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1、2021-9-241第二章第二章 生化制藥技術(shù)工藝基礎(chǔ)生化制藥技術(shù)工藝基礎(chǔ)2021-9-242l天然生物材料制備生化藥物的過程大體為: 原料的選樣和預(yù)處理;原料的粉碎;提取,即從原料中經(jīng)溶劑分離有效成分,制成粗品的工藝過程;純化,即粗制品經(jīng)鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、吸附、層析、透析、超離心、膜分離、結(jié)晶等步驟進(jìn)行精制的工藝過程;干燥及保存;制劑,即原料藥經(jīng)精細(xì)加工制成片劑、針劑、凍干劑等供臨床應(yīng)用的各種劑型。2021-9-243l原料選擇的基本原則 要選擇有效成分含量高的新鮮材料; 來源豐富易得; 制造工藝簡單易行; 成本比較低; 經(jīng)濟(jì)效果要好。 2021-9-244l一、 機(jī)械法 粉碎少量原料時,
2、可使用高速組織搗碎機(jī)(10000rmin)、勻漿器、研缽等。工業(yè)生產(chǎn)上一般常用的粉碎設(shè)備有電磨機(jī)、球磨機(jī)、萬能粉碎機(jī),絞肉機(jī)、擊碎機(jī)等。 二 、物理法 1反復(fù)凍融法 ; 2冷熱交替法 ; 3超聲波處理法;4加壓破碎法 。 2021-9-245l三三 、生化和化學(xué)方法、生化和化學(xué)方法 1自溶法自溶法 2溶菌酶處理法溶菌酶處理法 3. 表面活性劑處理法表面活性劑處理法 2021-9-246l分固-液、液-液提取l提取條件的選擇:溶劑、PH值、溫度l影響提取的因素:被提取物質(zhì)溶解度的大小、 擴(kuò)散作用的影響、分配作用的影響l超臨界流體萃?。?2021-9-247 主要應(yīng)用的方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法
3、、pI沉淀法、膜分離法、層析法、凝膠過濾法、離子交換法等。一、鹽析法 1.鹽析及方法 利用不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中,溶解度不同程度的降低來進(jìn)行分離純化的方法。有Ks法和法。 2.特點(diǎn) 對設(shè)備和條件要求低,安全,應(yīng)用范圍廣泛。在高濃度鹽存在下,蛋白質(zhì)不易發(fā)生變化,一般可在室溫下進(jìn)行操作。 分辨率低, Ks法多用于提取液的前期分離工作。 2021-9-248l一、鹽析法 3.常用的中性鹽和加入方式 常用中性鹽有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸納、氯化鈉、磷酸鈉等。硫酸銨的鹽析能力強(qiáng),飽和溶液濃度大,溶解度受溫度影響小,一般不會使蛋白質(zhì)變性,缺點(diǎn)是緩沖能力差,pH常在4555之間。但價(jià)廉易得,分段分離效果也
4、比其他鹽類好。 加入方式:分步固體鹽或飽和溶液 2021-9-249l一、鹽析法 4.鹽析時應(yīng)注意的問題 (1) 鹽飽和度的影響;(2) pH的選擇; (3)蛋白質(zhì)濃度的影響;(4)溫度的影響; (5)鹽析沉淀物的脫鹽; 2021-9-2410l二、有機(jī)溶劑沉淀法 利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度差異而分離的方法,稱有機(jī)溶劑沉淀法。乙醇和丙酮是最常用的有機(jī)溶劑。 有機(jī)溶劑沉淀法比鹽析法分辨力強(qiáng),沉淀也好過濾,但對有些生物活性物質(zhì)能引起失活和變性。應(yīng)用時還應(yīng)注意防止溶劑揮發(fā)和火災(zāi)等。 2021-9-2411l有機(jī)溶劑沉淀時應(yīng)注意的問題 1 控制工藝過程的溫度; 2 防止溶劑局部濃度過
5、高; 3 及時處理沉淀物; 4 pH值的選擇; 5 比鹽析法條件嚴(yán)格; 2021-9-2412l三、等電點(diǎn)沉淀法 l等電點(diǎn): 2021-9-2413l三、等電點(diǎn)沉淀法 利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低,而各種蛋白質(zhì)又具有不同的等電點(diǎn)的特性進(jìn)行分離的工藝過程,稱等電點(diǎn)沉淀法。由于各種蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時,仍有一定的溶解度而沉淀不完全,多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)又都十分接近,所以單獨(dú)使用效果不理想,分辨力差,多用于提取后除雜蛋白,實(shí)際生產(chǎn)中常與有機(jī)溶劑沉淀法、鹽析法聯(lián)合使用。2021-9-2414l四、膜分離法 膜分離技術(shù)包括超濾、反滲透析、電滲析、微孔過濾、氣體滲析和超精密過濾等,其中超濾、反滲透析、微孔過濾
6、和超精密過濾在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用較為常見。1超濾 在液壓(氮?dú)饣蛘婵眨?qū)動下,分離粒子的范圍,一般為0001一001m(溶劑和小分子透過),適用于酶和蛋白質(zhì)類生化藥物的分離、濃縮、脫鹽、提純、除菌、除病毒和熱原等。 2021-9-2415l四、膜分離法 1超濾2021-9-2416l四、膜分離法 1超濾 參數(shù):膜(纖維素硝酸酯或醋酸酯、芳香酰胺纖維等);水的流速;相對分子質(zhì)量的截止值(截留分子量)。 超濾設(shè)備:管式、多層板式、卷式和中空纖維型等。國外發(fā)展較快的是一種內(nèi)壓式中空纖維型。 2021-9-2417l四、膜分離法 2.反滲透 溶劑從溶液濃度高的一側(cè)傳遞到濃度低的一側(cè),稱反滲透。 分離介質(zhì)
7、:高分子透過性薄膜 ; 設(shè)備:與超濾相仿 應(yīng)用:美國Millipore設(shè)計(jì)的反滲透裝置,已有100多套,生產(chǎn)符合美國藥典的純水或注射用水,還用于氨基酸、激素的濃縮等 2021-9-2418l四、膜分離法 3微孔濾膜 由高分子材料制成的薄膜過濾介質(zhì),可以過濾一般介質(zhì)不能截留的細(xì)菌和微粒。膜的微孔徑在02一l0m之間。過濾器有板式和管式兩種。廣泛應(yīng)用于濾除微粒和微生物,如濾除大輸液和水針劑中的污染微粒;還有熱敏性藥物的除菌,如胰島素、C0A、ATP、血清蛋白、丙種球蛋白、激素等。 2021-9-2419l四、膜分離法 4超精密過濾 以聚乙烯醇為主體的中空多孔濾膜,分級性能在超濾膜與微孔濾膜之間,為
8、00102m。用于水的精制(脫除鐵質(zhì)、菌和微粒)、循環(huán)水的凈化、除懸浮固體離子以及糖液、酶液的精制等。 2021-9-2420l五、離子交換法(離子交換層析 ) 1、基本原理 離子交換樹脂 :載體、功能團(tuán)、平衡離子 載體:樹脂(苯乙烯型、丙烯酸型、酚醛型)、 纖維素、葡聚糖凝膠。 功能團(tuán):磺酸根、磷酸根、羧基;季胺鹽、伯仲叔胺基;CM、DEAE等。 平衡離子:氫離子、鈉離子、氫氧根離子、2021-9-2421l五、離子交換法(離子交換層析 ) 2、樹脂種類 第一類 強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂; 第二類 弱酸性陽離子交換樹脂; 第三類 強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂 ; 第四類 弱堿性陰離子交換樹脂; 2021
9、-9-2422l五、離子交換法(離子交換層析 ) 3、影響交換速度的因素 2021-9-2423l五、離子交換法(離子交換層析 ) 3、影響交換速度的因素 樹脂顆粒大小、攪拌和流速、離子濃度、離子的水合半徑、酸堿性的強(qiáng)弱和溶液pH值、交聯(lián)度的大小、有機(jī)溶劑、交換容量。 2021-9-2424l五、離子交換法(離子交換層析 ) 4、離子交換操作方法(1)樹脂的選擇 當(dāng)目的物具有較強(qiáng)的堿性和酸性時,宜選用弱酸性和弱堿性的樹脂; 氨基酸多用強(qiáng)酸樹脂;蛋白質(zhì)、酶和其它生物大分子的分離多采用弱堿或弱酸性樹脂,以減少生物大分子的變性,有利于洗脫,并提高選擇性。 另外因素:孔徑、化學(xué)穩(wěn)定性、機(jī)械性能等202
10、1-9-2425l五、離子交換法(離子交換層析 ) 4、離子交換操作方法 (2)樹脂的處理和再生 (3)基本操作方法 操作方式:靜態(tài)和動態(tài) 洗脫方式:靜態(tài)和動態(tài);洗脫液分酸、堿、鹽、溶劑等。2021-9-2426l六、凝膠層析 定義:指混合物隨流動相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相的層析柱時,因其各種物質(zhì)分子大小不同而被分離的技術(shù)。又稱凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾等。也稱阻滯擴(kuò)散層析、排阻層析等。 特點(diǎn):設(shè)備簡單,操作方便,分離效果好,回收率高,分離條件緩和,不致引起生物活性物質(zhì)變性和失活,凝膠可重復(fù)使用無需繁復(fù)的再生處理。缺點(diǎn)是分離速度較慢。廣泛應(yīng)用于分離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶及多糖等生化物質(zhì)
11、。 2021-9-2427l六、凝膠層析 1基本原理 2021-9-2428l六、凝膠層析 2幾種常用凝膠 葡聚糖凝膠 (Sephadex G )是一種非離子型的無定形或稱珠狀顆粒物質(zhì),化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定,不溶于水、弱酸、堿和鹽溶液。含有少量的羧基,故對陽離子有輕微的吸附作用。 聚丙烯酰胺凝膠(生物凝膠P )在pH2一11范圍內(nèi)使用。它由碳碳骨架構(gòu)成,完全是惰性的,適宜作為凝膠層析的載體。缺點(diǎn)是不耐酸,遇酸時酰胺鍵會水解成羧基,使凝膠帶有一定的離子交換基團(tuán)。 2021-9-2429l六、凝膠層析 2幾種常用凝膠 瓊脂糖凝膠(瑞典sepharose美國稱BioGelA,英國稱Sagavac等。)是
12、一種天然凝膠,不是共價(jià)交聯(lián),是以氫鍵交聯(lián)的。不同孔隙程度是以改變瓊脂搪濃度而達(dá)到的?;瘜W(xué)穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。 疏 水 性 凝 膠 常 用 的 為 聚 甲 基 丙 烯 酸 酯(Polmethacrylate)凝膠或以二乙烯苯為交聯(lián)劑的聚苯乙烯凝膠(如Styroge1及BioBeadsS)。 2021-9-2430l六、凝膠層析 2幾種常用凝膠2021-9-2431l六、凝膠層析 3.影響凝膠層析的因素 (1)凝膠的選擇(考慮凝膠特性以及分離目的和樣品的性質(zhì)); (2)洗脫液流速(約在30200m1/h ); (3)離子強(qiáng)度和pH值; (4)分離液體積通常為凝膠床總體積的5-10; (5)柱的長
13、度和直徑(長徑之比通常為10:1或7:1 );(6)V0和Vi ( 裝填良好的柱,V0和Vi的值的比率應(yīng)為40%-60% )。 2021-9-2432l六、凝膠層析 4、凝膠層析的應(yīng)用(1)脫鹽;(2)分子量測定;(3)去熱原和分離純化;2021-9-2433l七、親合層析 1基本原理 定義:利用生物大分子的特異親和力而設(shè)計(jì)的層折技術(shù)。 特點(diǎn):從粗提液中,通過一次簡便處理便可獲得高純度的活性物質(zhì),既可分離一些生物材料中含量極微的物質(zhì),又能分離一些性質(zhì)十分相似的物質(zhì)。具有設(shè)備要求不高,操作簡便,適用范圍廣,特異性強(qiáng),分離速度快,效果好,條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。但親合吸附劑的通用性較差,洗脫條件較苛刻。
14、2021-9-2434七、親合層析1基本原理配基:可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)。載體:與配基結(jié)合的層析介質(zhì)。配體: 2021-9-2435l七、親合層析 2幾種常用載體 (1)瓊脂糖凝膠 Sepharose 2B、4B和6B(Pharmacia)和U1trogelsA一2,A4,A一6(LKB)。這類載體能使吸附物質(zhì)保持活性,能迅速活化并接上各種功能基團(tuán),結(jié)構(gòu)疏松孔徑大,流速快,非專一性吸附少; Sepharose CL是用2,3二溴丙烷處理的交聯(lián)瓊脂糖,它的穩(wěn)定性明顯增加,能在pH3一14中應(yīng)用,擴(kuò)大了親和柱制備時化學(xué)反應(yīng)選用的范圍,并能經(jīng)受比較劇烈的洗脫條件。 2021-9-2436l七、親合層析
15、 2幾種常用載體 其他的還有葡聚糖凝膠、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠 、多孔玻璃珠 等。 3. 配基 特殊配基:底物、抑制劑、輔因子(酶);抗原、病毒、細(xì)胞(抗體);互補(bǔ)的堿基順序、組蛋白、核酸聚合酶(核酸)。 通用配基:蛋白質(zhì)A- Sepharose CL-4B(IgG及其系列)、ConA- Sepharose (-D-呋喃葡萄糖、 -D-呋喃甘露醇)等。2021-9-2437l七、親合層析 4 影響吸附劑親和力的幾個因素 (1)配基濃度(配體濃度); (2)空間障礙(特別是親合力低或分子量大而配基為小分子); (3)配基與載體的結(jié)合位點(diǎn); (4)載體孔徑; (5)微環(huán)境 ; 5洗脫條件 2021
16、-9-2438l濃縮 手段:蒸發(fā)、沉淀 蒸發(fā)濃縮裝置:薄膜蒸發(fā)濃縮 、減壓蒸發(fā)濃縮 、吸收濃縮(最常用的吸收劑有聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、凝膠等 ) 等。2021-9-24392021-9-2440l結(jié)晶 一般生化藥物結(jié)晶的條件:純度 、濃度、pH 、溫度、時間以及晶種等。 2021-9-2441l干燥 干燥是從濕的固體生化藥物中除去水分或溶劑而獲得相對或絕對于燥制品的工藝過程。通常包括原料藥的干燥和制成的臨床制劑的干燥。 最常用的方法:常壓干燥、減壓干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等,其干燥設(shè)備主要有:廂式干燥器、真空干燥器、冷凍干燥器、管式氣流干燥器、沸騰干燥器、噴霧干燥器等等。 2021-9-2442l一、噴霧干燥 將液體通過噴射裝置噴成霧滴后,在一定流速的熱氣流中,迅速蒸發(fā)干燥的方法。實(shí)驗(yàn)表明:把含水量為80左右的1L溶液,噴成直
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