丹參酮ⅡA對過氧化氫損傷心肌細(xì)胞的保護作用及機制研究

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減丹參酮 A對過氧化氫損傷心肌細(xì)胞的保護作用及機制研究（作者：單位：郵編：）作者：楊萍，李杰，周鳳華，李麗君，賈鈺華【摘要】 目的觀察丹參酮H A對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保 護作用及其機制。方法采用差數(shù)貼壁法體外分離培養(yǎng)新生乳鼠心肌細(xì) 胞，以200 gol/L過氧化氫作用2 h模擬心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型， 分別以丹參酮H A高、中、低劑量在造模前干預(yù) 24 h。采用MTT法 檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀 Ann exin V-PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率， 檢測心肌細(xì)胞總抗氧化能力（T-AOC ）、LDH活性、MDA含量、SOD 活力、GSH-Px活力、CAT活力

2、。結(jié)果模型組心肌細(xì)胞經(jīng)200 呵ol/L 過氧化氫作用2h后，細(xì)胞活力顯著降低，凋亡率顯著增高。與模型 組比較，丹參酮HA顯著增加心肌細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率。過氧 化氫可導(dǎo)致心肌細(xì)胞LDH活性及MDA含量顯著增加，并使總抗氧 化能力（T-AOC）、SOD活力、GSH-Px活力、CAT活力顯著降低， 丹參酮HA可呈濃度依賴性顯著降低LDH活性及MDA含量，增加總 抗氧化能力（T-AOC）、SOD活力、GSH-Px活力、CAT活力。結(jié) 論丹參酮HA可以抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，這可能與其增 強細(xì)胞抗氧化酶活力，降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】丹參酮HA ；心肌細(xì)胞；氧化應(yīng)激ChinaAb

3、stract : ObjectiveTo study the protective effect and mecha nism of TanshinoneHA on myocardial damage in duced byhydroge nperoxide.MethodsPrimary culturedneon ateratmyocardial cell was cultured in medium with 200 呵ol/L hydroge n peroxide, and the medium was supplemented with different concentrations

4、of Tanshinone HA in advanee. Cell viability was determined by MTT method. Annexin V/PI bivariate dyeing was used to detect apoptosis rate. Besides, T-AOC, LDH, MDA, SOD, GSH-Px, CAT were detected to evaluate cell an tioxida nt ability.ResultsIn model group, cell viability decreased significantly and

5、 apoptosis rate rose sig ni fica ntly compared with no rmal group. Compared with model group, Tanshinone HA in creased cell viability and decreased apoptosis rate in a dose-depe ndent manner. Compared with no rmal group, LDH and MDA in creased remarkably, and T-AOC, SOD, GSH-Px, CAT were dropped rem

6、arkably in model group. Compared with model group, TanshinoneHAdecreased LDH and MDA sig nifica ntly ,and in creased T-AOC, SOD, GSH-Px, CAT sig nifica ntly in a dose-depe ndent manner.ConclusionTanshinoneH A can reduce myocardial damage in duced by hydroge n peroxide, the mecha nism may be related

7、with the enhancement antioxidase activity, and decrease of lipid peroxidati on.Key words : Tanshinone HA; Myocardial cell; Oxidative stress隨著冠狀動脈內(nèi)溶栓、冠脈球囊擴張及冠脈搭橋等內(nèi)外科 治療缺血性心臟病手段的廣泛應(yīng)用，在恢復(fù)缺血心肌的再灌注挽救缺 血心肌的同時，缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion, I/R)損傷所帶來 的問題日益明顯1 。許多實驗研究已證明，在心肌損傷區(qū)有大量自 由基產(chǎn)生，自由基產(chǎn)生的氧化損傷是心肌損傷的重要因素，而

8、應(yīng)用自由基清除劑可以減輕組織細(xì)胞的損傷2。丹參是我國的傳統(tǒng)中藥， 被廣泛用于冠心病的治療。丹參酮H A (tanshinone H,TSN )是丹參最 重要的生物活性部分3。本實驗以體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞為基礎(chǔ)， 以H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷為模型，旨在研究丹參酮H A在氧化應(yīng)激條件 下對心肌細(xì)胞的保護作用，探討其可能的作用機制，闡釋丹參治療心 肌缺血性疾病的機理。1材料1.1動物出生13 d雄性Wistar大鼠，SPF級，購自南方醫(yī) 科大學(xué)實驗動物中心，合格證號 SCXK粵-20060015。1.2藥品與試劑胎牛血清購自杭州四季青生物工程研究所；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基購于Gibico公司；丹參酮

9、HA購于中國藥品生物制品檢定所(批 號110766-200417 );乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒、丙二醛(MDA) 測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物 酶(GSH-Px )、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC) 測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡 檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。2方法2.1分組原代乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)分離、純化后進行實驗分組，分 為以下幾組：正常組：培養(yǎng)的正常心肌細(xì)胞培養(yǎng)；模型組：心肌 細(xì)胞培養(yǎng)液中添加200 gol/L H2O2作用2 h :丹參酮HA高劑量 組：心肌細(xì)胞用丹

10、參酮H A 1 X10-4mol/L培養(yǎng)24h后添加200 gol/L H2O2繼續(xù)作用2 h。丹參酮H A中劑量組：心肌細(xì)胞用丹參酮H A 5 X10-5mol/L培養(yǎng)24 h后添加200 呵ol/L H2O2繼續(xù)作用2 h。丹 參酮HA低劑量組：心肌細(xì)胞用丹參酮H A 1 X10-5mol/L培養(yǎng)24 h后 添加200 pmol/L H2O2繼續(xù)作用2 h。2.2新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)參照 Goldenberg等4 方法略加 改進。取出生13 d SD乳鼠，在75%酒精中浸泡8s后取出，固定 四肢。用無菌眼科剪剪開胸部，無菌眼科彎鑷取出心臟。迅速將心臟 放入裝有冷D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，

11、去除心房及心外膜的結(jié)締組織， 將心室剪開，洗凈殘血，反復(fù)洗3次。將心室肌在無菌培養(yǎng)皿側(cè)壁剪 碎成12 mm3的小組織塊。將小組織塊移入 50 ml塑料離心管中， 加入0.1 %胰蛋白酶5ml，37 C消化6 min。自然沉淀后去除第1次 上清，再加入5 ml胰蛋白酶于37C消化6 min后，輕輕吹打，自然沉淀后，取上清移入15 ml離心管中，加含血清培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心10 min，洗兩次。剩余沉淀繼續(xù)加胰蛋白酶消化，如此反 復(fù)消化710次直至組織塊完全消化。將離心所得沉淀用含15 %胎牛血清的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，在CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁1 h，去除非心肌細(xì)胞（主要是成纖

12、維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞）1h后輕輕吸出細(xì)胞 懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，將心肌細(xì)胞懸液均勻接種于 6孔板內(nèi)，置于二 氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。前48 h加入終濃度為0.1 mmol/L的5-溴脫氧 尿苷，每24 h換液1次。2.3心肌細(xì)胞活力檢測采用MTT比色法測定心肌細(xì)胞活力。心肌細(xì)胞懸液以1.5 X104/ml接種于96孔板。分組處理后，每孔加入 20 MTT （5 mg/ml），在培養(yǎng)箱中37C孵育4 h。吸去上清，每孔 加入DMSO 150 “。微孔振蕩器上振蕩10 min。酶標(biāo)儀檢測570 nm 波長的吸光度值。每孔OD值減去空白孔OD值為測試孔OD值。活 細(xì)胞數(shù)與OD值成正比。每組每個時間點設(shè) 6個復(fù)

13、孔，取其平均值。2.4心肌細(xì)胞凋亡吸出培養(yǎng)液，D-Hanks洗細(xì)胞3次，5 min/ 次。向培養(yǎng)瓶中加入23 ml 0.125 %胰蛋白酶（使用前應(yīng)預(yù)熱至37 C 左右），鏡下觀察細(xì)胞，待其變圓，細(xì)胞間分離但尚未脫落時倒去胰 酶，加入原培養(yǎng)液終止消化，吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn) 移至離心管，1 000 r/min離心5 min，力口 PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞 濃度為1 X06/ml，取0.5 ml上述細(xì)胞懸液，1 000 r/min 4 min離心， 棄上清，加0.5 ml Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入1山熒光標(biāo)記的 Aa nn ex in V試劑，混勻后避光室溫下孵育

14、20 min。加入5 PI混勻 后避光4C下孵育5 min，孵育后加入500 gl Binding Buffer，立即上流式細(xì)胞儀分析，激發(fā)波長 Ex=488 nm;發(fā)射波長Em=530 nm。2.5總抗氧化能力及氧化平衡體系酶測定采用比色法測定總抗氧化能力（T-AOC），采用2,4-二硝基苯 肼顯色法檢測LDH活性，硫代巴比妥酸法測定 MDA含量，黃嘌呤 氧化酶法測定SOD活力，二硫代二硝基苯甲酸法測定 GSH-Px含量, 鉬酸銨法測定CAT活力。具體操作步驟參照試劑盒說明書。2.6統(tǒng)計分析計量數(shù)據(jù)以均士 s表示，采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件進行分析。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（On

15、e Way ANOVA）處理，組間兩兩比較采用LSD法。檢驗顯著性水準(zhǔn)a= 0.05。3結(jié)果3.1丹參酮HA對過氧化氫所致心肌細(xì)胞損傷的細(xì)胞活力與細(xì)胞凋亡的影響與正常組比較，模型組心肌細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋 亡率則顯著增加；在改善細(xì)胞活力方面，丹參酮H A高劑量組細(xì)胞活 力較模型組顯著增高，而丹參酮HA中劑量、低劑量 與模型組比較無 統(tǒng)計學(xué)差異。在改善細(xì)胞凋亡率方面，丹參酮H A各劑量組細(xì)胞凋亡 率均顯著低于模型組，中劑量與低劑量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果見表 1。表1丹參酮HA對過氧化氫所致心肌細(xì)胞損傷細(xì)胞活力及細(xì)胞凋 亡率的影響（略）3.2丹參酮HA對過氧化氫所致心肌細(xì)胞損傷抗氧化能力的影

16、響與正常對照組比較，模型組心肌細(xì)胞總抗氧化能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性顯著降低，而LDH活性、MDA含量則顯著 增加；丹參酮H A可呈劑量依賴性增加總抗氧化能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性，降低LDH活性、MDA含量。結(jié)果見表2。 表2丹參酮HA對過氧化氫所致心肌細(xì)胞損傷抗氧化能力4討論在I/R時可產(chǎn)生大量的活性氧自由基，是I/R介導(dǎo)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和 功能代謝障礙的重要途徑之一 5。許多實驗研究已證明心肌缺血再 灌注損傷不僅引起細(xì)胞壞死，而且也誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡6 。心肌細(xì)胞的 過度凋亡會導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量的減少以及心肌結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙。 本研究結(jié)果顯示，外源性H2O2

17、 200呵ol/L可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞活力顯 著降低，凋亡發(fā)生率顯著增高。氧自由基損害細(xì)胞主要表現(xiàn)在可使許 多生物大分子如核酸、蛋白、脂肪酸引起過氧化反應(yīng)，使生物大分子 出現(xiàn)交聯(lián)或者斷裂，從而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞。MDA是不飽和脂肪酸氧化的終產(chǎn)物，其水平的高低可反映機體脂質(zhì)過氧化的程 度。因此，測定MDA水平可間接反映出細(xì)胞受氧化損傷程度，是反 映氧化應(yīng)激較好的指標(biāo)7。自由基激發(fā)的脂質(zhì)過氧化物可以導(dǎo)致質(zhì) 膜損傷，LDH漏出率能較準(zhǔn)確地證明包膜的完整性8。在本研究 中，體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞在 H2O2誘導(dǎo)的損傷時，MDA含量顯著增 高，表明心肌細(xì)胞在H2O2作用下產(chǎn)生了大量的脂質(zhì)過氧化物。同時,

18、細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，膜內(nèi) LDH可透過細(xì)胞膜釋放到培養(yǎng)液中， 使培養(yǎng)液中LDH水平顯著升高。機體的氧化應(yīng)激是由于氧自由基過量生成與自由基清除系統(tǒng)的平衡狀態(tài)被破壞，導(dǎo)致氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集，從而對細(xì)胞產(chǎn)生多種毒性作用的病理狀態(tài)。超氧陰離子自由基(02-)、羥基自由基(0H)、過氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(102)等是體內(nèi)主要 的活性氧(reactive oxygen species ,ROS )。體內(nèi)ROS的增多可導(dǎo) 致膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化、膜脆性增加、流動性降低9SOD、GSH-Px、 CAT是體內(nèi)有效的自由基清除劑，它們的催化活性對維持氧化平衡 系統(tǒng)是非常重要的10，11。SOD

19、是一類金屬酶，能催化-1價O2 歧化(還原)成H2O2，在防御氧毒性中起著重要作用，SOD活力下降 可能是因為消除過多產(chǎn)生的 O-2 所致CAT可催化H2O2分解， GSH-Px可清除H2O2，阻斷脂質(zhì)過氧化的鏈鎖反應(yīng)，保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整。CAT和GSH-Px降低可能是清除過多的H2O2弓I起 的。另外，SOD在消除O-2 時產(chǎn)生的H2O2進一步再被CAT和 GSH-Px消除12，這也可能是CAT和GSH-Px降低的原因之一。 T-AOC是在整體水平上反映機體或細(xì)胞抗氧化水平高低的重要指標(biāo)。在本研究中，模型組 T-AOC、SOD活性、CAT活性、GSH-Px 含量顯著降低，表明外源性H2

20、O2可導(dǎo)致心肌細(xì)胞抗氧化防御機制受 損。丹參酮HA是我國的傳統(tǒng)中藥丹參重要的心血管活性成分，且具有抗缺血、改善微循環(huán)作用13 在本實驗?zāi)M的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，丹參酮H A可增加心肌細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率。本實驗通過檢測心肌細(xì)胞經(jīng)丹參酮H A干預(yù)后的MDA含量、LDH活 性、T-AOC , SOD活性、CAT活性、GSH-Px含量的水平，發(fā)現(xiàn)丹 參酮HA可呈濃度依賴性增加心肌細(xì)胞 T-AOC、SOD活性、CAT活 性、GSH-Px含量，而MDA含量、LDH活性則呈濃度依賴性顯著降 低。本實驗結(jié)果表明，丹參酮H A可提高心肌細(xì)胞對氧自由基的清除 能力，降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而減輕氧自由基介

21、導(dǎo)的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與 功能的損傷，以實現(xiàn)其對心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)的保護作用。因此，在再灌注或恢復(fù)供氧早期給予丹參對于減輕心肌細(xì)胞損傷有著重要 的意義?！緟⒖嘉墨I】1 Sch fer U, Kurz T, Jain D, et al.lmpaired coronary flowand left ventricular dysfunction after mechanical recanalization in acute myocardial infarction: role of neurohumoral activationJ .Basic Res Cardiol,2002,97(5):399

22、.2 Sun Y. Oxidative stress and cardiac repair/remodeling following infarction J . Am. J Med Sci., 2007,334:197.:3王舉濤,彭代銀,劉金旗，等.不同產(chǎn)地丹參中丹參酮H A的含量比較J.中國實驗方劑學(xué)雜志,2008,14(3):4.4 Golde nberg I, Shain berg A, Jacobs on KA, et al. Ade nosine protects aga inst an giote nsin II-i nduced apoptosis in rat cardio

23、cyte cultures J .Mol Cell Biochem,2003,252(1):133.5 Bog nar 乙 Kalai T, Palfi A, et al. A novel SOD-mimetic permeability tran siti on in hibitor age nt protects ischemic heart by inhibiting both apoptotic and necrotic cell death J .Free Radic Biol Med, 2006,41(5): 835.6 Sodha NR, Clements RT, Feng J, et al.The effects of therapeutic sulfide on myocardial apoptosis in resp onse to ischemia-reperfusi on injury J .Eur J Cardiothorac Surg,2008,33(5):906.7 Sehirli O, Tozan A, Omurtag GZ, et al.Protective effect of resveratrol against naphthalene-ind