食品的一般成分分析

1、5.1 水分水分 水是食品的重要組成成分，不同種類的食品，水是食品的重要組成成分，不同種類的食品， 水分含量差別大。水分含量差別大。水分是食品分析的重要項(xiàng)目水分是食品分析的重要項(xiàng)目 之一。水分測(cè)定對(duì)于計(jì)算生產(chǎn)中的物料平衡，之一。水分測(cè)定對(duì)于計(jì)算生產(chǎn)中的物料平衡， 和實(shí)行工藝監(jiān)督等方面，有很重要的意義。各和實(shí)行工藝監(jiān)督等方面，有很重要的意義。各 種食品水分的含量差別很大。例如，鮮果為種食品水分的含量差別很大。例如，鮮果為 69.7%-92.5%，鮮菜為，鮮菜為79.7%-97.1%，鮮瘦肉，鮮瘦肉 52.6-77.4%，面粉，面粉12-14%。面包水分隨品種不。面包水分隨品種不 同略有差異，一般

2、為同略有差異，一般為32-42%。 食品中水分可分為結(jié)合水和自由水兩大類。食品中水分可分為結(jié)合水和自由水兩大類。 自由水：存在于食品表面濕潤(rùn)水分、滲透水分自由水：存在于食品表面濕潤(rùn)水分、滲透水分 和毛細(xì)管水，其具有天然水的性質(zhì)。和毛細(xì)管水，其具有天然水的性質(zhì)。 結(jié)合水：與食品中的親水物質(zhì)緊密結(jié)合，一般結(jié)合水：與食品中的親水物質(zhì)緊密結(jié)合，一般 指吸附水和結(jié)晶水。指吸附水和結(jié)晶水。 從結(jié)合水到自由水是逐漸過(guò)渡的。從結(jié)合水到自由水是逐漸過(guò)渡的。 5.1.1 直接干燥法直接干燥法 采用比水的沸點(diǎn)稍高的溫度（105oC)加熱試 樣一定時(shí)間，讓水分充分蒸發(fā)，根據(jù)試樣減 輕的質(zhì)量計(jì)算水分的含量。 直接干燥法

3、適用于95105oC下，不含或含其 他揮發(fā)性物質(zhì)甚微的食品。 測(cè)定方法: (1)取干凈的鋁盒,置于95 105oC干燥烘箱內(nèi), 烘 3060 min, 取出,冷至室溫稱重, 烘前后兩次稱 重值差不超過(guò)2mg為恒重. (2)精密稱取試樣2.0010.00g于恒重鋁盒內(nèi),烘3h. 取出,冷至室溫稱重, 復(fù)烘30 min,前后兩次稱 重值差不超過(guò)2mg為恒重. 注意事項(xiàng) (1)不同地區(qū)、國(guó)家對(duì)加熱干燥法測(cè)定水分的條件 規(guī)定不盡相同。 (2)誤差來(lái)源于樣品細(xì)度、烘干時(shí)間和溫度。 (3)水分的去除通過(guò)兩個(gè)階段完成最好。兩次干燥 法。 (4)樣品的水分的揮發(fā)量與干燥的時(shí)間和溫度有關(guān)。 5.1.2 減壓干燥

4、法減壓干燥法 利用真空烘箱中的低壓,使樣品水分在100oC的溫度 下?lián)]發(fā), 根據(jù)樣品減輕的質(zhì)量計(jì)算樣品的水分. 適用于105oC左右的溫度下組分易發(fā)生變化的食品 如糖漿、果糖、麥乳精、果蔬等的水分測(cè)定。 測(cè)定方法（測(cè)定方法（GB/T 5009.3-2003) 精密稱取試樣2.0010.00g于恒重鋁盒內(nèi), 置 于真空烘箱中, 關(guān)緊箱門, 抽至工作壓力 4050 kPa, 在60oC 5oC溫度下烘4h, 緩緩 放進(jìn)干燥空氣,打開箱門,冷至室溫稱重,兩次 稱重值差不超過(guò)2mg為恒重. 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 樣品要放置在溫度計(jì)附近. 放進(jìn)空氣時(shí)要緩慢 5.1.3 共沸蒸餾法共沸蒸餾法 蒸餾法采用了

5、一種有效 的熱交換方式，水分可被 迅速移去，食品組分所發(fā) 生的化學(xué)變化，諸如氧化， 分解等作用，都較常壓烘 箱法為小。 蒸餾法有多種形式。應(yīng) 用最廣的蒸餾法，叫做共 沸蒸餾法。 裝置如圖?，F(xiàn)將共沸蒸餾 法則要如下： 試樣中加入與水不相溶的有機(jī)溶劑, 使水分與有 機(jī)溶劑形成共沸混合物而降低沸點(diǎn), 加熱,使水分 連同溶劑一并蒸出,冷凝之并收集在容器中,根據(jù) 所得水分的容量計(jì)算被測(cè)物的含水量. 有機(jī)溶劑種類很多, 最常用的是甲苯, 苯, 二甲苯.下表列 舉了一些有機(jī)溶劑的物理常數(shù)。 通常按照下列因素選擇溶劑，如能否完全濕潤(rùn)樣品， 適當(dāng)?shù)臒醾鲗?dǎo)，化學(xué)惰性，可燃性以及樣品的性質(zhì)等， 樣品性質(zhì)是選擇溶劑的

6、重要依據(jù)。 產(chǎn)生誤差的原因及其防止: 產(chǎn)生誤差的原因很多。例如，樣品中水分沒(méi)完 全揮發(fā)出來(lái)；水分附集在冷凝器及連接管 的內(nèi)壁；水分溶解在有機(jī)溶劑中；生成了乳濁液， 等等。 添加少量戊醇，異丁醇，可防止出現(xiàn)乳濁液； 對(duì)熱不穩(wěn)定性的食品，除用低沸點(diǎn)的溶劑 外，也可發(fā)散涂布于硅藻土上；為了防止水分附 集于蒸餾器內(nèi)壁，須充分清洗儀器。 5.1.4 快速水分分析法快速水分分析法 基于紅外線和微波干燥技術(shù)的精密儀器，他們采用高熱源， 測(cè)定水分含量為0.005%100%、質(zhì)量為15mg40g不等的樣 品。 自動(dòng)化 5.1.5 卡爾卡爾-費(fèi)歇爾費(fèi)歇爾(Kcal Fisher)法法 適合于測(cè)定低水分含量的食品,

7、 如脫水水果和蔬菜, 糖果 和巧克力及高糖高蛋白低水分樣品. 原理原理: 水存在時(shí),碘與二氧化硫發(fā)生氧化還原反應(yīng): SO2+I2+2H2O=H2SO4+2HI 為使反應(yīng)向右進(jìn)行到底, 體系中加適量吡啶和甲醇: C5H5NI2+ C5H5NSO2+ C5H5N+H2O 2C5H5N HI+ C5H5N SO3 C5H5N SO3+CH3OH C5H5N(H)SO4 CH3 此法測(cè)得的水分是真實(shí)水分. 碘-二氧化硫-吡啶 按1:3:10比例溶解在甲醇中,稱為卡爾- 費(fèi)歇爾試劑. 用此卡爾-費(fèi)歇爾試劑滴定至剛出現(xiàn)微弱黃棕色,表示有 過(guò)量的碘存在,說(shuō)明滴定已達(dá)到終點(diǎn). 卡爾卡爾-費(fèi)歇爾費(fèi)歇爾(Kcal

8、 Fisher)儀儀 5.1.6 紅外吸收光譜法紅外吸收光譜法 近紅外(NIR)范圍(14001450nm, 19201950nm)是水 分子-OH的特征波段. NIR法廣泛用于各類食品的水分分析. 5.2 糖類糖類 糖在糧食、食品及微生物發(fā)酵研究中具有重要的意糖在糧食、食品及微生物發(fā)酵研究中具有重要的意 義。他是一種重要的功能性食品基料。義。他是一種重要的功能性食品基料。 在植物中糖類占干重在植物中糖類占干重8590%如植物細(xì)胞壁，棉花如植物細(xì)胞壁，棉花 樹木樹木纖維素，水稻，土豆纖維素，水稻，土豆淀粉，水果淀粉，水果G，F(xiàn) 動(dòng)物血液動(dòng)物血液G，肝臟，肌肉，肝臟，肌肉糖原，乳汁糖原，乳汁乳糖

9、乳糖 核糖和脫氧核糖存在于核糖和脫氧核糖存在于DNA，RNA中是所有生物中是所有生物 共有的。共有的。 單糖（單糖（Monosaccharides） ：不能被水解成更小分子的糖類，也稱：不能被水解成更小分子的糖類，也稱 為簡(jiǎn)單糖，為簡(jiǎn)單糖，3C7C（丙糖（丙糖庚糖），常見的是庚糖），常見的是5C和和6C糖，核糖糖，核糖 ，葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖。，葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖。 寡糖（寡糖（Oligosaccharides）：水解時(shí)生成幾個(gè)單糖（：水解時(shí)生成幾個(gè)單糖（210個(gè)），有個(gè)），有 用的是雙（二）糖（蔗糖、麥牙糖、乳糖）用的是雙（二）糖（蔗糖、麥牙糖、乳糖） 多糖（多糖（Poly

10、saccharides） ：水解時(shí)產(chǎn)生：水解時(shí)產(chǎn)生20個(gè)以上單糖分子的糖類，個(gè)以上單糖分子的糖類， 包括：同多糖（由一種單糖或其衍生物構(gòu)成，如淀粉、糖原）包括：同多糖（由一種單糖或其衍生物構(gòu)成，如淀粉、糖原） 雜多糖（由一種以上單糖或其衍生物構(gòu)成如，半纖維素、透雜多糖（由一種以上單糖或其衍生物構(gòu)成如，半纖維素、透 明質(zhì)酸）。明質(zhì)酸）。 復(fù)合糖（復(fù)合糖（ Combine saccharides ）：糖蛋白和糖脂）：糖蛋白和糖脂 糖衍生物（糖衍生物（ Sugar derivatives ）：糖胺、糖酸和糖酯）：糖胺、糖酸和糖酯 糖類樣品預(yù)處理糖類樣品預(yù)處理 食品中糖類常與蛋白質(zhì)、脂類和鹽類混雜在一

11、起，導(dǎo)致食品中糖類常與蛋白質(zhì)、脂類和鹽類混雜在一起，導(dǎo)致 色譜柱污染，柱壓上升，嚴(yán)重影響色譜柱的分辯率。色譜柱污染，柱壓上升，嚴(yán)重影響色譜柱的分辯率。 糖類樣品預(yù)處理是除去混雜物以免污染色譜柱和干擾糖糖類樣品預(yù)處理是除去混雜物以免污染色譜柱和干擾糖 類的分離、分析。類的分離、分析。 糖類樣品預(yù)處理包括提取、除雜質(zhì)凈化和樣品濃縮。糖類樣品預(yù)處理包括提取、除雜質(zhì)凈化和樣品濃縮。 注意：注意： 1、 糖易吸濕，因此標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)預(yù)先干燥。糖易吸濕，因此標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)預(yù)先干燥。 2、樣品溫度不能超過(guò)、樣品溫度不能超過(guò)80oC。 3、雙糖在稀酸溶液中易水解。、雙糖在稀酸溶液中易水解。 4、稀糖溶液應(yīng)冷動(dòng)保存。、稀糖

12、溶液應(yīng)冷動(dòng)保存。 5、象葡萄糖等，在水溶液中會(huì)發(fā)生異構(gòu)化，在堿性溶、象葡萄糖等，在水溶液中會(huì)發(fā)生異構(gòu)化，在堿性溶 液中會(huì)發(fā)生烯醇化和降解。液中會(huì)發(fā)生烯醇化和降解。 （1）提?。┨崛?糖酸飲料不需提取，需脫氣。糖酸飲料不需提取，需脫氣。 組織中的多糖用熱水或沸水提取，用稀堿提取酸性組織中的多糖用熱水或沸水提取，用稀堿提取酸性 多糖。多糖。 低分子量糖類最常用的提取溶劑是低分子量糖類最常用的提取溶劑是80%乙醇，提取乙醇，提取 選擇性好，效率高，還可沉淀蛋白質(zhì)。選擇性好，效率高，還可沉淀蛋白質(zhì)。 （2）除雜質(zhì)、凈化）除雜質(zhì)、凈化 用石油醚或乙醚、正己烷、四氯化碳等除去脂類。用石油醚或乙醚、正己烷、

13、四氯化碳等除去脂類。 用乙醇沉淀法除蛋白質(zhì)：用三氯乙酸或高氯酸除蛋白；用乙醇沉淀法除蛋白質(zhì)：用三氯乙酸或高氯酸除蛋白； 超濾法除蛋白；超濾法除蛋白；Somogyi法除蛋白。法除蛋白。 用各種離子交換樹脂或混合樹脂脫鹽。用各種離子交換樹脂或混合樹脂脫鹽。 C18固相萃取柱。固相萃取柱。 （3）樣品濃縮）樣品濃縮 冰凍干燥法冰凍干燥法 離心冷凍干燥法離心冷凍干燥法 5.2.1 氣相色譜法測(cè)定糖類氣相色譜法測(cè)定糖類 氣相色譜要求試樣具有良好的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性。需將糖氣相色譜要求試樣具有良好的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性。需將糖 類衍生成具有易揮發(fā)，對(duì)熱穩(wěn)定的衍生物。類衍生成具有易揮發(fā)，對(duì)熱穩(wěn)定的衍生物。 糖類衍

14、生化糖類衍生化 (1)三甲基硅醚衍生物三甲基硅醚衍生物 是糖的羥基衍生化主要方式之一。是糖的羥基衍生化主要方式之一。 優(yōu)點(diǎn)：衍生物揮發(fā)性強(qiáng)，制備快速、簡(jiǎn)便。優(yōu)點(diǎn)：衍生物揮發(fā)性強(qiáng)，制備快速、簡(jiǎn)便。 缺點(diǎn)：由于各種單糖異構(gòu)體和不同大小環(huán)的特殊單糖的缺點(diǎn)：由于各種單糖異構(gòu)體和不同大小環(huán)的特殊單糖的 存在，色譜峰多于組分單糖數(shù)目，定性定量分析復(fù)雜化存在，色譜峰多于組分單糖數(shù)目，定性定量分析復(fù)雜化 （2）糖的三氟醋酸酯衍生物和糖醇醋酸酯衍生物）糖的三氟醋酸酯衍生物和糖醇醋酸酯衍生物 糖的三氟醋酸酯衍生物揮發(fā)性強(qiáng)，可用強(qiáng)極性柱分離，糖的三氟醋酸酯衍生物揮發(fā)性強(qiáng)，可用強(qiáng)極性柱分離， 分離率顯著提高，試樣量顯

15、著減少。分離率顯著提高，試樣量顯著減少。 糖醇醋酸酯衍生物優(yōu)點(diǎn)是每個(gè)糖只有一個(gè)峰，衍生物十糖醇醋酸酯衍生物優(yōu)點(diǎn)是每個(gè)糖只有一個(gè)峰，衍生物十 分穩(wěn)定，缺點(diǎn)是操作麻煩且耗時(shí)。分穩(wěn)定，缺點(diǎn)是操作麻煩且耗時(shí)。 （3）糖肟和糖腈衍生物）糖肟和糖腈衍生物 糖和鹽酸羥胺在吡啶溶液中加熱反應(yīng)生成糖肟糖和鹽酸羥胺在吡啶溶液中加熱反應(yīng)生成糖肟,糖肟可糖肟可 解決異頭碳原子的鑒別解決異頭碳原子的鑒別. 硅烷化的糖肟色譜的復(fù)雜程度大大降低硅烷化的糖肟色譜的復(fù)雜程度大大降低. 在糖肟的吡啶溶液中加入醋酸酐在糖肟的吡啶溶液中加入醋酸酐, 加熱反應(yīng)生成糖腈乙加熱反應(yīng)生成糖腈乙 酯衍生物酯衍生物. （4）手性糖苷的衍生化）手

16、性糖苷的衍生化 試樣經(jīng)試樣經(jīng)HCl-丁醇水解后丁醇水解后, 用碳酸銀中和用碳酸銀中和, 濾液徹底干燥濾液徹底干燥, 經(jīng)三甲經(jīng)三甲 基硅烷化后基硅烷化后, 用氣相色譜分離用氣相色譜分離. 用三氟乙酸的用三氟乙酸的(+) 2-辛醇預(yù)處理后再乙?；链碱A(yù)處理后再乙?；? （5）氨基糖的衍生化）氨基糖的衍生化 用用4 mol/L三氟乙酸將試樣水解三氟乙酸將試樣水解,然后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成然后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成O-甲基肟乙甲基肟乙 酸鹽酸鹽, 可使中性糖和氨基糖同時(shí)衍生化可使中性糖和氨基糖同時(shí)衍生化, 在氣相色譜中很好的在氣相色譜中很好的 分離分離. （6）糖醛酸的衍生化）糖醛酸的衍生化 醛糖和糖醛酸的混合物先用硼

17、氫化鈉還原醛糖和糖醛酸的混合物先用硼氫化鈉還原, 當(dāng)糖醛酸內(nèi)酯化后當(dāng)糖醛酸內(nèi)酯化后, 用正丙胺將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的用正丙胺將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的N-(1-丙基丙基)-醛胺醛胺,然后用醋酐和吡然后用醋酐和吡 啶將其乙?；⑵湟阴；? 氣相色譜分離鑒定衍生化糖使用氫火焰離氣相色譜分離鑒定衍生化糖使用氫火焰離 子化檢測(cè)器子化檢測(cè)器(FID）。）。 如果三氟乙?；绻阴；? 可使用選擇性電子捕獲檢可使用選擇性電子捕獲檢 測(cè)器測(cè)器(ECD), 它可檢測(cè)它可檢測(cè)10-12g級(jí)含量的糖級(jí)含量的糖. 衍生化糖的氣相色譜測(cè)定衍生化糖的氣相色譜測(cè)定 鑒定蜂蜜中是否摻假 淀粉糖漿 5.2.2 高效液相色譜測(cè)定糖類高效

18、液相色譜測(cè)定糖類 直接進(jìn)樣，快速，方便，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，直接進(jìn)樣，快速，方便，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)， 特別適合某些熱敏感糖類。特別適合某些熱敏感糖類。 （1）鍵合相色譜）鍵合相色譜 氨基鍵合相色譜是最重要的一種糖類分析氨基鍵合相色譜是最重要的一種糖類分析 色譜體系，適用于分析單糖、雙糖及寡糖色譜體系，適用于分析單糖、雙糖及寡糖 等。等。 (2) 離子交換色譜離子交換色譜 離子交換柱不需要每次再生，柱有較好離子交換柱不需要每次再生，柱有較好 的耐受性。的耐受性。 用于糖類分析的有季銨硼酸型陰離子交用于糖類分析的有季銨硼酸型陰離子交 換樹脂換樹脂; 表面薄殼型陰離子交換樹脂表面薄殼型陰離子交換樹脂;聚聚

19、 苯乙烯型陽(yáng)離子交換樹脂苯乙烯型陽(yáng)離子交換樹脂. (3) 凝膠色譜凝膠色譜 快速快速,高分辨率高分辨率, 重復(fù)性好重復(fù)性好. 高效凝膠滲透色譜法用于測(cè)定多糖的純高效凝膠滲透色譜法用于測(cè)定多糖的純 度和分子量及制備性的分離多糖度和分子量及制備性的分離多糖. 流動(dòng)相流動(dòng)相: 水水,緩沖液和含水的有機(jī)溶劑緩沖液和含水的有機(jī)溶劑. 分離相對(duì)分子量為分離相對(duì)分子量為50001000000的多糖的多糖. HPLC分離分析單糖混合物常用離子交換型分離分析單糖混合物常用離子交換型 柱和吸附型柱柱和吸附型柱. 吸附色譜或正相色譜適用于寡糖衍生物的分吸附色譜或正相色譜適用于寡糖衍生物的分 析析. 多糖中所用的多是

20、高效體積排斥色譜多糖中所用的多是高效體積排斥色譜 (HPSEC). 5.2.3毛細(xì)管電泳檢測(cè)法毛細(xì)管電泳檢測(cè)法 用毛細(xì)管區(qū)帶電泳用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)可分離衍生可分離衍生 化糖類化糖類. CE結(jié)合結(jié)合TOF及及CE/MS可對(duì)糖肽可對(duì)糖肽, 糖糖 蛋白蛋白,糖脂等進(jìn)行分析糖脂等進(jìn)行分析. 5.3 5.3 維生素維生素 維生素（維生素（vitaminvitamin）是機(jī)體維持正常功能所）是機(jī)體維持正常功能所 必需，但在人體內(nèi)不能合成或合成量很少，必必需，但在人體內(nèi)不能合成或合成量很少，必 須由食物供給的一組低分子量有機(jī)物質(zhì)。須由食物供給的一組低分子量有機(jī)物質(zhì)。 維生素的功能通常是作為酶的輔助因

21、子（輔維生素的功能通常是作為酶的輔助因子（輔 酶與輔基）。因此它對(duì)動(dòng)物體正常生長(zhǎng)與健康酶與輔基）。因此它對(duì)動(dòng)物體正常生長(zhǎng)與健康 是必需的。是必需的。 維生素的種類繁多，化學(xué)結(jié)構(gòu)差異很大，通常維生素的種類繁多，化學(xué)結(jié)構(gòu)差異很大，通常 接溶解性質(zhì)將其分為脂溶性維生素（接溶解性質(zhì)將其分為脂溶性維生素（lipid-lipid- soluble vitaminssoluble vitamins）和水溶性維生素（）和水溶性維生素（water-water- soluble vitaminssoluble vitamins）兩大類。根據(jù)分布情況，水）兩大類。根據(jù)分布情況，水 溶性維生素又可分為溶性維生素又可分

22、為B B族維生素與維生素族維生素與維生素C C兩類。兩類。 5.3.1 維生素維生素A 又名抗干眼病維生素，或視黃醇。又名抗干眼病維生素，或視黃醇。 維生素維生素A A性質(zhì)活潑，不穩(wěn)定，易被氧化，遇紫外性質(zhì)活潑，不穩(wěn)定，易被氧化，遇紫外 光易分解。維生素光易分解。維生素A A最大吸收波長(zhǎng)在最大吸收波長(zhǎng)在325nm325nm附近，附近， 具有天然熒光。具有天然熒光。 維生素維生素A在食品中常以酯類形式存在，樣品用苛性堿在食品中常以酯類形式存在，樣品用苛性堿 乙醇溶液在抗氧化劑保護(hù)下，加熱皂化后，可使其乙醇溶液在抗氧化劑保護(hù)下，加熱皂化后，可使其 轉(zhuǎn)化為游離的維生素轉(zhuǎn)化為游離的維生素A，然后用有機(jī)

23、溶劑提取。維生，然后用有機(jī)溶劑提取。維生 素素A容易氧化，操作應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。容易氧化，操作應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。 通常采用通常采用RP-HPLC分析維生素分析維生素A，其優(yōu)點(diǎn)是能以短鏈，其優(yōu)點(diǎn)是能以短鏈 視黃酯作內(nèi)標(biāo)物，而且可能同時(shí)分離測(cè)定類胡蘿卜素、視黃酯作內(nèi)標(biāo)物，而且可能同時(shí)分離測(cè)定類胡蘿卜素、 視黃酯及維生素視黃酯及維生素E。但使用。但使用RP-HPLC時(shí)，往往需要先時(shí)，往往需要先 除去樣品的非極性溶劑，再將其溶解于流動(dòng)相或適宜除去樣品的非極性溶劑，再將其溶解于流動(dòng)相或適宜 溶劑中。在大多數(shù)情況下，紫外溶劑中。在大多數(shù)情況下，紫外325nm檢測(cè)維生素檢測(cè)維生素A都都 能獲得足夠的靈敏

24、度和選擇性，光電二極管陣列檢測(cè)能獲得足夠的靈敏度和選擇性，光電二極管陣列檢測(cè) 器的應(yīng)用也越來(lái)越普遍。器的應(yīng)用也越來(lái)越普遍。 牛奶、蛋黃中維生素牛奶、蛋黃中維生素A的的HPLC測(cè)定如下：測(cè)定如下： （1）樣品處理）樣品處理 牛奶（牛奶（50mL)、蛋黃、蛋黃(5g) 乙醇乙醇60mL, 50% NaOH 20mL 50oC 回流回流 30min 乙醚提取，用蒸餾水洗滌提取液乙醚提取，用蒸餾水洗滌提取液 無(wú)水硫酸鈉脫水后，加無(wú)水硫酸鈉脫水后，加0.2gBHT, 定容定容100mL 取取10mL, 在在50oC恒溫水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干恒溫水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干, 用用1.0mL無(wú)水甲醇溶解無(wú)水甲醇溶解,

25、搖勻后上機(jī)測(cè)定搖勻后上機(jī)測(cè)定. (2) 色譜條件：色譜條件： 色譜柱為色譜柱為Bondapak C18 (300mm3.9mm); 流動(dòng)相為甲醇流動(dòng)相為甲醇-水（水（90：10）；）； 流速流速1.0 mL/min; UV 325nm, 或熒光檢測(cè)器，或熒光檢測(cè)器， Em=480nm, Ex=325 nm; 進(jìn)樣進(jìn)樣2L。 維生素維生素D D又稱為抗佝僂病維生素，是類固醇衍又稱為抗佝僂病維生素，是類固醇衍 生物。主要包括生物。主要包括 D D2 2（麥角鈣化醇）及（麥角鈣化醇）及 D D3 3（膽鈣（膽鈣 化醇）?；迹?自然界中，最豐富的維生素自然界中，最豐富的維生素D D的來(lái)源是魚的肝臟

26、的來(lái)源是魚的肝臟 和動(dòng)物體的內(nèi)臟。和動(dòng)物體的內(nèi)臟。 從樣品中提取維生素從樣品中提取維生素D D的方法與提取維生素的方法與提取維生素A A的的 方法類似，先使用方法類似，先使用KOHKOH或或NaOHNaOH乙醇皂化以除去類乙醇皂化以除去類 脂，再用有機(jī)溶劑提取，把水溶性的干擾成分除脂，再用有機(jī)溶劑提取，把水溶性的干擾成分除 去，在提取時(shí)可加入抗氧化劑。去，在提取時(shí)可加入抗氧化劑。 5.3.2 維生素維生素D 測(cè)定維生素測(cè)定維生素D的方法有比色法、分光光度的方法有比色法、分光光度 法、氣相色譜法和高效液相色譜法。比法、氣相色譜法和高效液相色譜法。比 色法由于它的精密度及選擇性差，只能色法由于它的

27、精密度及選擇性差，只能 用于較純樣品的測(cè)定。氣相色譜法需要用于較純樣品的測(cè)定。氣相色譜法需要 對(duì)樣品衍生，操作麻煩。高效液相色譜對(duì)樣品衍生，操作麻煩。高效液相色譜 法測(cè)定維生素法測(cè)定維生素D具有快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，被具有快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，被 AOAC選為正式的方法。選為正式的方法。 （1）氣相色譜法）氣相色譜法 氣相色譜法測(cè)定維生素氣相色譜法測(cè)定維生素D通常用甲基或三通常用甲基或三 甲基硅醚化，但在測(cè)定過(guò)程中，維生素甲基硅醚化，但在測(cè)定過(guò)程中，維生素D2 和維生素和維生素D3在高溫（在高溫（150oC)下容易形成兩下容易形成兩 種熱異構(gòu)物，并出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰。由于轉(zhuǎn)種熱異構(gòu)物，并出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰。由于轉(zhuǎn)

28、 化成兩種熱異構(gòu)物的比率是一定的，故可化成兩種熱異構(gòu)物的比率是一定的，故可 用于維生素用于維生素D的測(cè)定。的測(cè)定。 （2）HPLC HPLC可以分離測(cè)定維生素可以分離測(cè)定維生素D2和維生素和維生素D3的的 異構(gòu)體及其代謝產(chǎn)物，可以將維生素異構(gòu)體及其代謝產(chǎn)物，可以將維生素D與維與維 生素生素D前體及前體及-生育酚、維生素生育酚、維生素A及其脂類及其脂類 分開。一般在硅膠柱上的正相模式進(jìn)行，也分開。一般在硅膠柱上的正相模式進(jìn)行，也 有用有用C18鍵合固定相，以甲醇或者乙腈做流鍵合固定相，以甲醇或者乙腈做流 動(dòng)相。動(dòng)相。 維生素維生素D具有強(qiáng)紫外吸收，一般選用紫外檢具有強(qiáng)紫外吸收，一般選用紫外檢 測(cè)

29、器，測(cè)器，max=265 nm, min=228 nm. 食品中同時(shí)含維生素食品中同時(shí)含維生素D2和維生素和維生素D3的的 情況很少，植物性食品和強(qiáng)化食品主情況很少，植物性食品和強(qiáng)化食品主 要含維生素要含維生素D2，動(dòng)物性食品主要為維，動(dòng)物性食品主要為維 生素生素D3。在維生素。在維生素D的色譜分析中，的色譜分析中， 測(cè)定維生素測(cè)定維生素D3通常用維生素通常用維生素D2作內(nèi)標(biāo)，作內(nèi)標(biāo)， 反之亦然。反之亦然。 5.3.3 維生素維生素E 維生素維生素E又稱生育酚（又稱生育酚（tocopherol），有六種，），有六種， 其中四種其中四種、和和種有生物活性。自然界以種有生物活性。自然界以 -生育酚

30、（結(jié)構(gòu)如下圖）分布最廣。維生素生育酚（結(jié)構(gòu)如下圖）分布最廣。維生素E在在 無(wú)氧條件下對(duì)熱穩(wěn)定，但對(duì)氧十分敏感，易自無(wú)氧條件下對(duì)熱穩(wěn)定，但對(duì)氧十分敏感，易自 身氧化，能避免脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，因而能身氧化，能避免脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，因而能 保護(hù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能。保護(hù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能。 黃色粘油狀物，不溶于水，黃色粘油狀物，不溶于水， 溶于有機(jī)溶劑。溶于有機(jī)溶劑。 動(dòng)物組織中所含維生素動(dòng)物組織中所含維生素E的測(cè)定較復(fù)雜，在測(cè)定的測(cè)定較復(fù)雜，在測(cè)定 之前首先要除去類脂如膽固醇，它的存在會(huì)引起之前首先要除去類脂如膽固醇，它的存在會(huì)引起 嚴(yán)重干擾。去除類脂通常采用有機(jī)溶劑提取。常嚴(yán)重干擾。去除類脂通

31、常采用有機(jī)溶劑提取。常 用的有機(jī)溶劑是氯仿、丙酮、乙醚和乙醇。從樣用的有機(jī)溶劑是氯仿、丙酮、乙醚和乙醇。從樣 品中提取維生素品中提取維生素E有皂化法及直接提取法兩種。有皂化法及直接提取法兩種。 直接提取法：用有機(jī)溶劑直接提取，然后在低溫直接提取法：用有機(jī)溶劑直接提取，然后在低溫 下進(jìn)行濃縮結(jié)晶。除去脂類，將維生素下進(jìn)行濃縮結(jié)晶。除去脂類，將維生素E分離出分離出 來(lái)。對(duì)一些植物性樣品可以用熱的乙醇或丙二醇來(lái)。對(duì)一些植物性樣品可以用熱的乙醇或丙二醇 及氯仿在索氏提取器中將脂溶性物質(zhì)提出來(lái)。及氯仿在索氏提取器中將脂溶性物質(zhì)提出來(lái)。 提取后凈化處理：固相萃取法和提取后凈化處理：固相萃取法和TLC等。等

32、。 （1）氣相色譜法）氣相色譜法 氣相色譜法測(cè)定維生素氣相色譜法測(cè)定維生素E E，樣品需要衍化，衍，樣品需要衍化，衍 生產(chǎn)物通常是三甲基硅醚，用氫火焰離子檢測(cè)生產(chǎn)物通常是三甲基硅醚，用氫火焰離子檢測(cè) 器。采用硅酮類的器。采用硅酮類的OV-1OV-1、OV-17OV-17作為固定相。作為固定相。 硅酮類的硅酮類的OV-1OV-1、OV-17OV-17已用于食品（如大麥、已用于食品（如大麥、 面粉、谷物、脂肪和油脂）樣品的測(cè)定。面粉、谷物、脂肪和油脂）樣品的測(cè)定。 三甲基硅醚化三甲基硅醚化GCGC法測(cè)定動(dòng)物脂肪和植物油中的法測(cè)定動(dòng)物脂肪和植物油中的 生育酚被推薦為生育酚被推薦為IUPACIUPAC

33、（19811981）方法。）方法。 （2）HPLC 生育酚具有強(qiáng)熒光性，同時(shí)還對(duì)熒光檢測(cè)器有著故生育酚具有強(qiáng)熒光性，同時(shí)還對(duì)熒光檢測(cè)器有著故 有的敏感和選擇性。因此維生素有的敏感和選擇性。因此維生素E測(cè)定時(shí)多選擇熒光測(cè)定時(shí)多選擇熒光 檢測(cè)器（檢測(cè)器（Ex295nm，Em330nm）。而生育酚酯熒光）。而生育酚酯熒光 性較弱，若在色譜分析前未經(jīng)水解，則要用性較弱，若在色譜分析前未經(jīng)水解，則要用UV檢測(cè)檢測(cè) 器（器（280nm）。）。 用甲醇從食品樣品中將維生素用甲醇從食品樣品中將維生素E提取出來(lái)，提取液通提取出來(lái)，提取液通 過(guò)反相色譜柱分離，分配體系進(jìn)行過(guò)反相色譜柱分離，分配體系進(jìn)行HPLC分析

34、，用含分析，用含 水的甲醇溶液為流動(dòng)相，作恒流洗脫，在水的甲醇溶液為流動(dòng)相，作恒流洗脫，在10min內(nèi)即內(nèi)即 可完成一次。采用紫外吸收檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。可完成一次。采用紫外吸收檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。 水溶性維生素包括水溶性維生素包括B族維生素和維生素族維生素和維生素C。 水溶性維生素體內(nèi)過(guò)剩的部分均可由尿排出體水溶性維生素體內(nèi)過(guò)剩的部分均可由尿排出體 外，因而在體內(nèi)很少蓄積，也不會(huì)因此而發(fā)生外，因而在體內(nèi)很少蓄積，也不會(huì)因此而發(fā)生 中毒。又因?yàn)樵隗w內(nèi)的儲(chǔ)存很少，所以必須經(jīng)中毒。又因?yàn)樵隗w內(nèi)的儲(chǔ)存很少，所以必須經(jīng) 常從食物中攝取。常從食物中攝取。 5.3.4 維生素維生素 C 又稱又稱L-抗壞血酸（抗壞

35、血酸（ascorbic acid）。）。 它在人體內(nèi)不能合成，必須依靠外界供給。維生它在人體內(nèi)不能合成，必須依靠外界供給。維生 素素C不僅具有廣泛的生理功能，而且在食品工業(yè)不僅具有廣泛的生理功能，而且在食品工業(yè) 上常用作抗氧化劑。因此測(cè)定食品中維生素上常用作抗氧化劑。因此測(cè)定食品中維生素C的的 含量用以評(píng)價(jià)食品品質(zhì)及食品加工過(guò)程中維生素含量用以評(píng)價(jià)食品品質(zhì)及食品加工過(guò)程中維生素 C的變化情況具有重要的意義。的變化情況具有重要的意義。 測(cè)定維生素測(cè)定維生素C的方法有的方法有2，4-二硝基苯肼氧化法、二硝基苯肼氧化法、 極譜法、熒光法、色譜法等，氣相色譜法很少應(yīng)極譜法、熒光法、色譜法等，氣相色譜法

36、很少應(yīng) 用，現(xiàn)在多使用高效液相色譜法。用，現(xiàn)在多使用高效液相色譜法。 （1） 2，4-二硝基苯肼比色法（二硝基苯肼比色法（GB 12392- 90) 用草酸提取樣品，活性炭使提取液中還原用草酸提取樣品，活性炭使提取液中還原 型抗壞血酸氧化成為脫氫抗壞血酸，與型抗壞血酸氧化成為脫氫抗壞血酸，與2， 4-二硝基苯肼作用生成紅色的脎，其呈色二硝基苯肼作用生成紅色的脎，其呈色 的強(qiáng)度與總抗壞血酸含量成正比。此法操的強(qiáng)度與總抗壞血酸含量成正比。此法操 作比較簡(jiǎn)便、快速，不需要特殊儀器，并作比較簡(jiǎn)便、快速，不需要特殊儀器，并 適用于各種食品。適用于各種食品。 （2）熒光法）熒光法 抗壞血酸在氧化劑存在下，

37、被氧化成脫抗壞血酸在氧化劑存在下，被氧化成脫 氫抗壞血酸，氧化型的抗壞血酸與鄰苯氫抗壞血酸，氧化型的抗壞血酸與鄰苯 二胺作用生成有熒光的喹喔啉衍生物。二胺作用生成有熒光的喹喔啉衍生物。 此熒光化合物的激發(fā)波長(zhǎng)是此熒光化合物的激發(fā)波長(zhǎng)是350nm，熒，熒 光波長(zhǎng)在光波長(zhǎng)在433nm，其熒光強(qiáng)度與抗壞血，其熒光強(qiáng)度與抗壞血 酸含量成正比。酸含量成正比。 （3）氣相色譜法）氣相色譜法 維生素維生素C是種難揮發(fā)性的物質(zhì)，通常將其衍生為是種難揮發(fā)性的物質(zhì)，通常將其衍生為 三甲基硅醚衍生物，用非極性固定液作固定相，三甲基硅醚衍生物，用非極性固定液作固定相， FID檢測(cè)，可以分離測(cè)定抗壞血酸、脫氫抗壞血檢測(cè)

38、，可以分離測(cè)定抗壞血酸、脫氫抗壞血 酸和酸和2，3-dioxo-古羅糖酸。食品中維生素古羅糖酸。食品中維生素C可用可用 偏磷酸進(jìn)行提取，用纖維素層析柱去除干擾物偏磷酸進(jìn)行提取，用纖維素層析柱去除干擾物 質(zhì)，衍生化后測(cè)定。質(zhì)，衍生化后測(cè)定。 另一種方法是用乙醇提取食品中維生素另一種方法是用乙醇提取食品中維生素C和非揮和非揮 發(fā)性有機(jī)酸，加乙酸鉛進(jìn)行沉淀，再將維生素發(fā)性有機(jī)酸，加乙酸鉛進(jìn)行沉淀，再將維生素C 變成游離態(tài)，衍生后測(cè)定。變成游離態(tài)，衍生后測(cè)定。 （4）液相色譜法）液相色譜法 HPLC測(cè)定維生素測(cè)定維生素C的分離方式主要有三大類：的分離方式主要有三大類： 反相鍵合相色譜，一般采用十八烷基

39、硅烷鍵合相作固定反相鍵合相色譜，一般采用十八烷基硅烷鍵合相作固定 相，極性溶劑作流動(dòng)相；相，極性溶劑作流動(dòng)相； 離子交換色譜，常采用帶離子交換基團(tuán)的硅膠鍵合相式離子交換色譜，常采用帶離子交換基團(tuán)的硅膠鍵合相式 離子交換樹脂作固定相，流動(dòng)相通常為酸性緩沖溶劑，離子交換樹脂作固定相，流動(dòng)相通常為酸性緩沖溶劑， 有時(shí)在酸性緩沖溶劑中摻入一定量的有機(jī)溶劑；有時(shí)在酸性緩沖溶劑中摻入一定量的有機(jī)溶劑； 反相離子對(duì)色譜，它是在維生素反相離子對(duì)色譜，它是在維生素C的的HPLC分析中采用最分析中采用最 多的方法。通常采用帶烴基的非極性硅膠硅烷化鍵合相多的方法。通常采用帶烴基的非極性硅膠硅烷化鍵合相 為固定相，以

40、甲醇水溶液等極性溶液為流動(dòng)相，在流動(dòng)為固定相，以甲醇水溶液等極性溶液為流動(dòng)相，在流動(dòng) 相中加入一種堿性反離子，常用的反離子為十二烷基三相中加入一種堿性反離子，常用的反離子為十二烷基三 甲基銨鹽等各種季銨鹽。甲基銨鹽等各種季銨鹽。 5.4 5.4 脂類和脂肪酸脂類和脂肪酸 脂類包括油類、脂肪類和類脂三種基本形式。脂類包括油類、脂肪類和類脂三種基本形式。 大部分構(gòu)成食物的脂肪和動(dòng)物體脂主要以甘油大部分構(gòu)成食物的脂肪和動(dòng)物體脂主要以甘油 三酯為其基本結(jié)構(gòu)。甘油三酯實(shí)際上就是一分三酯為其基本結(jié)構(gòu)。甘油三酯實(shí)際上就是一分 子甘油與三分子脂肪酸所形成的酯，構(gòu)成三個(gè)子甘油與三分子脂肪酸所形成的酯，構(gòu)成三個(gè)

41、分子脂肪酸的種類很多，目前已知存在于自然分子脂肪酸的種類很多，目前已知存在于自然 界的脂肪酸有界的脂肪酸有40多種。多種。 5.4.1 脂肪的提取脂肪的提取 （1）乙醚抽提法）乙醚抽提法 適用于一般食品，特別是脂肪含量比較高的，脂肪和組適用于一般食品，特別是脂肪含量比較高的，脂肪和組 織結(jié)合比較少的，干燥的粉末和容易粉碎的食品?？椊Y(jié)合比較少的，干燥的粉末和容易粉碎的食品。 試樣粉碎或進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚?，除去水分等的脂肪容易試樣粉碎或進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚?，除去水分等的脂肪容?被抽提，食品干燥狀態(tài)下適宜采用索氏抽提器的抽提方法。被抽提，食品干燥狀態(tài)下適宜采用索氏抽提器的抽提方法。 抽提用的乙醚或石油醚

42、要求無(wú)水、無(wú)醇、無(wú)過(guò)氧化物，抽提用的乙醚或石油醚要求無(wú)水、無(wú)醇、無(wú)過(guò)氧化物， 揮發(fā)殘?jiān)康?，因?yàn)樗痛紝?dǎo)致水溶性物質(zhì)溶解，如水溶揮發(fā)殘?jiān)康?，因?yàn)樗痛紝?dǎo)致水溶性物質(zhì)溶解，如水溶 性鹽類、可溶性糖類等，可使測(cè)定結(jié)果偏高。過(guò)氧化物會(huì)導(dǎo)性鹽類、可溶性糖類等，可使測(cè)定結(jié)果偏高。過(guò)氧化物會(huì)導(dǎo) 致脂肪氧化及在烘烤時(shí)也有引起爆炸的危險(xiǎn)。乙醚中的過(guò)氧致脂肪氧化及在烘烤時(shí)也有引起爆炸的危險(xiǎn)。乙醚中的過(guò)氧 化物，主要是在貯存過(guò)程中，由于空氣、光線和溫度的作用，化物，主要是在貯存過(guò)程中，由于空氣、光線和溫度的作用， 致使乙醚緩慢氧化而形成的過(guò)氧化物。致使乙醚緩慢氧化而形成的過(guò)氧化物。 檢查過(guò)氧化物的方法：檢查

43、過(guò)氧化物的方法： 取取6ml乙醚，加乙醚，加2ml10碘化鉀溶液，用力振搖，放置碘化鉀溶液，用力振搖，放置 1min，若出現(xiàn)黃色，則證明有過(guò)氧化物存在。應(yīng)另選，若出現(xiàn)黃色，則證明有過(guò)氧化物存在。應(yīng)另選 乙醚或處理后再用。乙醚或處理后再用。 除去乙醚中過(guò)氧化物的方法：除去乙醚中過(guò)氧化物的方法： 取乙醚取乙醚5份加份加10亞硫酸鈉亞硫酸鈉1份，加鹽酸酸化，振搖、份，加鹽酸酸化，振搖、 靜置分層后，棄去水層，再用水洗至中性，用無(wú)水氯靜置分層后，棄去水層，再用水洗至中性，用無(wú)水氯 化鈣或無(wú)水硫酸鈉脫水后，再進(jìn)行恒溫（化鈣或無(wú)水硫酸鈉脫水后，再進(jìn)行恒溫（34.5）重）重 蒸餾，重蒸餾時(shí)可放入無(wú)銹鐵絲幾段

44、或光亮鋁片幾片，蒸餾，重蒸餾時(shí)可放入無(wú)銹鐵絲幾段或光亮鋁片幾片， 蒸餾后，再用無(wú)水氯化鈣或無(wú)水硫酸鈉脫水，放置一蒸餾后，再用無(wú)水氯化鈣或無(wú)水硫酸鈉脫水，放置一 晝夜，取上層清液使用。晝夜，取上層清液使用。 （2）酸分解法）酸分解法 適用于結(jié)合或包藏于組織中的脂肪。結(jié)合或包藏于組織適用于結(jié)合或包藏于組織中的脂肪。結(jié)合或包藏于組織 中的脂肪常不溶于水，但加酸后因水解而形成液狀的食中的脂肪常不溶于水，但加酸后因水解而形成液狀的食 品，如：谷類、面包、通心粉、豆類、蛋類、蘑菇類、品，如：谷類、面包、通心粉、豆類、蛋類、蘑菇類、 烹調(diào)加工食品等。烹調(diào)加工食品等。 （3）勒譯戈特里布（）勒譯戈特里布（Ro

45、ese-Crotflieb)法法 主要在牛奶和乳制品中的應(yīng)用，適用于含乳脂肪的食品主要在牛奶和乳制品中的應(yīng)用，適用于含乳脂肪的食品 和含脂量比較高的液狀或乳狀的食品。和含脂量比較高的液狀或乳狀的食品。 用乙醚抽提。用乙醚抽提。 （4）氯仿）氯仿-甲醇混合液抽提法甲醇混合液抽提法 適用于大豆和大豆制品，蛋適用于大豆和大豆制品，蛋 類等含磷脂等多的極性脂肪食品。類等含磷脂等多的極性脂肪食品。 氯仿氯仿-甲醇（甲醇（2：1）抽提。）抽提。 5.4.2 脂類氣相色譜法分析脂類氣相色譜法分析 大部分脂類在大部分脂類在GC分析前必須經(jīng)過(guò)衍生化，因?yàn)榉治銮氨仨毥?jīng)過(guò)衍生化，因?yàn)?它們不是揮發(fā)性差就是對(duì)熱不穩(wěn)定

46、。由于脂類它們不是揮發(fā)性差就是對(duì)熱不穩(wěn)定。由于脂類 通常只含碳、氫、氧元素，檢測(cè)一般采用氫火通常只含碳、氫、氧元素，檢測(cè)一般采用氫火 焰離子檢測(cè)器（焰離子檢測(cè)器（FID）。）。 除了食用油外，幾乎所有的脂類樣品都需要初除了食用油外，幾乎所有的脂類樣品都需要初 提取。對(duì)含活性酶的生物組織樣提取，需要用提取。對(duì)含活性酶的生物組織樣提取，需要用 降解酶預(yù)先將脂肪酶和脂氧合酶失活。游離脂降解酶預(yù)先將脂肪酶和脂氧合酶失活。游離脂 肪可用有機(jī)溶劑直接提取，但結(jié)合了非脂類組肪可用有機(jī)溶劑直接提取，但結(jié)合了非脂類組 分的脂類在萃取前需要酸水解等處理，以形成分的脂類在萃取前需要酸水解等處理，以形成 游離態(tài)。游離

47、態(tài)。 舉例：脂肪酸酯的舉例：脂肪酸酯的GC檢測(cè)檢測(cè) 脂肪酸酯用醚或氯仿甲醇混合液提取后，用堿處理，甘脂肪酸酯用醚或氯仿甲醇混合液提取后，用堿處理，甘 油酯以及磷脂等構(gòu)成脂肪酸的物質(zhì)變成水溶性的堿鹽，然油酯以及磷脂等構(gòu)成脂肪酸的物質(zhì)變成水溶性的堿鹽，然 后用有機(jī)溶劑去除不皂化物（甾醇、萜烯、蠟等），再用后用有機(jī)溶劑去除不皂化物（甾醇、萜烯、蠟等），再用 酸水解，使其轉(zhuǎn)變成游離脂肪酸。經(jīng)硫酸甲酯化處理后成酸水解，使其轉(zhuǎn)變成游離脂肪酸。經(jīng)硫酸甲酯化處理后成 為脂肪酸甲酯，用為脂肪酸甲酯，用GC分離各種脂肪酸。分離各種脂肪酸。 脂肪酸甲酯混合物大多采用填充柱進(jìn)行分離，常用為脂肪酸甲酯混合物大多采用填充

48、柱進(jìn)行分離，常用為3- 20（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）固定液涂漬在惰性的擔(dān)體上，柱長(zhǎng)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）固定液涂漬在惰性的擔(dān)體上，柱長(zhǎng)1.5- 3.0m。固定液可使用極性的或非極性的，一般極性固定液。固定液可使用極性的或非極性的，一般極性固定液 對(duì)不飽和甲酯有較好的分離，不飽和甲酯的保留時(shí)間比飽對(duì)不飽和甲酯有較好的分離，不飽和甲酯的保留時(shí)間比飽 和甲酯的保留時(shí)間長(zhǎng)，但在非極性固定液上洗脫順序剛好和甲酯的保留時(shí)間長(zhǎng)，但在非極性固定液上洗脫順序剛好 相反。相反。 毛細(xì)管毛細(xì)管GC分析脂肪酸甲酯通常用極性固定相如分析脂肪酸甲酯通常用極性固定相如 Carbowax 20M和和SP-2340。不飽和脂肪酸在極性固定相。不飽和

49、脂肪酸在極性固定相 上的分離效果要比非極性相好。上的分離效果要比非極性相好。 多不飽和脂肪酸有著很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，魚油中所含的二多不飽和脂肪酸有著很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，魚油中所含的二 十碳五烯酸（十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（）和二十二碳六烯酸（DHA）具有）具有 降血脂、抗血栓和抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用。鄭立立等研降血脂、抗血栓和抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用。鄭立立等研 究了氣相色譜紅外光譜聯(lián)用分析魚油中究了氣相色譜紅外光譜聯(lián)用分析魚油中EPA和和DHA 的方法，采用氫火焰、紅外光譜雙檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)，建的方法，采用氫火焰、紅外光譜雙檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)，建 立了立了EPA和和DHA的蒸氣相紅外標(biāo)準(zhǔn)譜圖和氣相色

50、譜保的蒸氣相紅外標(biāo)準(zhǔn)譜圖和氣相色譜保 留時(shí)間數(shù)據(jù)庫(kù)，提供了一種在無(wú)法找到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況留時(shí)間數(shù)據(jù)庫(kù)，提供了一種在無(wú)法找到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況 下對(duì)魚油中下對(duì)魚油中EPA和和DHA進(jìn)行定性、定量分析的簡(jiǎn)便方進(jìn)行定性、定量分析的簡(jiǎn)便方 法。法。 5.4.3 脂類脂類HPLC分析分析 （1）脂肪）脂肪 脂肪的脂肪的HPLC分離測(cè)定可采用正相色譜法和反相分離測(cè)定可采用正相色譜法和反相 色譜法。一般而言，正相色譜法主要用于脂肪色譜法。一般而言，正相色譜法主要用于脂肪 類別之間的分離，而反相色譜法多用于同族物類別之間的分離，而反相色譜法多用于同族物 質(zhì)的分離。由于反相色譜操作比較容易，因此質(zhì)的分離。由于反相色譜

51、操作比較容易，因此 應(yīng)用較多，其中以應(yīng)用較多，其中以C18柱應(yīng)用最廣。柱應(yīng)用最廣。 采用采用RPHPLC時(shí)非水流動(dòng)相更為有利，因?yàn)闀r(shí)非水流動(dòng)相更為有利，因?yàn)?它能增加脂肪的溶解度，防止在柱上出現(xiàn)沉淀，它能增加脂肪的溶解度，防止在柱上出現(xiàn)沉淀， 提高柱效和穩(wěn)定性。提高柱效和穩(wěn)定性。 脂肪在反相柱上的洗脫順序與其碳鏈長(zhǎng)度和雙鍵脂肪在反相柱上的洗脫順序與其碳鏈長(zhǎng)度和雙鍵 數(shù)量有關(guān)。脂肪的不飽和度增加，出現(xiàn)峰較早，數(shù)量有關(guān)。脂肪的不飽和度增加，出現(xiàn)峰較早， 但鏈長(zhǎng)增加，則出峰較遲。由于碳鏈長(zhǎng)度和雙鍵但鏈長(zhǎng)增加，則出峰較遲。由于碳鏈長(zhǎng)度和雙鍵 數(shù)量對(duì)保留時(shí)間影響正好相反，因此高碳數(shù)的飽數(shù)量對(duì)保留時(shí)間影響

52、正好相反，因此高碳數(shù)的飽 和脂肪和多不飽和脂肪的峰形會(huì)出現(xiàn)重疊。通常和脂肪和多不飽和脂肪的峰形會(huì)出現(xiàn)重疊。通常 反式異構(gòu)體在對(duì)應(yīng)的順式后出峰，雙鍵的位置越反式異構(gòu)體在對(duì)應(yīng)的順式后出峰，雙鍵的位置越 接近羧基保留時(shí)間越短。接近羧基保留時(shí)間越短。 HPLC分析脂類最常用的檢測(cè)器是蒸發(fā)光散射檢分析脂類最常用的檢測(cè)器是蒸發(fā)光散射檢 測(cè)器（測(cè)器（ELSD）。它具有以下優(yōu)點(diǎn)：）。它具有以下優(yōu)點(diǎn)： 它能檢測(cè)任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品；它能檢測(cè)任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品； 因?yàn)橐驗(yàn)镋LSDELSD的響應(yīng)與樣品的官能團(tuán)和光學(xué)特征無(wú)關(guān)，的響應(yīng)與樣品的官能團(tuán)和光學(xué)特征無(wú)關(guān)， 所以脂肪酸不需要衍生，這樣極大減少了樣品

53、的所以脂肪酸不需要衍生，這樣極大減少了樣品的 前處理和消除了紫外末端區(qū)檢測(cè)的麻煩；前處理和消除了紫外末端區(qū)檢測(cè)的麻煩； ELSDELSD能適用于多溶劑梯度洗脫，基線平穩(wěn)，因而能適用于多溶劑梯度洗脫，基線平穩(wěn)，因而 可提高分辨率和分析速度，測(cè)定游離脂肪酸和二可提高分辨率和分析速度，測(cè)定游離脂肪酸和二 甘油酯、三甘油酯；甘油酯、三甘油酯； 靈敏度很高。靈敏度很高。 （2）脂肪酸）脂肪酸 常規(guī)常規(guī)HPLC方法用于非衍生脂肪酸的檢測(cè)從靈敏度和方法用于非衍生脂肪酸的檢測(cè)從靈敏度和 選擇性來(lái)說(shuō)都是不可取的，因?yàn)槠浠衔锿ǔ２缓羞x擇性來(lái)說(shuō)都是不可取的，因?yàn)槠浠衔锿ǔ２缓?合適的發(fā)色團(tuán)，許多不同的衍生技

54、術(shù)已被用來(lái)克服這合適的發(fā)色團(tuán)，許多不同的衍生技術(shù)已被用來(lái)克服這 些障礙，常用的衍生化方法有以下幾種。些障礙，常用的衍生化方法有以下幾種。 苯甲酰甲基溴和苯甲酰甲基溴衍生化苯甲酰甲基溴和苯甲酰甲基溴衍生化 這類試劑對(duì)羧酸的衍生化反應(yīng)常在質(zhì)子惰性溶劑如苯、這類試劑對(duì)羧酸的衍生化反應(yīng)常在質(zhì)子惰性溶劑如苯、 乙腈、丙酮中進(jìn)行。加入衍生化試劑之前先用氫氧化乙腈、丙酮中進(jìn)行。加入衍生化試劑之前先用氫氧化 鉀或碳酸鉀或碳酸氫鉀中和酸。為了提高反應(yīng)的靈敏鉀或碳酸鉀或碳酸氫鉀中和酸。為了提高反應(yīng)的靈敏 度和選擇性，常常需要加入冠醚和叔胺作為催化劑。度和選擇性，常常需要加入冠醚和叔胺作為催化劑。 3- 3-羥甲基

55、羥甲基- -吡啶衍生吡啶衍生 稱取適量樣品，加稱取適量樣品，加1010倍樣的倍樣的3-3-羥甲基羥甲基- -吡啶和吡啶和4-4-二甲基氨二甲基氨 基吡啶的二氯甲烷溶液，于室溫下反應(yīng)基吡啶的二氯甲烷溶液，于室溫下反應(yīng)3h3h，加己烷，加己烷- -乙醚乙醚 （1 1：1 1）溶液提取，用）溶液提取，用2mol/L HCl2mol/L HCl和水進(jìn)行液液分配，衍和水進(jìn)行液液分配，衍 生物用生物用C8C8柱分離，流動(dòng)相為乙腈柱分離，流動(dòng)相為乙腈- -水（水（9292：8 8），），UVUV檢測(cè)或檢測(cè)或 熒光檢測(cè)。熒光檢測(cè)。 4-4-溴甲基溴甲基-7-7-甲氧基香豆素（甲氧基香豆素（BrMMC)BrMM

56、C)衍生衍生 BrMMCBrMMC是最典型的香豆素類熒光衍生化試劑，它與羧酸的是最典型的香豆素類熒光衍生化試劑，它與羧酸的 反應(yīng)在質(zhì)子惰性溶劑（如丙酮、乙腈等）中進(jìn)行，以無(wú)水反應(yīng)在質(zhì)子惰性溶劑（如丙酮、乙腈等）中進(jìn)行，以無(wú)水 碳酸鉀或冠醚為催化劑。由于試劑及其衍生物對(duì)光敏感，碳酸鉀或冠醚為催化劑。由于試劑及其衍生物對(duì)光敏感， 最好在暗處操作，最好在暗處操作，BrMMCBrMMC可用于測(cè)定脂肪酸、二元酸等?？捎糜跍y(cè)定脂肪酸、二元酸等。 衍生物用衍生物用C8C8或或C18C18柱分離，甲醇或乙腈的水溶液作流動(dòng)相，柱分離，甲醇或乙腈的水溶液作流動(dòng)相， 熒光檢測(cè)。熒光檢測(cè)。 5.5 5.5 氨基酸氨基

57、酸 氨基酸的分離和檢測(cè)手段，以往用化學(xué)分析法、層氨基酸的分離和檢測(cè)手段，以往用化學(xué)分析法、層 析法、比色法、氣相色譜法、氨基酸自動(dòng)分析儀。析法、比色法、氣相色譜法、氨基酸自動(dòng)分析儀。 隨著高效液相色譜及填料的發(fā)展，隨著高效液相色譜及填料的發(fā)展，HPLC在氨基酸在氨基酸 檢測(cè)方面顯示了其特有的優(yōu)越性。但大多數(shù)氨基酸檢測(cè)方面顯示了其特有的優(yōu)越性。但大多數(shù)氨基酸 無(wú)紫外吸收和熒光發(fā)射特性，為提高分析檢測(cè)靈敏無(wú)紫外吸收和熒光發(fā)射特性，為提高分析檢測(cè)靈敏 度和分離選擇特性，通常將氨基酸衍生，衍生方式度和分離選擇特性，通常將氨基酸衍生，衍生方式 有柱前衍生法與柱后衍生法。有柱前衍生法與柱后衍生法。 HPL

58、C與各種衍生相結(jié)合的氨基酸分析技術(shù)，構(gòu)成與各種衍生相結(jié)合的氨基酸分析技術(shù)，構(gòu)成 了具有廣泛適用性的現(xiàn)代氨基酸分析技術(shù)。了具有廣泛適用性的現(xiàn)代氨基酸分析技術(shù)。 5.5.1 樣品處理樣品處理 測(cè)定蛋白質(zhì)中的總氨基酸，必須先把蛋白質(zhì)水解成游離測(cè)定蛋白質(zhì)中的總氨基酸，必須先把蛋白質(zhì)水解成游離 氨基酸。可采用酸水解、堿水解和酶水解方法，其中以氨基酸。可采用酸水解、堿水解和酶水解方法，其中以 酸水解法應(yīng)用最廣泛。酸水解法應(yīng)用最廣泛。 1）酸水解）酸水解 條件：常用硫酸或鹽酸進(jìn)行水解。一般用條件：常用硫酸或鹽酸進(jìn)行水解。一般用6mol/LHCl， 4mol/L H2SO4煮沸回流煮沸回流24小時(shí)左右。小時(shí)左

59、右。 優(yōu)點(diǎn)：可蒸發(fā)除去鹽酸，水解徹底，終產(chǎn)物為優(yōu)點(diǎn)：可蒸發(fā)除去鹽酸，水解徹底，終產(chǎn)物為L(zhǎng)-氨基氨基 酸，產(chǎn)物單一，無(wú)消旋現(xiàn)象。酸，產(chǎn)物單一，無(wú)消旋現(xiàn)象。 缺點(diǎn)：色氨酸破壞，絲氨酸和蘇氨酸有一小部分被水解，缺點(diǎn)：色氨酸破壞，絲氨酸和蘇氨酸有一小部分被水解， 同時(shí)天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下來(lái)。同時(shí)天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下來(lái)。 在蛋白質(zhì)氨基酸測(cè)定中，水解過(guò)程的嚴(yán)格控制和條件選在蛋白質(zhì)氨基酸測(cè)定中，水解過(guò)程的嚴(yán)格控制和條件選 擇至關(guān)重要，否則將引起較大的實(shí)驗(yàn)誤差。水解時(shí)必須擇至關(guān)重要，否則將引起較大的實(shí)驗(yàn)誤差。水解時(shí)必須 注意以下環(huán)節(jié)：注意以下環(huán)節(jié)： 鹽酸的純度。在酸水解時(shí)，某些氨基

60、酸，如酪氨酸，能鹽酸的純度。在酸水解時(shí)，某些氨基酸，如酪氨酸，能 與鹽酸中的氯等鹵素反應(yīng)生成鹵代物而影響測(cè)定結(jié)果。與鹽酸中的氯等鹵素反應(yīng)生成鹵代物而影響測(cè)定結(jié)果。 因此應(yīng)選擇優(yōu)級(jí)純鹽酸，并加以苯酚以抑制上述反應(yīng)。因此應(yīng)選擇優(yōu)級(jí)純鹽酸，并加以苯酚以抑制上述反應(yīng)。 氮?dú)獗Ｗo(hù)。在高溫水解時(shí)，空氣或試劑中的氧的存在會(huì)氮?dú)獗Ｗo(hù)。在高溫水解時(shí)，空氣或試劑中的氧的存在會(huì) 使氨基酸進(jìn)一步分解，影響水解回收率。使氨基酸進(jìn)一步分解，影響水解回收率。 水解溫度和時(shí)間。常采用的酸水解條件是水解溫度和時(shí)間。常采用的酸水解條件是110110，24h24h。 若提高水解溫度，水解時(shí)間可縮短，但對(duì)個(gè)別氨基酸的若提高水解溫度，