-內(nèi)酰胺酶的分類及檢測ppt課件

1、蔣曉飛蔣曉飛復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心l表表2 -內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)和功能分類內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)和功能分類l分子結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu) 功能功能 舉例舉例 最適底物最適底物 抑制劑抑制劑l(Ambler) (Bush) PEN CARB OX CR CTX ATM IPM CLAV CLOX EDTAl絲氨酸酶絲氨酸酶l A 2a PC1，LEN-1 卅卅 十十 土土 卄卄 l 2b SHV-1,TEM-1 卅卅 十十 十十 卄卄 卄卄 l 2be K1,TEM-3, 卅卅 十十 十十 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 l SHV-2,PER-1l 2br TEM-31 卅卅 十十

2、十十 十十 l 2C PSE-1,BRO-1 卄卄 卅卅 十十 十十 十十 l 2e 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 l 2f Sme-1,NMC-A 卄卄 十十 ? 十十 十十 卄卄 卄卄 十十 l IMI-1 lC 1 AmpC 卄卄 十十 卅卅 十十 卄卄 lD 2d OXA-1 卄卄 十十 卅卅 十十 V l未定未定 4 AVS-1 卄卄 卄卄 卄卄 V V l 金屬酶金屬酶lB 3 IMP-1 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄l 嗜麥芽嗜麥芽L-1l Bush-J-M分類策略 3組金屬酶 頭孢菌素酶 1組 酶EDTA 2e組 2a組 2d組 青霉素 酶 2c 組 2f組

3、非金屬酶 4 組 2be 組 廣譜酶 2b 2br組小結(jié)小結(jié)1組酶：頭孢菌酶組酶：頭孢菌酶 ，優(yōu)先水解底物是頭孢菌素，它們水解青霉素的，優(yōu)先水解底物是頭孢菌素，它們水解青霉素的的速率低于水解頭孢噻啶的速率的的速率低于水解頭孢噻啶的速率的30%，對三代頭孢菌素和頭霉烯，對三代頭孢菌素和頭霉烯耐藥，但對碳青酶烯和四代頭孢菌素較為敏感，對酶抑制劑克拉維耐藥，但對碳青酶烯和四代頭孢菌素較為敏感，對酶抑制劑克拉維酸和酸和EDTA均不敏感，可被氯唑西林抑制均不敏感，可被氯唑西林抑制 2組酶：優(yōu)先水解青霉素類抗生素，其中水解頭孢噻啶的速率低于組酶：優(yōu)先水解青霉素類抗生素，其中水解頭孢噻啶的速率低于水解青霉素

4、的速率的水解青霉素的速率的30%者為青霉素酶者為青霉素酶 ，又分為，又分為2a、2b、2c、2d、2e和和2 f亞組。亞組。3組酶：又稱金屬酶，能滅活青霉素類、頭孢菌素類和碳青酶烯類組酶：又稱金屬酶，能滅活青霉素類、頭孢菌素類和碳青酶烯類抗生素，但對安曲南敏感；酶活性可被抗生素，但對安曲南敏感；酶活性可被EDTA抑制，但酶抑制劑克抑制，但酶抑制劑克拉維酸和氯唑西林對它無作用拉維酸和氯唑西林對它無作用 。4組酶：是染色體介導(dǎo)的耐抑制劑的青霉素酶，對頭孢類抗生素的組酶：是染色體介導(dǎo)的耐抑制劑的青霉素酶，對頭孢類抗生素的敏感性不定，對氨曲南和碳青霉烯敏感。敏感性不定，對氨曲南和碳青霉烯敏感。 A類類

5、-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶1。 A類類-內(nèi)酰胺酶：內(nèi)酰胺酶： 廣譜酶廣譜酶2b組組ABA 大腸埃希菌TEM-1型酶結(jié)構(gòu) ；B 肺炎克雷伯菌的SHV-1型酶結(jié)構(gòu) 超廣譜超廣譜-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶(2be) 經(jīng)典超廣譜經(jīng)典超廣譜-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶 TEM型型ESBLs SHV型型ESBLs SHV-2型型ESBLs 、SHV-5 型型ESBLs SHV環(huán)突變型環(huán)突變型ESBLs 其他超廣譜其他超廣譜-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶 CTX-M-型酶型酶 可為分可為分4個(gè)小組個(gè)小組 PER-1及其相關(guān)及其相關(guān)ESBL PER-1、-2 、VEB-1、2 CME-1 TLA-1 特殊的非典型特殊的非典型ESBL SFO-1

6、、GES-1 TEM型型ESBLs1Glu140Lys和Glu240Lys替換 ：對頭孢他啶和氨曲南 耐藥2Arg164Ser或His ：對頭孢他啶耐藥 ，對頭孢噻肟敏感 3Gly238Ser：主要提高了對頭孢噻肟的水解能力如TEM-19 )SHV型型ESBLs1. SHV-2型ESBLs： Gly238Ser，主要提高水解頭孢噻肟的能力2. SHV-5型ESBLs ：同時(shí)具有Gly238Ser和Glu240Lys突變3. SHV環(huán)突變型ESBLs：Asp179Ala 、Arg A類類-內(nèi)酰胺酶與內(nèi)酰胺酶與B類、類、C類和類和D類酶的同源性比較類酶的同源性比較B類類-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶 又稱金屬

7、又稱金屬-內(nèi)酰胺酶，內(nèi)酰胺酶，Bush功能分類中屬功能分類中屬于于3組酶，能滅活青霉素類、頭孢菌素類和組酶，能滅活青霉素類、頭孢菌素類和碳青酶烯類抗生素，但對安曲南敏感；酶碳青酶烯類抗生素，但對安曲南敏感；酶活性可被活性可被EDTA抑制，但酶抑制劑克拉維抑制，但酶抑制劑克拉維酸和氯唑西林對它無作用酸和氯唑西林對它無作用 。金屬酶的功能亞分類金屬酶的功能亞分類 ：3a、3b、3c金屬酶的分子生物學(xué)亞型分類金屬酶的分子生物學(xué)亞型分類 :B1、B2、B3 亞分類 物學(xué)亞類 酶的型別 宿主 發(fā)現(xiàn)國家 發(fā)現(xiàn)時(shí)間 分子量 等電點(diǎn) 3a B1 CcrA3 脆弱擬桿菌 美國 1994 26 未測3a B1 C

8、crA4 脆弱擬桿菌 美國 1994 26 未測3a B1 CcrA 脆弱擬桿菌 美國 1986 26 5.23a B1 PCM-1 洋蔥假單胞菌 未知 1994 未測 8.53a B1 IMP-1 銅綠假單胞菌 日本 1991 28 9.0 3a B1 IMP-2 不動(dòng)桿菌屬 意大利 2019 26 8.1 3a B1 IMP-3 銅綠假單胞菌 日本 2000 3a B1 IMP-4 不動(dòng)桿菌屬 香港 2019 8.0 楊氏枸櫞酸桿菌 中國 2019 未測 未測 3a B1 IMP-6 粘質(zhì)沙雷菌 日本 2019 未測 未測 3a B1 IMP-7 銅綠假單胞菌 加拿大 2019 3a B1

9、 IMP-8 肺炎克雷伯菌 中國臺(tái)灣 2019 未測 8.2 3a B1 VIM-1 銅綠假單胞菌 意大利 2019 5.3 3a B1 VIM-2 銅綠假單胞菌 法國 2000 未測 未測 3a B1 VIM-3 銅綠假單胞菌 臺(tái)灣 2000 未測 5.1 3b B2 CphA 嗜水氣單胞菌 意大利 1993 28 8.03b B2 A2h 嗜水氣單胞菌 美國 1990 28 8.03b B2 ACP 嗜水氣單胞菌 蘇格蘭 2019 31 8.23b B2 AsbM1 簡達(dá)氣單胞菌 美國 1990 34 9.13b B2 AsA-1 殺蛙氣單胞菌 蘇格蘭 1994 19 7.93b B2 I

10、mis 溫和氣單胞菌 英國 2019 未測 9.3c B2 戈氏軍團(tuán)菌 1986 25 10.53a B3 L1 嗜麥芽窄食單胞菌 日本 1982 118 6.9 B類類-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶 金屬酶的三維結(jié)構(gòu)圖 A：CcrA脆弱擬桿菌） B：Bc（蠟樣芽胞桿菌） C：L1嗜麥芽窄食單胞菌）園柱代表螺旋，板片代表片層 綠色數(shù)字為His殘基，蘭灰色數(shù)字為Asp殘基，橙色數(shù)字為Cys或Ser殘基。ABC獲得性金屬酶獲得性金屬酶 （1IMP型金屬酶型金屬酶 （2） VIM型金屬酶型金屬酶 -內(nèi)酰胺酶的檢測內(nèi)酰胺酶的檢測1酶蛋白性質(zhì)分析：包括表型分析和酶動(dòng)力酶蛋白性質(zhì)分析：包括表型分析和酶動(dòng)力學(xué)分析。學(xué)分

11、析。2基因分析：基因型別分類、測序、分析其基因分析：基因型別分類、測序、分析其結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控 基因?；颉?轉(zhuǎn)移性分析：分析酶編碼基因位于質(zhì)粒上轉(zhuǎn)移性分析：分析酶編碼基因位于質(zhì)粒上還是染色體上；還是染色體上； 在不在整合子中。在不在整合子中。 收集菌株 耐藥表型分析紙片藥敏試驗(yàn)和E-試驗(yàn)分析） 提取酶粗制品進(jìn)行三相水解試驗(yàn)、等電聚焦電泳和酶動(dòng)力學(xué)分析 根據(jù)結(jié)果判定酶的類群，選擇相應(yīng)PCR引物擴(kuò)增 陽性 陰性 整合子PCR初篩 陽性 陰性 鳥槍法克隆可表達(dá) -內(nèi)酰胺酶基因 測定PCR產(chǎn)物序列 PCR擴(kuò)增全 測定全克隆片段 可變區(qū)并測序 序列整合子檢查 提取質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn) 克隆并轉(zhuǎn)化到

12、DH5表達(dá)-內(nèi)酰胺酶 陽性 陰性 鈣轉(zhuǎn)或MgCl2或電轉(zhuǎn)化 （2耐藥表型分析：紙片藥敏試驗(yàn)和E-試驗(yàn)測定MICs（3酶性質(zhì)分析：提取酶粗提物進(jìn)行a.三相水解試驗(yàn)。b.等電聚焦電泳。C.酶動(dòng)力學(xué)分析。（4基因分析：a.PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物測序。b.PCR擴(kuò)增整合子全可變區(qū)，分析其中結(jié)構(gòu)和可能的-內(nèi)酰胺酶基因。C.鳥槍法克隆可表達(dá)的-內(nèi)酰胺酶基因，分析基因結(jié)構(gòu)。（4轉(zhuǎn)移性分析：A。質(zhì)粒：a.質(zhì)粒接合試驗(yàn)。b.轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：電轉(zhuǎn)化、鈣轉(zhuǎn)化或MgCl2轉(zhuǎn)化 B。整合子：a.PCR擴(kuò)增整合子全可變區(qū)及PCR產(chǎn)物序列測定。l1紙片法：l 表1 肺克、催娩克雷伯、大腸埃希菌ESBLs產(chǎn)株紙片法初篩和確證實(shí)驗(yàn)l

13、2 MIC法：l 表2 肺克、催娩克雷伯、大腸埃希菌ESBLs產(chǎn)株MIC法初篩和確證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)方法 初篩試驗(yàn) 表型確證試驗(yàn)培養(yǎng)基 MH MH 抗菌藥物濃度 頭孢泊肟 10g 或 頭孢他啶 30g 頭孢他啶 30g 或 頭孢他啶/克拉維酸 30/10g 氨曲南 30g 或 和 頭孢噻肟 30g 或 頭孢噻肟 30g 頭孢曲松 30g 頭孢噻肟/克拉維酸 30/10g （同時(shí)用多于一種抗生素可提高試驗(yàn)靈敏度） （確證試驗(yàn)要求同時(shí)做上述四種紙片） 孵育條件 同標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法 同標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法結(jié)果 頭孢泊肟抑菌圈 22mm 有一種抗生素出現(xiàn)加有克拉維酸紙片抑菌圈 頭孢他啶抑菌圈 22mm 沒有加克拉維酸紙

14、片抑菌圈5 mm=產(chǎn)ESBL氨曲南抑菌圈 27mm頭孢噻肟抑菌圈 27mm頭孢曲松抑菌圈 25mm=可疑產(chǎn)ESBL質(zhì)量控制 陰性對照 ATCC25922 陰 性對照 ATCC25922加有克拉維酸 （參考質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)） 沒有加克拉維酸抑菌圈 2mm 陽性對照 ATCC700603頭孢泊肟抑菌圈 9-16mm 頭孢他啶/克拉維酸抑菌圈 頭孢他啶抑菌圈 10-18mm 頭孢他啶抑菌圈5 mm氨曲南抑菌圈 9-17mm頭孢噻肟抑菌圈 17-25mm 頭孢噻肟/克拉維酸抑菌圈頭孢曲松抑菌圈 16-24mm 頭孢噻肟抑菌圈3 mm 驗(yàn)方法 初篩試驗(yàn) 表型確證試驗(yàn)培養(yǎng)基 CAMHB CAMHB 抗菌藥物濃度

15、頭孢泊肟 1g /mL或 頭孢他啶 0.25-128 g /mL 頭孢他啶 1g /mL或 頭孢他啶/克拉維酸 0.25/4-128/4g 氨曲南 1g /mL或 和 頭孢噻肟 1g /mL或 頭孢噻肟 0.25-64 g /mL 頭孢曲松 1g /mL 頭孢噻肟/克拉維酸 0.25/4-64/4g （同時(shí)用多于一種抗生素 （確證試驗(yàn)要求同時(shí)做上述 可提高試驗(yàn)靈敏度） 四種紙片） 孵育條件 同標(biāo)準(zhǔn)MIC法 同標(biāo)準(zhǔn)MIC法結(jié)果 生長=可疑產(chǎn)ESBL 有一種抗菌素生素出現(xiàn)加有克拉維酸 （例： MIC 2 g /mL） 的MIC沒有加克拉維酸的MIC 3個(gè)對 倍稀釋度 =產(chǎn)ESBL質(zhì)量控制 陰性對照

16、 ATCC25922 =無生長 陽性對照 ATCC700603 陽性對照 ATCC700603頭孢泊肟抑菌圈 2 g /mL 有一種抗菌素生素出現(xiàn)加有克拉維頭孢他啶抑菌圈 2 g /mL 的MIC沒有加克拉維酸的MIC 3個(gè)對 氨曲南抑菌圈 2 g /mL 倍稀釋度頭孢噻肟抑菌圈 2 g /mL 頭孢曲松抑菌圈 2 g /mL l1初篩試驗(yàn)l2 頭孢西丁三相水解試驗(yàn)l3 聯(lián)合用克拉維酸和氯唑西林兩種抑制 l 平行試驗(yàn)lAmpC酶的檢測酶的檢測l1 酶的提取酶的提取l 凍融法凍融法 超聲波破碎法超聲波破碎法l 1個(gè)菌落個(gè)菌落 1個(gè)菌落個(gè)菌落 l l種入種入12ml大豆湯。大豆湯。35度震搖度震搖4-6h 種入種入40ml大豆湯。大豆湯。35度震搖過度震搖過夜夜l l4度度40000rpm，離心，離心20min，去上清液，去上清液 4度度4000rpm，離心，離心20分鐘，去分鐘，去上清上清l l沉淀物沉淀物-890度反復(fù)凍溶度反復(fù)凍溶5次次 重懸在重懸在5mlpH7.0 的的.01MPBS中，中，l l加入加入1.5mlpH7.0的的0.01MPBS， 超