(yè)病理生理學教研室哈爾濱醫(yī)科大學七年制學生基礎(chǔ)階段科研論文病理生理學教研室目錄目 錄1矚慫潤厲釤瘞睞櫪廡賴。中文摘要 錯誤！未定義書簽。 聞創(chuàng)溝燴鐺險愛氌譴凈。Abstract3殘騖樓諍錈瀨濟溆塹籟。文獻綜述 5前言 12材料與方法 13技術(shù)路線15釅錒極額閉鎮(zhèn)檜豬訣錐。纟吉 果16彈貿(mào)攝爾霽斃攬磚鹵廡。討 論19謀蕎摶篋飆鐸懟類蔣薔。結(jié)論 21致謝 21參考文獻22廈礴懇蹣駢時盡繼價騷。9中文摘要目 的：證明聲動力治療(sonodynamic therapy,SDT)巨噬細胞能夠趨化單核

2、 細胞的聚集并探討其機制。煢楨廣鰳鯡選塊網(wǎng)羈淚。方法：將實驗對象分為對照組、SDT組、ATPase組及SDT-ATPase組。其中 對照組為單純THP-1源性巨噬細胞，而SDT組是在對照組基礎(chǔ)上加入終濃度為 15卩g/ml的5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid, ALA),孵育2小時后接受 聲動力治療。ATPase組及SDT-ATPaseffl則是分別在對照組和SDT組基礎(chǔ)上加入 ATPase將實驗對象離心后取其細胞上清液并分別用transwell方法研究其對單核細胞的趨化作用；將實驗對象分為對照組、SDT組、zVAD-fmk組及SDT-zVAD組。其中對照組為單純THP

3、-1源性巨噬細胞，SDT組是在對照組基礎(chǔ)上加入 ALA, 孵育2小時后接受聲動力治療。zVAD-fmk組及SDT-zVADfi則是分別在對照組和 SDT組基礎(chǔ)上加入 N-苯甲基氧化碳酰-纈氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮 (zVAD-fmk)。將實驗對象離心后，分別用熒光素酶方法檢測細胞上清及細胞內(nèi) ATP量的變化。鵝婭盡損鶴慘歷蘢鴛賴。結(jié)果：用transwell方法研究聲動力治療后的細胞上清對單核細胞的趨化 作用時，從募集的單核細胞數(shù)量來看，聲動力治療組明顯高于對照組(pv0.05), 加入ATPase并進行聲動力治療組與聲動力治療組相比顯著降低，對照組與 ATPase組無統(tǒng)計學差異(p0.

4、05);用熒光素酶方法，檢測聲動力治療巨噬細胞 后及加入凋亡抑制劑后細胞上清及細胞內(nèi) ATP量的變化得出：聲動力治療組明顯 高于對照組，約為其3倍(p0.05 )?；[叢媽羥為贍債蟶練淨。結(jié)論：聲動力治療巨噬細胞通過促進凋亡相關(guān)的 ATP釋放趨化單核細胞關(guān)鍵詞：ATP動脈粥樣硬化聲動力療法巨噬細胞AbstractPurpose: This paper is designed to investigate the effects of monocytes recruitme nt after sonodyn amic therapy and delve into its mecha ni sm.預(yù)

5、頌圣鉉儐歲齦訝驊糴。Methods: The subjects were divided into four groups: The control group,the SDT group, the ATPase group and the SDT-ATPase group.The con trol group merely contains THP-1 derived macrophages.The SDT one,containing macrophages and sonosen sitizer ALA ,was in cubated with fresh medium for 6 h

6、before being exposed to pulse ultrasound irradiation.The ATPasegroupwas a mixture of the con trol group and ATPase. Similarly,the SDT-ATPase group , was comprised of the SDTgroup and ATPase. Cell-freesupernatantsfrom each group were assessed for their ability to attract THP-1 monocytes in a transwel

7、lmigration assay.For a further study of ATPconcentrationschanges, we use another four groups of subjects:The controlgroup(macrophages alone),theSDT group, the zVAD-fmk group(addedcaspase-i nhibitor zAVD-fmk ) and the SDT-zAVD group ( like the SDT group pretreated with zAVD-fmk) .Supernatants and cel

8、l debris after high speed centrifugation from these four groups were investigated respectively.滲釤嗆儼勻諤鱉調(diào)硯錦。Results: Cell-freesupernatants with SDTwere assessed for their abilityto attract THP-1 monocytes in a transwell migration assay. The SDTgroup in duced an approximately sixfold greater recruitme

9、nt of mono cytes tha n the control group did(p0.05). Lumino meter was used to measure the cha nge of ATPc onten t.The ATPc oncen tratio n of the SDTgroup was in creased about therefold in comparison with the control group (p0.05).鐃誅臥瀉噦圣騁貺頂廡。Con clusi ons: This study dem on strates that SDT could in

10、duce the recruitment of monocytes by promoting the release of ATP in THP-1 macrophages via caspase-depe ndent pathway . 擁締鳳襪備訊顎輪爛薔。Key words: ATP, atherosclerosis, sonodynamic therapy, macrophages贓熱俁 閫歲匱閶鄴鎵騷。文獻綜述動脈粥樣硬化(Atherosclerosis ，AS)是一種多因性疾病，近年來，盡管 AS 的診斷與治療有了長足的進步，但人們對其病因?qū)W的認識仍然不足。既往和晚近 提出的AS發(fā)

11、病學說，如血栓形成學說、脂質(zhì)浸潤學說、單克隆學說、損傷反應(yīng) 學說、剪切應(yīng)力學說、同型半胱氨酸學說、精氨酸學說、內(nèi)皮功能紊亂學說、氧 化應(yīng)激學說等都不足以完全解釋 AS的發(fā)病基礎(chǔ)。近年來的基礎(chǔ)研究與臨床研 究結(jié)果提示，AS炎癥學說應(yīng)重新受到重視。有充分的證據(jù)顯示，在 AS性疾病的 不同臨床表現(xiàn)形式中，炎癥參與其發(fā)生和發(fā)展的所有環(huán)節(jié)2。這一發(fā)現(xiàn)，為臨床治療AS提供了理論依據(jù)及研發(fā)新藥提供了新思路。壇搏鄉(xiāng)囂懺蔞鍥鈴氈淚。1.巨噬細胞凋亡與動脈粥樣硬化近年的研究表明，動脈粥樣硬化病灶內(nèi)脂質(zhì)中心的大小、炎細胞尤其是巨噬 細胞的數(shù)量、纖維帽的厚薄及新生血管的多少是決定斑塊穩(wěn)定與否的最主要的因 素，而巨噬細

12、胞則通過對斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量、炎癥反應(yīng)、纖維成分的降解及新血管形成等方面來影響動脈粥樣硬化病變的進展，從脂質(zhì)條紋的發(fā)生到最終斑塊破裂 和血栓形成，巨噬細胞在動脈粥樣硬化的所有階段都起著極其重要的作用。蠟變黲癟報倀鉉錨鈰贅。1.1巨噬細胞凋亡在動脈粥樣硬化不同病變階段的機制及作用近年來，細胞凋亡在動脈粥樣硬化的形成和進展中的作用日漸成為研究熱 點，斑塊破裂伴血栓形成是造成動脈粥樣硬化臨床急性癥狀的主要原因，而大量的細胞凋亡直接造成斑塊不穩(wěn)定，凋亡過度是不穩(wěn)定斑塊的明顯特征。據(jù)相關(guān) 報道，在斑塊的不同區(qū)域凋亡率具有一定的差別，富含巨噬細胞區(qū)細胞凋亡通常 要高于其他區(qū)域。斑塊的“肩部”最容易發(fā)生破裂，纖

13、維帽薄，含有大量激活 的巨噬細胞，并存在凋亡殘體及許多內(nèi)含凋亡細胞的巨噬細胞和淋巴細胞，凋亡細胞和凋亡殘體對巨噬細胞具有強烈的化學趨化活性，而巨噬細胞本身也遭受細 胞凋亡所釋放的細胞因子的影響而發(fā)生凋亡。巨噬細胞的吞噬作用在動脈粥樣硬 化不同的病變階段有著很大的差異，所以在病變早期和晚期其凋亡對動脈粥樣硬 化的影響是不同的。在病變早期，巨噬細胞吞噬功能很強，主要針對脂蛋白，也 可有效清除凋亡細胞，其表達的TG2不但能促進凋亡細胞的清除，而且能限制活 體內(nèi)動脈粥樣硬化病變的大小呵，因此，動脈粥樣硬化早期巨噬細胞凋亡可減少 病變成分而抑制病變進展。買鯛鴯譖曇膚遙閆擷凄。巨噬細胞能表達多種清道夫受體

14、 (scavenger receptor, SR)，包括SR-A SR-BI、CD36 CD68及SR-E(LOX-I)等，它遷入內(nèi)膜后能通過其表面的 SR攝取氧 化修飾后的脂蛋白，絕大多數(shù)脂蛋白被轉(zhuǎn)運到溶酶體中消化并降解為氨基酸和游 離膽固醇，過多的游離膽固醇以膽固醇酯的形式儲存在胞質(zhì)里，從而轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?。粥樣壞死中心的形成與泡沫細胞的聚集和凋亡密切相關(guān)。研究表明，斑 塊脂質(zhì)中心有巨噬細胞抗體 CD68的表達，說明壞死物中有巨噬細胞的殘片，這 也間接支持粥樣壞死中心是在泡沫細胞聚集凋亡的基礎(chǔ)上形成的。而且，斑塊中的脂質(zhì)越多，其纖維帽中的巨噬細胞及T淋巴細胞也越多，說明粥樣壞死可能在 單核細

15、胞向內(nèi)膜遷入過程中起一定的促進作用。在成熟病變中，吞噬細胞吞噬血小板、紅細胞、凋亡細胞及脂蛋白，其中對凋亡細胞的吞噬有利于斑塊的穩(wěn)定， 清除凋亡細胞的能力可能對急性粥樣血栓性臨床事件起決定作用。但晚期病變中，許多因素可引起吞噬細胞清除凋亡細胞的功能受損，導致斑塊內(nèi)壞死、炎癥及血栓形成。斑塊中細胞大量凋亡不僅直接造成脂質(zhì)中細胞數(shù)量的減少，而且 由于巨噬細胞源性泡沫細胞凋亡后形成的凋亡物質(zhì)難以清除，發(fā)生繼發(fā)性壞死和炎癥反應(yīng)，細胞膜完整性破壞，脂質(zhì)為主的胞漿內(nèi)容物釋放后堆積形成脂質(zhì)池， 從而促進斑塊脂質(zhì)中心的形成并逐漸增大。因此，在動脈粥樣硬化晚期，巨噬細胞的凋亡對斑塊的穩(wěn)定是不利的。加強巨噬細胞整

16、體的吞噬功能并非完全有益， 然而選擇性加強其對凋亡細胞的攝取，可能有助于動脈粥樣硬化病變的抑制。綾鏑鯛駕櫬鶘蹤韋轔糴。1.2斑塊中巨噬細胞凋亡與血管平滑肌細胞凋亡的相互關(guān)系在動脈粥樣硬化斑塊中發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細胞和巨噬細胞都經(jīng)歷著凋亡與壞 死，而凋亡占主導地位。血管平滑肌細胞分散于粥樣病灶內(nèi)皮下纖維部分及斑塊 纖維帽深部中膜的下層，而巨噬細胞成簇分布于內(nèi)皮下、富含脂質(zhì)的病灶中心和纖維帽的肩部。因此，平滑肌細胞源性泡沫細胞的凋亡主要發(fā)生在纖維區(qū)，而巨噬細胞源性泡沫細胞的凋亡主要發(fā)生在病變的脂質(zhì)核心處，后者比前者更易發(fā)生 凋亡，特別是在脂質(zhì)核內(nèi)和脂質(zhì)核周圍，在脂質(zhì)核的非細胞部分可發(fā)現(xiàn)其凋亡殘 留物。

17、驅(qū)躓髏彥浹綏譎飴憂錦。平滑肌細胞凋亡和巨噬細胞凋亡對動脈粥樣硬化病變的意義不同，在斑塊易損部位平滑肌細胞凋亡能引起纖維帽的強度減弱，平滑肌細胞凋亡只是斑塊破裂 的一個征兆，并非會直接導致斑塊破裂，平滑肌細胞凋亡不可能通過纖維帽變薄 來促進斑塊破裂9。有研究報道，巨噬細胞分泌的Fas配體可誘導血管平滑肌細 胞凋亡10，而血管平滑肌細胞凋亡也可增加巨噬細胞凋亡，由于這能減少巨噬細胞因過度表達基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP而對細胞外基質(zhì)的破壞，所以有利于斑塊的穩(wěn)定11。貓蠆驢繪燈鮒誅髏貺廡。1.3巨噬細胞與動脈粥樣硬化的治療動脈粥樣硬化是多因素作用的復雜病變

18、，在其發(fā)生發(fā)展中巨噬細胞有著重要的作用，抑制巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集、減輕炎癥反應(yīng)，以及選擇性調(diào)控其凋亡程序 將成為動脈粥樣硬化新的有效的治療手段。目前臨床上已有多種對抗動脈粥樣硬 化的治療方法，如降脂治療、他汀類藥物的應(yīng)用及血管源性細胞活素療法等，都直接或間接地影響著巨噬細胞的凋亡。 相信，隨著蛋白組學和基因芯片等技術(shù)的 逐步完善，我們將會對動脈粥樣硬化中巨噬細胞的凋亡進行更有利的調(diào)控，從而使動脈粥樣硬化有更好更廣闊的臨床治療前景。鍬籟饗逕瑣筆襖鷗婭薔。2.聲動力治療2.1 聲動力治療的概況1989 年國際超聲學會議上，日本學者 UmemuraS首次提出了 SDT這一概念。 SDT是指對腫瘤患者靜

19、脈注射聲敏劑后，應(yīng)用一定頻率和強度超聲作用于腫瘤部 位，使聚集在腫瘤部位聲敏劑產(chǎn)生抗腫瘤因子從而對腫瘤細胞進行殺傷，抑制腫瘤的進一步生長。SDTt其獨特的優(yōu)越性：無創(chuàng)性、超聲治療裝置簡單易操作、 靶向治療、特異性強、副作用小。 構(gòu)氽頑黌碩飩薺齦話騖。2.2聲動力治療的機制SDT乍用機制目前仍不清楚，主要的有超聲空化效應(yīng)、自由基理論、單線態(tài) 氧機制等。2.2.1超聲空化效應(yīng)超聲空化效應(yīng)是指液體中的微小氣泡（空穴）在聲波作用下所發(fā)生的振蕩、 擴大、收縮乃至崩潰等一系列動力學過程，從而產(chǎn)生如化學反應(yīng)、發(fā)光、次諧波 等現(xiàn)象。輒嶧陽檉籪癤網(wǎng)儂號澩。222自由基理論自由基理論認為由于超聲的空化作用激活空化

20、泡內(nèi)或臨近的光敏劑，通過直接熱分解弱鍵或與水熱分解形成的 H和0H反應(yīng)產(chǎn)生光敏劑來源的自由基， 自由基與Q反應(yīng)形成烷氧自由基和過氧基對有機溶液中的有機分子反應(yīng)活性低 更容易到達靶細胞而發(fā)揮作用網(wǎng)。堯側(cè)閏繭絳闕絢勵蜆贅。2.2.3單線態(tài)氧機制超聲過程中超聲空化導致聲致發(fā)光，光激活空化泡內(nèi)或臨近的光敏劑分子而 產(chǎn)生單線態(tài)氧。02具有細胞毒性作用，其較大的擴散半徑，能穿透線粒體膜，參 與電子傳遞和氧化作用；能穿透核膜，造成DNA的損傷；導致胞膜脂質(zhì)過氧化而殺傷細胞等。 識饒鎂錕縊灩筧嚌儼淒。2.3聲敏劑目前研究中所使用的聲敏劑主要分為三類15：卟啉類化合物、抗炎藥物、抗 癌癥藥物。理想的聲敏劑不但要

21、求化學純性、有效的聲敏化作用，還要對靶組織 有較好的選擇性，對人體毒副作用小，可以迅速的從體內(nèi)排除等，目前認為較好 的聲敏劑仍是以卟啉類為主。卟啉類化合物作為聲敏劑用于臨床診斷和治療惡性 腫瘤已有20多年，其能在腫瘤部位聚集，卟啉由通過超聲產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移給電 子而激發(fā)，產(chǎn)生具有細胞毒性的自由基。 凍鈹鋨勞臘錯癇婦脛糴。ALA屬于第二代光敏劑。與其他光敏劑相比，具有光毒性副作用小，用藥后 避光時間短，滲透性好，對組織深層病變的療效和選擇性更佳等優(yōu)點，成為目前光動力治療領(lǐng)域研究的方向和熱點。ALA是一簡單的五碳化合物，多以鹽酸鹽形 式存在。分子式為GH9N0HCI，為白色或微黃色針狀結(jié)晶或粉末，能

22、溶于水和哈爾濱醫(yī)科大學七年制學生基礎(chǔ)階段科研論文病理生理學教研室乙醇，極微溶于乙醚和乙酸乙酯。它是人體血紅素代謝的內(nèi)源性前體物質(zhì)，體內(nèi)代謝途徑見圖116。恥諤銪滅縈歡煬鞏鶩錦。ALA在各種酶的激活下生成原卟啉（PpIX）,原卟啉區(qū)是血紅素內(nèi)源性合成代 謝途徑中的一種前體，其化學結(jié)構(gòu)如圖222所示。細胞內(nèi)的PpX是一種很強的光 敏物質(zhì)，最大吸收峰值位于 630 nm,光敏毒副反應(yīng)小，是重要的光動力治療藥 物。PpX是一種非常有效的光敏劑，它在一定波長的光照射下，發(fā)生化學反應(yīng)， 產(chǎn)生單重態(tài)氧和氧化物，引起細胞膜、線粒體和核酸的損傷，使病變細胞壞死、凋亡，從而起到治療疾病的作用17。鯊腎鑰詘漣鉀溈懼

23、統(tǒng)庫。遷擇植秘騖。碩癘鄴頏謅攆檸攜驤蘞。圖1 ALA體內(nèi)代謝途徑Fig1.The metabolic pathway of ALA in vivo圖2.聲敏劑分子結(jié)構(gòu)9 A. ALA B.原卟啉IXFig. 2 Molecular structure of sonosensorA. ALA B.protoporphyrin IX哈爾濱醫(yī)科大學七年制學生基礎(chǔ)階段科研論文病理生理學教研室2.4聲動力治療與動脈粥樣硬化斑塊1989 年Umemura等通過在體和細胞的實驗研究表明，血卟啉介導的超聲治療比單純的超聲誘導腫瘤細胞壞死明顯增多，由此首次提出了聲動力治療的概念18。其機理可能是主要地與超聲的空

24、化作用激活聚集在癌組織的血卟啉產(chǎn)生單線 態(tài)氧，引起病變組織細胞的壞死和凋亡。氬嚕躑竄貿(mào)懇彈濾頷澩。2002年Arakawa K等研究了聲動力治療用于兔股動脈置入支架后再狹窄預(yù) 防作用19，而聲動力治療對動脈粥樣硬化斑塊的作用的研究目前國內(nèi)外未見報 道。釷鵒資贏車贖孫滅獅贅。3. ATP23三磷酸腺苷（Ade nosine triphosphate,ATP是一種核苷酸，作為細胞內(nèi)能量傳遞的“分子通貨”，儲存和傳遞化學能。ATP在核酸合成中也具有重要作 用。慫闡譜鯪逕導嘯畫長涼。3.1 機體內(nèi)ATP生物學作用三磷酸腺苷（Ade nos ine triphosphate, ATP是一種核苷酸，作為細

25、胞內(nèi) 能量傳遞的“分子通貨”，儲存和傳遞化學能。ATP在核酸合成中也具有重要作 用。人體中ATP的總量只有大約0.1摩爾。人體每天的能量需要水解100-150摩爾 的ATP即相當于50至75千克。這意味著人一天將要分解掉相當于他體重的ATR所以每個ATP分子每天要被重復利用1000-1500次。ATP不能被儲存，因為 ATP 的合成后必須在短時間內(nèi)被消耗。諺辭調(diào)擔鈧諂動禪瀉類。ATP還可作為能源物質(zhì)。肌肉中儲藏著多種能源物質(zhì)，主要有三磷酸腺苷（ATP、磷酸肌酸（CP、肌糖原、脂肪等。ATP亦參與能源物質(zhì)的代謝：（一） 無氧代謝：劇烈運動時，體內(nèi)處于暫時缺氧狀態(tài)，在缺氧狀態(tài)下體內(nèi)能源物質(zhì)的代謝過

26、程，稱為無氧代謝。它包括以下兩個供能系統(tǒng)。 非乳酸能（ATP-CP 系統(tǒng)一一般可維持10秒肌肉活動 無氧代謝 乳酸能系統(tǒng)一一般可維持13分的肌肉活動非乳酸能（ATP-CP系統(tǒng)和乳酸能系統(tǒng)是從事短時間、劇烈運動肌肉供能的主要方式。ATP釋放能量供肌肉收縮的時間僅為13秒,要靠CP分解 提供能量，但肌肉中CP的含量也只能夠供ATP合成后 分解的能量維持68秒肌 肉收縮的時間。因此，進行10秒以內(nèi)的快速活動主要靠 ATP- CP系統(tǒng)供給肌肉收縮時的能量。 乳酸能系統(tǒng)是持續(xù)進行劇烈運動時，肌肉內(nèi)的肌糖元在缺氧狀 態(tài)下進行酵解，經(jīng)過一系列化學反應(yīng)，最終在體內(nèi)產(chǎn)生乳酸，同時釋放能量供肌肉收縮。 這一代謝過

27、程，可供13分左右肌肉收縮的時間。（二）有氧代謝：是在氧充足的條件下，肌糖元或脂肪徹底氧化分解，最終生成二氧化碳（Co2） 和水（H2O），同時釋放大量的分解代謝，稱為有氧氧化系統(tǒng)。嘰覲詿縲鐋囁偽純鉿錈。3.2 ATP 與 “find-me ”信號人體內(nèi)每一天都會更新數(shù)以億計的細胞，而這種快速的、有效地、免疫的清除死亡細胞的方式需要通過吞噬細胞選擇性識別、吞噬凋亡細胞來實現(xiàn)。近期研 究表明一類由凋亡細胞釋放的可溶性介質(zhì)在趨化吞噬細胞中起到了重要作用，而這種介質(zhì)我們稱之為“ find-me ”信號。這些信號包括溶血磷脂酰膽堿、趨化因 子、ATR UTP S1p等等。其中ATP等確認可以在體內(nèi)環(huán)境

28、下，起到對單核細胞 的吸引作用，因此“ find-me ”信號這一概念證實了凋亡細胞確實對趨化吞噬細 胞有積極地作用12。熒紿譏鉦鏌觶鷹緇機庫。3.3 ATP 與 caspase凋亡細胞釋放核苷酸依賴于caspase途徑的調(diào)節(jié)功能。在誘導細胞凋亡之前 加入caspase抑制劑zVAD-fmk后所取上清液不能夠誘導單核細胞聚集，證明凋 亡細胞釋放的ATP依賴于caspase途徑并受其調(diào)節(jié) 冋。鶼漬螻偉閱劍鯫腎邏蘞。、八前動脈粥樣硬化是一種與多種危險因素有關(guān)的復雜疾病，炎癥是其發(fā)生發(fā)展重要的病理生理機制之一，炎癥細胞在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)大量浸潤會導致斑塊的 不穩(wěn)定，而不穩(wěn)定斑塊的破裂恰恰是許多急性

29、心血管事件的觸發(fā)點。聲動力治療是通過超聲誘導聲敏劑來殺傷細胞的新方法，但是在聲動力治療巨噬細胞后死亡 的巨噬細胞及斑塊內(nèi)堆積的脂質(zhì)需要趨化更多的單核細胞進入斑塊進行清除，才能達到改善斑塊內(nèi)的炎癥環(huán)境的目的。 本研究用transwell方法證明聲動力治療 后的巨噬細胞上清能夠趨化單核細胞，而且這種趨化能夠被ATP酶部分的抑制。用熒光素酶法，證明聲動力治療巨噬細胞后細胞內(nèi)及釋放到上清中的ATP增多，而在抑制了 caspase途徑凋亡后，這種增多的趨勢減弱。本研究驗證了聲動力治 療巨噬細胞能夠趨化單核細胞，并探討了 ATP在趨化過程中的作用，對聲動力治 療動脈粥樣硬化的機制進行了有益的探索，并為動脈

30、粥樣硬化的治療提示了一個 可能的新方向。紂憂蔣氳頑薟驅(qū)藥憫騖。材料與方法1.實驗對象THP-1,人急性單核細胞白血病細胞系，中科院上海細胞庫2試劑與儀器2.1主要試劑5-氨基酮戊酸(ALA天豐生物科技有限公司，西安牛胎血清，RMPI1640培養(yǎng)基Hyclo ne 化學公司，北京青霉素G,鏈霉素Beyotime生物技術(shù)，江辦12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽(PMADarmstad 公司，德國ATP檢測試劑盒碧云天生物技術(shù)有限公司，上海穎芻莖峽餑億頓裊賠瀧。ATP酶碧云天生物技術(shù)有限公司，上海濫驂膽閉驟羥闈詔寢賻。臺盼藍碧云天生物技術(shù)有限公司，上海銚銻縵嚌鰻鴻鋟謎諏涼。N-苯甲基氧化碳酰-纈氨酸-

31、丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮(zVAD-fmk)BioVision公司，美國2.2主要儀器Tran swellCorni ng公司，美國擠貼綬電麥結(jié)鈺贖嘵類。Lumino meterThermo公司，美國賠荊紳諮侖驟遼輩襪錈。3.5cm細胞培養(yǎng)皿Corning公司，美國IX 71型熒光顯微鏡Olympus公司，日本3. 實驗方法3.1細胞培養(yǎng)THP-1 （人急性單核白血病細胞系）作為實驗用細胞系。使用添加有10%S臺牛 血清和50卩g/ml的青霉素G-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基孵育THP-1細胞。將培 養(yǎng)基保存在37C、含5%C和95%空氣的保濕孵育器內(nèi)，當發(fā)生聚集時進行傳代 培養(yǎng)。實驗時，

32、將細胞以每孔1x105的數(shù)目植入3.5cm細胞培養(yǎng)皿，并加入添加 有濃度為10卩g/ml PMA勺培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時即成為巨噬細胞。塤礙籟饈決穩(wěn)賽釙冊庫。3.2 SDT治療向3.5cm培養(yǎng)皿內(nèi)的巨噬細胞加入終濃度為 15卩g/ml的ALA孵育2小時 后，用頻率為1MHz強度為0.8W/cm的超聲輻照5 min,之后以磷酸鹽緩沖液（PBS 沖洗兩次，加入無血清細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。裊樣祕廬廂顫諺鍘羋藺。3.3 Tran swell取SDT后 6小時細胞上清、對照組細胞上清、ATPase組及SDT-ATPase組細胞上清，分別加入transwell板下層， 并在transwell板的小室內(nèi)加入密度為

33、 106/ml的單核細胞，繼續(xù)在胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h后，對下層細胞進行臺盼藍染色， 用顯微鏡拍照后統(tǒng)計下層細胞數(shù)。倉嫗盤紲囑瓏詁鍬齊驚。3.4熒光素酶法檢測細胞上清及細胞內(nèi) ATP取SDT后 20min、對照組、zVAD-fmk組及SDT&zVAd-fmk組細胞上清及細胞 裂解液，分別加入配置好的 ATP檢測工作液當中，反應(yīng)10s后使用lumi no meter 分別檢測細胞上清液及胞內(nèi) ATP含量。綻萬璉轆娛閬蟶鬮綰瀧。4. 統(tǒng)計分析各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標準差表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，P v0.05 為差異有意義。驍顧燁鶚巰瀆蕪領(lǐng)鱺賻。技術(shù)路線瑣釙濺曖惲錕縞馭篩涼1.培養(yǎng)T

34、HP-1單核細胞并將其誘導為巨噬細胞，見圖32. Tran swell方法測定細胞上清液對單核細胞趨化作用，見圖 4細腮培養(yǎng)液/i普通細陋培養(yǎng)板細胞上清液151C圖4 A Tran swell實驗?zāi)Ｊ綀DB用光學顯微鏡觀察募集的臺盼藍染色后的單核細胞，并計數(shù) C 細胞遷移數(shù) (* : P0.05)鎦詩涇艷損樓紲鯗餳類。從募集的單核細胞數(shù)量來看，聲動力治療組明顯高于對照組，P0.05 ;加入ATPase并進行聲動力治療組與聲動力治療組相比顯著降低，對照組與ATPase組無統(tǒng)計學差異。櫛緶歐鋤棗鈕種鵑瑤錟。3 熒光素酶法測定上清及細胞內(nèi)ATP含量，見圖5標準曲線-4E-13X2 + 1E-05X -

35、 0.0195o o o o o o O210 CO 6 4 2SOOOOCii：? 100000001500000020000000熒光強度A1200TDOO-aoo-600400-B圖5 A ATP 濃度與熒光強度標準曲線B各組ATP濃度(*:P0.05)聲動力治療后的 ATP濃度明顯高于對照組，約為其 3倍；加入zVAD-fmk并進行聲動力 治療組較聲動力組顯著降低；對照組與 zVAD-fmk無統(tǒng)計學差異；SDT-zVAD組與對照組無統(tǒng) 計學差異。轡燁棟剛殮攬瑤麗鬮應(yīng)。ABCD討論動脈粥樣硬化目前已經(jīng)成為了全球范圍內(nèi)，人類健康的嚴重威脅20,21。巨噬細胞介導的炎癥反應(yīng)是導致易損斑塊破裂

36、的主要因素22，因此在動脈粥樣硬化進展中對巨噬細胞積極性干預(yù)，對于預(yù)防急性心血管事件的發(fā)生具有非常重要的臨 床意義。峴揚爛滾澗輻灄興渙藺。有研究認為，在斑塊早期，因單核吞噬系統(tǒng)對凋亡巨噬細胞清除能力正常， 不會出現(xiàn)繼發(fā)性的炎癥反應(yīng)和壞死；而隨著病變的進展，單核吞噬系統(tǒng)對凋亡壞 死物的吞噬清除功能發(fā)生障礙 曲，導致斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇，脂質(zhì)壞死核心擴大， 誘發(fā)斑塊破裂、血栓形成，引發(fā)急性心血管事件。在這個過程中，凋亡細胞釋放 的一系列信號，包括“find-me ”、“keep-out ”、“don-eat-me ”和“come-get-me” 信號等，能夠調(diào)節(jié)單核性吞噬細胞的趨化活性和吞噬功能。目

37、前有研究表明，凋亡細胞釋放的核苷酸可以作為一種“ find-me ”信號參與對單核性吞噬細胞的募 集13。詩叁撻訥燼憂毀厲鋨驁。為了驗證SDT治療巨噬細胞后對單核細胞趨化的效果以及凋亡細胞釋放的 核苷酸作為“ find-me ”信號的趨化功能，我們進行了一系列實驗。首先，我們 采用transwell趨化性實驗證明聲動力治療后的凋亡巨噬細胞能夠趨化單核性 吞噬細胞，并且初步驗證核苷酸能夠作為一種“find-me ”信號（從實驗室現(xiàn)有藥品及可行性出發(fā)，我們初步選定 ATP作為驗證對象）。取SDT后 6小時細胞上 清、對照組細胞上清、ATPase組及SDT-ATPase組，分別加入transwell

38、板下層， 并在transwell板的小室內(nèi)加入密度為106/ml的單核細胞，繼續(xù)在胞培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)1 h后，對下層細胞進行臺盼藍染色，用顯微鏡拍照后統(tǒng)計下層細胞數(shù)。SDT 組較對照組單核細胞數(shù)顯著增加。此實驗結(jié)果證實聲動力治療后的凋亡巨噬細胞 能夠趨化單核細胞的聚集。而 SDT-ATPase組較對照組顯著下降說明ATP可能作 為一種“find-me ”信號在凋亡巨噬細胞趨化單核細胞的過程中起到一定的作用。則鯤愜韋瘓賈暉園棟瀧。為進一步驗證 ATP為凋亡細胞釋放的一種“ find-me ”信號，我們使用 luminometer測定聲動力治療后 ATP濃度。取SDT后 20min、對照組、zVAD

39、-fmk 組及SDT-zVAd組細胞上清及細胞裂解液，分別加入配置好的ATP檢測工作液當 中，反應(yīng)10s后使用lumi no meter分別檢測細胞上清液及胞內(nèi) ATP含量。SDT組 明顯高于對照組，而SDT-zVAd組較SDT組顯著降低。本實驗證明聲動力治療后 的凋亡巨噬細胞促進ATP的釋放，從而趨化單核細胞的聚集；而且ATP的釋放與 caspase途徑依賴的凋亡有關(guān)。脹鏝彈奧秘孫戶孿釔賻。綜上所述，本實驗證明了聲動力治療巨噬細胞通過促進 ATP釋放趨化單對聲動核細胞，從而為聲動力療法治療動脈粥樣硬化的機制進行了有益的探索, 力治療動脈粥樣硬化的臨床應(yīng)用起到了推動作用。鰓躋峽禱紉誦幫廢掃減。

40、結(jié)論1. 聲動力治療巨噬細胞通過促進 ATP釋放趨化單核細胞聚集。2. 聲動力治療巨噬細胞后ATP釋放增加依賴于caspase途徑的凋亡致謝在七年制基礎(chǔ)科研訓練即將完成之際，首先向我們的指導教師田野教授表示 最衷心的謝意！本論文是在田老師的細心指導下完成的， 在課題設(shè)計，實驗進行 和結(jié)果分析的整個過程中處處都凝聚著老師的心血。他獨特的思維方式，嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度，執(zhí)著的事業(yè)追求和崇高的敬業(yè)精神以及對學生的嚴格要求和細心關(guān)懷 令我們受益終生，他的人格魅力也令我們難忘，所有的這些也將成為我們今后做 人做事的準則。稟虛嬪賑維嚌妝擴踴糶。特別感謝孫鑫師兄、郭淑媛師姐、陳海波師兄在課題設(shè)計和實驗過程中給予

41、的悉心指導和無私幫助，在實驗方面的大力支持，在實驗中給予的意見和建議， 使我們受到很大的啟發(fā)，為實驗的順利進行打下了良好的基礎(chǔ)。 感謝本教研室的 劉暢、旦菊花、姚劍挺、田芳等師兄師姐在實驗上對我的支持。感謝同組七年制 的鄭子玲、黃宇航、馬偉康同學，在一起為了實驗而奮斗的日子里，我們一起收 獲了成功的喜悅、拼搏的艱辛，這段難忘的時光，我們結(jié)下了深厚的友誼，這些 都是我們終生的財富。陽簍埡鮭罷規(guī)嗚舊巋錟。感謝哈爾濱醫(yī)科大學病理生理教研室為我們提供了一個良好的科研環(huán)境，這里，不僅培養(yǎng)了我們的科研能力、創(chuàng)新思維，也增強了我們的獨立性和自信心， 同時，也讓我們學到了書本上學不到的知識， 這是一筆難得的人

42、生財富，將陪伴 我們在以后的事業(yè)中，勇往直前。衷心地祝愿病理生理教研室的全體老師和同學 工作順利，身體健康！祝愿病理生理教研室永遠輝煌！溈氣嘮戇萇鑿鑿櫧諤應(yīng)。最后，感謝哈爾濱醫(yī)科大學臨床醫(yī)學七年制的所有同學在日常學習生活中對 我們的幫助和支持！參考文獻1丄I JJ，F(xiàn)ANG C H . Atheroscleritis is a more rational term for the pathological entity currently known as atherosclerosisMed Hypotheses, 2004, 63(1): 100-102.鋇 嵐縣緱虜榮產(chǎn)濤團藺。2. LI

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