灰樹(shù)花多糖D組分對(duì)細(xì)顆粒物誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

1、灰樹(shù)花多糖d組分對(duì)細(xì)顆粒物誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 摘要 目的 研究灰樹(shù)花多糖d組分（d-fraction）對(duì)細(xì)顆粒物（srm 2786）誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞（16hbe）損傷的保護(hù)作用。 方法 利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)srm 2786或d-fraction對(duì)16hbe細(xì)胞增殖的影響，確定給藥濃度；將16hbe細(xì)胞分7組，分別為對(duì)照組、模型組（125 g/ml srm 2786）和不同濃度d-fraction給藥組（分別給予12.5、25、50、100、200 g/ml d-fraction，同時(shí)給予125 g/ml srm 2786），細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞

2、培養(yǎng)液白介素-1（il-1）、白介素-6（il-6）、腫瘤壞死因子-（tnf-）和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子（gm-csf）的含量。 結(jié)果 31.25500 g/ml srm 2786處理使細(xì)胞存活率顯著降低（p 0.05）。125 g/ml的srm 2786刺激使16hbe細(xì)胞il-1、il-6、tnf-和gm-csf釋放顯著升高（p 0.05），d-fraction（100 g/ml）顯著抑制srm 2786誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子釋放（p 0.01），且能顯著提高損傷細(xì)胞存活率。 結(jié)論 細(xì)顆粒物能抑制16hbe細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)炎癥因子釋放，d-fraction對(duì)細(xì)顆粒物造成的細(xì)胞損傷有顯著保護(hù)作用，

3、其作用機(jī)制可能與抑制炎癥因子釋放有關(guān)。 關(guān)鍵詞 細(xì)顆粒物；炎性損傷；灰樹(shù)花多糖d組分；人肺支氣管上皮細(xì)胞 中圖分類(lèi)號(hào) r962 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 a 文章編號(hào) 1673-7210（2016）05（b）-0021-04 abstract objective to investigate the protective effect of grifola frondosa d fraction （d-fraction） on human bronchial epithelial （16hbe） cell damage that induced by fine particulate matter （srm

4、2786）. methods mtt assay was used to detect the survival rate of 16hbe cells treated with srm2786 or d-fraction， and the concentration of srm2786 or d-fraction used for further experiments was selected. 16hbe cells were divided into seven groups， including control group， model group （125 g/ml srm 27

5、86）， d-fraction group （125 g/ml srm 2786+12.5 or 25 or 50 or 100 or 200 g/ml d-fraction）. mtt assay was used to detect the survival rate， and enzyme-linked immune kits were used to detect the release of interleukin-1 （il-1）， interleukin-6 （il-6）， tumor necrosis factor- （tnf-） and granulocyte-macroph

6、age colony-stimulating factor （gm-csf）. results compared with the control group， the cell survival rates of 16hbe cells treated with srm 2786 （31.25-500 g/ml） were decreased remarkably （p 0.05）. treatment with 125 g/ml srm 2786 could significantly increase the release of il-1， il-6， tnf- and gm-csf

7、（p 0.05）. d-fraction （100 g/ml） could not only significantly improve the survival rate， but also significantly inhibit the release of inflammatory cytokines （p 0.01）. conclusion fine particulate matter can inhibit cell proliferation and induce the release of inflammatory cytokines. d-fraction has a

8、significant protective effect of cell damage caused by fine particulate matter， and the mechanism may be related to inhibit the release of inflammatory factors. key words fine particulate matter； inflammation damage； grifola frondosa d-fraction； human lung bronchial epithelial cells 細(xì)顆粒物（fine partic

9、late matter，空氣動(dòng)力學(xué)直徑2.5 m的顆粒）是霧霾中的首要污染物1，不易被鼻腔絨毛阻擋，能抵達(dá)細(xì)支氣管壁，引發(fā)哮喘、支氣管炎和心血管病等疾病2。細(xì)顆粒物濃度每增加10 g/m3，總死亡風(fēng)險(xiǎn)會(huì)上升4%，心肺疾病死亡風(fēng)險(xiǎn)上升6%，肺癌死亡風(fēng)險(xiǎn)上升8%3。 細(xì)顆粒物通過(guò)刺激肺泡巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞，誘發(fā)炎癥導(dǎo)致呼吸道局部免疫力下降和肺上皮細(xì)胞纖維化4。veronesi等5發(fā)現(xiàn)細(xì)顆粒物使人支氣管上皮細(xì)胞中ca2+升高，白介素-6（il-6）、腫瘤壞死因子-（tnf-）和白介素-8（il-8）等釋放增多，推測(cè)細(xì)顆粒物中的酸性可溶成分通過(guò)辣椒素和ph敏感受體途徑刺激細(xì)胞因子釋放。此外，細(xì)顆

10、粒物通過(guò)刺激血小板生長(zhǎng)因子與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生，引起氣道壁纖維組織增厚，導(dǎo)致增生性炎癥發(fā)生6。 灰樹(shù)花（grifola frondosa）是一種藥食兼用珍稀真菌。自20世紀(jì)80年代始，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從灰樹(shù)花子實(shí)體和菌絲體中提取了幾十種活性多糖，包括d-組分、md-組分、x-組分等7。其中d-組分（d-fraction）是1984年日本學(xué)者nanba提取的酸不溶性組分，含有以-（1-6）結(jié)合為主鏈、-（1-3）結(jié)合為側(cè)鏈的葡聚糖和以-（1-3）結(jié)合為主鏈、-（1-6）結(jié)合為側(cè)鏈的葡聚糖。d-fraction不僅能增強(qiáng)正常小鼠免疫功能8，還能通過(guò)提高免疫功能抑制腫瘤生長(zhǎng)9。然而，d-fraction是

11、否對(duì)細(xì)顆粒物引起的支氣管上皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究d-fraction對(duì)細(xì)顆粒物誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞（16hbe）損傷的保護(hù)作用，為細(xì)顆粒物的毒性機(jī)制研究以及新功能食品的開(kāi)發(fā)等提供科學(xué)依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 試劑 rpmi-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fbs）、0.25%胰蛋白酶和青鏈霉素購(gòu)自gibco公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（mtt）購(gòu)自sigma公司；il-1、il-6、tnf-和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子（gm-csf） 酶聯(lián)免疫（elisa）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)biosource公司；d-fraction購(gòu)自美國(guó)mu

12、shroom wisdom公司；其余試劑均為分析純。 1.2 細(xì)胞系 16hbe細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)，用完全培養(yǎng)基（含10% fbs和100 u青鏈霉素的rpmi-1640培養(yǎng)基）于37、5%co2培養(yǎng)。 1.3 細(xì)顆粒物懸液制備 細(xì)顆粒物成分復(fù)雜，且隨著季節(jié)不斷變化，對(duì)肺細(xì)胞損傷的程度和機(jī)制也不同10，本實(shí)驗(yàn)選用的細(xì)顆粒物為美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所提供的標(biāo)準(zhǔn)品srm 2786，其成分分析報(bào)告可在官網(wǎng)查詢(xún)11。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)顆粒物懸液均為現(xiàn)用現(xiàn)配，將srm 2786用完全培養(yǎng)基配成2000 g/ml的儲(chǔ)存液，超聲振蕩混勻后用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。 1.4 細(xì)胞分組 實(shí)驗(yàn)一中16

13、hbe細(xì)胞分6組，分別加入不同濃度的srm 2786（0、31.25、62.5、125、250、500 g/ml），細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中srm 2786濃度。實(shí)驗(yàn)二中16hbe細(xì)胞分10組，分別加入不同濃度的d-fraction（0、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 g/ml），確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中d-fraction濃度。實(shí)驗(yàn)三中16hbe細(xì)胞分7組，分別為對(duì)照組、模型組（125 g/ml srm 2786）和不同濃度d-fraction給藥組（分別給予12.5、25、50、100、200 g/ml d-fraction，同時(shí)給予1

14、25 g/ml srm 2786），細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞存活率，elisa檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中il-1、il-6、tnf-和gm-csf的含量。 1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 16hbe細(xì)胞消化后接種于96孔板中，細(xì)胞密度為1104個(gè)/孔，37培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度處理物質(zhì)，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)立無(wú)藥對(duì)照孔和無(wú)細(xì)胞空白孔，37繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清，每孔加入90 l完全培養(yǎng)基和10 l mtt溶液（5 g/l），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入150 l二甲基亞砜，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值（a），按下面公式計(jì)算細(xì)胞存活率t/c（%）：t/c（%）=（a樣品組-a空白組）/（a對(duì)

15、照組-a空白組）100% 1.6 細(xì)胞因子含量測(cè)定 elisa試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中il-6、il-1、tnf-和gm-csf含量。16hbe細(xì)胞消化后接種于24孔板中，細(xì)胞密度為1105個(gè)/孔，37培養(yǎng)24 h。分別加入不同濃度處理物質(zhì)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)立無(wú)藥對(duì)照孔，37繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子含量。 1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件spss 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，各組之間進(jìn)行單因素方差分析，以p 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 srm 2786對(duì)16hbe細(xì)胞

16、增殖的影響 與對(duì)照組比較，31.25 g/ml srm 2786處理組細(xì)胞存活率顯著降低（p 0.05），62.5500 g/ml srm 2786處理組細(xì)胞存活率極顯著降低（p 0.05），在100400 g/ml范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較顯著增加（p 0.01），表明高濃度d-fraction（100 g/ml）能顯著促進(jìn)16hbe細(xì)胞增殖。見(jiàn)表2。 2.3 d-fraction對(duì)srm2786損傷的16hbe細(xì)胞增殖的影響 d-fraction對(duì)srm2786造成的細(xì)胞損傷有一定保護(hù)作用，d-fraction濃度在25200 g/ml范圍內(nèi)，隨著d-fraction濃度的升高，細(xì)胞存

17、活率逐漸升高。見(jiàn)表3。 2.4 d-fraction對(duì)srm2786損傷的16hbe細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的影響 與對(duì)照組比較，125 g/ml的srm2786作用24 h后，16hbe細(xì)胞培養(yǎng)液中4種炎癥因子含量均顯著升高（p 0.01）。d-fraction對(duì)srm2786造成的炎癥細(xì)胞釋放有明顯抑制作用，高濃度（100、200 g/ml）d-fraction共處理組4種炎癥因子均顯著降低（p 0.01）。見(jiàn)表4。 3 討論 流行病學(xué)調(diào)查顯示細(xì)顆粒物的濃度與心肺系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率存在密切關(guān)聯(lián)3。體外實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)顆粒物能導(dǎo)致肺巨噬細(xì)胞凋亡12，顯著抑制人肺成纖維細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞dna損傷1

18、3。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)顆粒物srm 2786能顯著抑制16hbe細(xì)胞增殖，細(xì)胞存活率隨著細(xì)顆粒物濃度增加而降低，與前期研究結(jié)果一致12-13。 近年研究表明，d-fraction具有抗腫瘤及改善免疫功能的作用15，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高濃度d-fraction（100 g/ml）對(duì)16hbe細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，還能顯著提高細(xì)顆粒物損傷細(xì)胞的存活率，表明d-fraction對(duì)細(xì)顆粒物造成的細(xì)胞損傷有顯著保護(hù)作用。 顆粒物過(guò)度沉積對(duì)呼吸道產(chǎn)生刺激，使il-1、il-6釋放增加，進(jìn)而引起炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)，顆粒物可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)相關(guān)黏附分子，促進(jìn)炎性細(xì)胞聚集，進(jìn)一步加強(qiáng)呼吸系統(tǒng)炎性反應(yīng)

19、15-16。邵國(guó)軍等17研究顯示大鼠長(zhǎng)期暴露于顆粒物環(huán)境后呼吸系統(tǒng)粘膜出現(xiàn)水腫、增生并有大量炎癥細(xì)胞滲入，肺巨噬細(xì)胞能會(huì)通過(guò)分泌il-6、tnf-等吸引更多炎癥細(xì)胞向顆粒物引起的炎癥部位聚集。本研究結(jié)果顯示，125 g/ml細(xì)顆粒物刺激可使16hbe細(xì)胞il-1、il-6、tnf-和gm-csf合成釋放增加，表明細(xì)顆粒物對(duì)機(jī)體具有潛在炎性損傷毒性。d-fraction與細(xì)顆粒物共處理對(duì)細(xì)顆粒物造成的炎癥細(xì)胞因子釋放有明顯抑制作用，其中高濃度（100、200 g/ml）d-fraction組4種炎癥細(xì)胞因子均顯著降低（p 0.01），進(jìn)一步表明d-fraction是通過(guò)降低細(xì)顆粒物對(duì)16hbe細(xì)

20、胞造成的炎性損傷而起到保護(hù)作用的。 綜上所述，細(xì)顆粒物刺激可使人支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞存活率降低，il-1、il-6、tnf-和gm-csf4種炎癥細(xì)胞因子釋放增加，d-fraction與對(duì)細(xì)顆粒物造成的炎癥細(xì)胞因子釋放具有明顯的抑制作用，能顯著提高損傷細(xì)胞的存活率，表明d-fraction對(duì)細(xì)顆粒物造成的細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制炎癥因子表達(dá)釋放有關(guān)，為灰樹(shù)花多糖在細(xì)顆粒物損傷防治研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 參考文獻(xiàn) 1 cao c，jiang w，wang b，et al. inhalable microorganisms in beijings pm2.5 and pm10 p

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