動物細胞培養(yǎng)生物反應器(可編輯)

1、動物細胞培養(yǎng)生物反應器 動物細胞培養(yǎng)生物反應器 隨著基因工程的發(fā)展,通過動物細胞的培養(yǎng)所生產出多種療效高的藥物、靈敏的診斷試劑及生物技術制品,目前在這一方向上正發(fā)展成為一支高新技術產業(yè)。由于動物細胞與微生物細胞有很大的差異,對體外培養(yǎng)有嚴格的要求,如動物細胞對剪切非常敏感,反應器的設計不能像微生物細胞那樣高的剪切力,因此,傳統(tǒng)的微生物細胞反應器應該經過改造才能適用動物生物反應器,根據(jù)動物細胞的特點,開發(fā)新型的生物反應器顯得十分重要和迫切。一、動物細胞培養(yǎng)過程 (一)動物細胞培養(yǎng)概論 動物細胞培養(yǎng)(cell culture)是從動物體內取出細胞并分散成單個細胞,模擬體內的生長環(huán)境,在無菌、適溫和

2、豐富的營養(yǎng)條件下,使細胞在體外繼續(xù)生存、生長、增殖并維持結構和功能的一門技術。體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)(primary culture,亦稱初代培養(yǎng))和傳代培養(yǎng)(subculture,亦稱繼代培養(yǎng))。原代培養(yǎng)是指從機體內取出的細胞進行初次培養(yǎng)的過程。培養(yǎng)的細胞大約增殖10代左右稱為原代細胞(primary cell);從原代培養(yǎng)的細胞繼續(xù)轉接培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。 動物細胞體外培養(yǎng)的歷史可追溯到1907年,美國生物學家哈里森h(huán)arrison在無菌條件下,以淋巴液為培養(yǎng)基成功地在試管中培養(yǎng)了蛙胚神經組織達數(shù)周,并觀察到細胞突起的生長過程,創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)法。1923年,法國學者卡勒爾設計的卡氏培養(yǎng)瓶

3、用于培養(yǎng)雞胚的心肌組織取得成功,也使得多種動物組織培養(yǎng)獲得成功。20世紀80年代以來,隨著基因工程技術和細胞融合技術的迅速發(fā)展,人們已經能夠把特定的外源基因通過pcr擴增,并轉染到動物細胞內,得到高質量的表達,由此可生產各種特殊的生物制品。德國生物技術公司hauser用一個含人的ifn-基因的科斯質粒pcosifn-nda(36000堿基對)與質粒phc792cos/tk+dna(含有單皰疹病毒的tk基因)通過磷酸鈣沉淀技術,共轉移進入小鼠lk-細胞,從而得到含干擾素基因的能分泌干擾素的細胞克隆。近年來發(fā)展起來的淋巴細胞雜交瘤技術,能大量繁殖并生產單克隆抗體,品種不下萬種,其中數(shù)百種已在醫(yī)學和

4、生物學的各個領域得到了廣泛的應用,使動物細胞培養(yǎng)進入了一個新的領域。到了90年代初期,世界單克隆抗體的銷售已超過30億美元,取得了明顯的社會效益和經濟效益。利用人工培養(yǎng)的動物細胞,可以分離和鑒定病毒,進行遺傳工程、代謝及其調節(jié)方面的研究,并能根據(jù)其表達產物方面的優(yōu)點(如轉錄后修飾和產物胞外分泌等),生產出許多與人類健康和生存密切相關的生物技術產品。因此,動物細胞培養(yǎng)工程正在逐步形成一支獨特的高新技術產業(yè),并顯示出巨大的工業(yè)發(fā)展前景。 動物細胞的體外培養(yǎng)有三種類型,一類是懸浮培養(yǎng),指細胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長的過程,主要用于非貼壁依賴性細胞,此類細胞體外生長不需貼壁,可采用微生物的方法在培養(yǎng)基中

5、懸浮培養(yǎng)。來源于血液、淋巴組織的細胞,許多腫瘤細胞(包括雜交瘤細胞)和許多重組細胞都屬于此類細胞。由于是懸浮生長,細胞密度一般都較高,易于大規(guī)模生產,便于過程的控制。另一類是貼壁培養(yǎng),指必須貼附在固體介質表面上生長的細胞培養(yǎng),主要適用于貼壁依賴型細胞(亦稱貼附型細胞),大多數(shù)動物細胞都屬于這一類型。這類細胞生長需要附著于某些帶適量正電荷的固體和半固體表面,細胞貼附生長后,不再是原有的形態(tài),形態(tài)上一般單一化,主要有成纖維細胞型、上皮型、游走型和多形型等。再有一類是固定化培養(yǎng),這類培養(yǎng)既適用于貼壁依賴性細胞,又適用于非貼壁依賴性細胞的包埋培養(yǎng)方式,具有細胞生長密度高、抗剪切力和抗污染能力強等優(yōu)點。

6、由于所培養(yǎng)的細胞的不同,固定化培養(yǎng)的方式也有所不同,一般對于貼壁依賴性細胞通常采用膠原包埋,而對于非貼壁依賴性細胞則常用海藻酸鈣包埋。常用的細胞固定化的方法主要有吸附、共價貼附、離子/共價交聯(lián)、包埋和微囊化等。 (二)動物細胞體外培養(yǎng)的特點 動物細胞屬于真核細胞,與細菌等原核細胞相比,其進化程度更高,結構和成分更復雜,功能也更全面。雖然動物細胞培養(yǎng)的基本原理和微生物細胞相同,但動物細胞對營養(yǎng)的要求更為苛刻,除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖等基本營養(yǎng)元素外,還需要血清。動物細胞對于培養(yǎng)環(huán)境的適應性更差,對環(huán)境更加敏感,包括ph、溶解氧、溫度、剪切力等都比微生物有更高的要求,需要嚴格控制。另

7、外,動物細胞相對于微生物來說,生長比較緩慢,因而培養(yǎng)時間較長。在細胞培養(yǎng)中,離體細胞對任何毒性物質都十分敏感,所以還需要防治污染問題,微生物、細胞殘余物以及非營養(yǎng)的化學物質都有可能導致動物細胞培養(yǎng)物的污染。這些都給動物細胞的培養(yǎng)帶來了一定的難度。 (三)動物細胞培養(yǎng)條件 1.無污染環(huán)境 細胞一旦離開機體,對環(huán)境無毒、無菌的要求也更高。因為動物體內存在著強大的免疫系統(tǒng)和肝臟等解毒器官,對侵入體內的少量的有毒物質,可進行抵抗和消毒,使細胞不受危害。當細胞被置于體外培養(yǎng)時,由于失去了抵抗能力,一旦污染便很容易導致細胞死亡。因此,在動物細胞進行體外培養(yǎng)時,保持無污染的環(huán)境是維持細胞生存的基本條件。 2

8、.溫度 溫度是細胞在體外生存的基本條件之一,來源不同的動物細胞,其最適的生長溫度是不盡相同的,例如人和哺乳動物的體內的溫度為35-37,昆蟲細胞的最適溫度是25-28,培養(yǎng)細胞的最合適的溫度也在這個范圍,偏離這一溫度范圍,細胞的正常生長和代謝將會受到影響,甚至導致細胞死亡。一般來說,培養(yǎng)細胞對低溫的耐受能力比高溫強。溫度不超過39時,細胞代謝強度與溫度成正比;若高于40,細胞受到嚴重損傷,幾小時內細胞便會死亡。細胞代謝隨溫度的降低而減緩,溫度不低于0時,能抑制細胞代謝,但細胞仍能生存和生長,但速度緩慢。 3.ph值 大多數(shù)動物細胞培養(yǎng)的最適ph一般為7.2-7.4,偏離此范圍對細胞將產生有害影

9、響,嚴重時可導致細胞退變或死亡。不同的細胞對ph的要求也不完全相同,一般原代培養(yǎng)細胞對ph的耐受力更差一點。總的說來,細胞的耐酸性比耐堿性強一些。因此培養(yǎng)過程一定要控制ph,為維持培養(yǎng)液的ph恒定,最常用的是加入磷酸緩沖劑的方法。 4.溶氧及氣體環(huán)境 細胞的生長代謝離不開氣體,所需氣體主要是o2和co2,氧參與三羧酸循環(huán),產生能量供給細胞生長和繁殖。co2是細胞代謝產物,它能調節(jié)培養(yǎng)環(huán)境的ph。當細胞代謝旺盛時,不斷釋放co2,培養(yǎng)液變酸;反之,當co2外溢時,會使ph升高。 5.營養(yǎng)物質 動物細胞體外培養(yǎng)所需的營養(yǎng)物質與體內培養(yǎng)的基本相同,對營養(yǎng)的要求較高,需要多種氨基酸、維生素、輔酶、核酸

10、、嘌呤、嘧啶、激素和生長因子。大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓都有一定的耐受性,對大多數(shù)細胞來說,滲透壓在260-320mosm/kg每kg細胞耐受的溶質濃度為260-320mmol/l范圍都適宜。在保證細胞滲透壓的情況下,培養(yǎng)液里的成分要滿足細胞進行糖代謝、脂代謝、蛋白質代謝及核酸代謝所需要的各種營養(yǎng),只有滿足了這些基本條件,細胞才能在體外正常生存、生長。 (四)動物細胞培養(yǎng)基 動物細胞培養(yǎng)基是細胞賴以體外生長、增殖、分化的重要因素。動物細胞的培養(yǎng)基一般可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基幾種,此外,動物細胞培養(yǎng)還需要一些常用的溶液。 1.天然培養(yǎng)基即直接取自動物體液或從組織中提取的成分做培養(yǎng)基

11、,主要有血漿、血清、胚胎浸出液、鼠尾膠原等。天然培養(yǎng)基使用最早,營養(yǎng)成分最高,也最為有效,但成分復雜,個體差異大,來源也缺乏,因此使用受到限制。 動物血清是天然培養(yǎng)基中最常用的,血清含有許多維持細胞生長繁殖和保持生物學特性不可缺少的營養(yǎng)物質,包括蛋白質和核酸等。另外,血清能中和培養(yǎng)基中的有毒物質的毒性,使細胞免受傷害。常用的動物血清主要有胎牛血清、犢牛血清、小牛血清、人ab血清、兔血清等。其中胎牛血清質量最好,但來源少,價格較高,最常用的是小牛血清。血清中主要含蛋白質、氨基酸、葡萄糖、激素、金屬離子、促貼附物質等。 2.合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是參照天然培養(yǎng)基的成分,根據(jù)細胞生存所需物質的種類和數(shù)

12、量,用化學物質人工模擬合成的。合成培養(yǎng)基成分已知,便于實驗條件的控制。但由于天然培養(yǎng)基的有些成分尚未知,加上有些成分尚無法用已知的化學成分代替,因此,要想細胞更好的生長和繁殖,還需加入一定量的天然培養(yǎng)基,一般是加入小牛血清。 3.無血清培養(yǎng)基 無血清培養(yǎng)基不加動物血清,在已知細胞所需營養(yǎng)物質和貼壁因子的基礎上,在基礎培養(yǎng)基中加入適宜的促細胞生長因子,保證細胞的良好生長。動物血清成分復雜,對細胞培養(yǎng)易造成污染和毒性作用,不利于產品的純化和檢測,再加上來源有限、成本高等限制了它的大規(guī)模使用。無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于避免了血清的這些缺點。在生產單克隆抗體、細胞生長因子和疫苗等生物制品的應用領域中,優(yōu)化

13、無血清培養(yǎng)基的成分可使不同的細胞在最有利于細胞生長和表達目的產物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。但無血清培養(yǎng)基并不適用于廣泛的細胞類型,不同類型的細胞甚至不同的細胞系或細胞株都有可能有各自的無血清培養(yǎng)基構成。在細胞早期培養(yǎng)階段,細胞對于無血清培養(yǎng)基的適應性往往是克隆特異性的,每個新的克隆常需要重新配制培養(yǎng)基和適應過程。最近研究表明,先使野生型宿主cho細胞適應無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),然后轉染這些細胞得到的重組克隆在基因擴增后保持了在無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)中的生長能力,其產品在生化和結構上類似于未處理的宿主細胞產物。 4.無蛋白培養(yǎng)基 無血清培養(yǎng)基中添加的蛋白成分價格昂貴,且有的成分如牛血清蛋白含有很多種雜質,

14、因此,在無血清培養(yǎng)成功以后,科學家們又開始研究從培養(yǎng)基中減去這些成分。在對細胞的營養(yǎng)需求有比較深入認識的基礎上,化學成分明確的無蛋白培養(yǎng)基已被用于中國倉鼠卵巢細胞cho和雜交瘤細胞的培養(yǎng)。 5.細胞培養(yǎng)常用液 (1)消化液 主要用于細胞培養(yǎng)前的組織塊解離和細胞的分散以及傳代培養(yǎng)時細胞脫離貼壁表面并分散細胞。常用的消化液有胰蛋白酶溶液和二乙烯四乙酸二鈉(edta)溶液。 胰蛋白酶溶液:呈黃色粉末狀,易潮解,應冷藏干燥保存。胰蛋白酶來源于牛、豬等動物的胰臟,能使細胞間的蛋白質水解,使細胞分散。不同的細胞對胰蛋白酶的濃度、溫度、作用時間的要求不一樣。在ph8.0,37時胰蛋白酶的效果最好。常用的溶液

15、的濃度是0.25%和0.125%兩種。ca2+,mg2+的存在和血清、蛋白質的存在會降低胰蛋白酶的活力。所以用無ca2+,mg2+的溶液配制,消化結束時,用血清來阻制酶作用。 edta溶液:又稱versen,是一種化學螯合劑,對細胞有一定的解離作用。它毒性小,易配制,使用方便。常用的濃度是0.02%。如將edta和胰蛋白酶溶液按一定的比例混合使用,效果更好。 此外,膠原蛋白酶溶液、鏈酶蛋白酶溶液等也可用于消化細胞,但價格昂貴,保存困難,因而使用較少。(2)ph調整液 各種細胞對培養(yǎng)基的酸堿要求是十分嚴格的,因此,培養(yǎng)前一定要用ph調整液將培養(yǎng)基的ph調整到合適的范圍。ph調整液應單獨配制,單獨

16、滅菌,使用前加入滅菌的培養(yǎng)基。常用的ph調整液有na2co3溶液(7.4%、5.6%、3.7%)、10%醋酸溶液和hepes液(20mmol/l,一種氫離子緩沖劑)。 (3)抗生素液 細胞培養(yǎng)的過程中,需向培養(yǎng)液中加入適量的抗生素液,以防止微生物的污染,而不影響細胞的生長。常用的抗生素有: 青、鏈霉素(雙抗)液:取青霉素g100萬單位、鏈霉素100萬單位溶于50ml 滅菌的hanks或三蒸水中作為母液。使用時在100ml培養(yǎng)基中加入0.5ml母液,則最終濃度為每毫升含100單位青霉素、100g鏈霉素。 卡那霉素液:取5萬微克卡那霉素溶于50mlhanks液中,即成10,000g/ml的母液。使

17、用時在100ml培養(yǎng)基中加入0.5ml母液,則最終濃度為50g/ml。 制霉菌素液:因其不溶于水,將其制成5,000g/ml的懸液,使用時在100ml培養(yǎng)基中加入0.5ml懸液,則最終濃度為25u/ml。 (五)動物細胞常用的培養(yǎng)方法 1.貼壁培養(yǎng)技術 大多數(shù)細胞在離體培養(yǎng)的條件下,都要附著在固體表面上才能生長。原來是圓形的細胞一經貼壁就迅速鋪展成各種形態(tài),一般在數(shù)天后就鋪滿生長表面,形成致密的細胞單層(monolayer cell)。當細胞生長到表面相互接觸時,就停止分裂增殖,這種現(xiàn)象稱為接觸抑制(contact inhibition)。所以如需繼續(xù)培養(yǎng),需將單層細胞再分散,稀釋后再重新接種

18、,進行傳代培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)的表面要求有帶有適量的正電荷和高度的表面活性,主要材料有明礬?硅硼酸玻璃、聚苯乙烯、不銹鋼等。貼壁培養(yǎng)的系統(tǒng)主要有轉瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)等。 貼壁培養(yǎng)的一般步驟是,先將組織塊消化,使之分散成細胞團或單個細胞狀態(tài),經過濾、離心、純化、漂洗后接種到有適宜營養(yǎng)液的培養(yǎng)系統(tǒng)中。然后放入co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 2.懸浮培養(yǎng)技術 少數(shù)非貼壁生長型細胞,如雜交瘤細胞,能在培養(yǎng)器中自由懸浮生長。將采集到的活體組織分散、過濾、離心、純化、漂洗后接種到適宜的培養(yǎng)液中,置于特定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。傳代時不需再分散,只需按比例稀釋即可繼續(xù)培養(yǎng)。對于小規(guī)模多采用轉瓶和滾瓶培養(yǎng),大規(guī)模培養(yǎng)可

19、采用類似發(fā)酵罐的生物反應器。懸浮培養(yǎng)設備要求簡單、細胞增殖快,可借鑒微生物發(fā)酵的成功經驗。但是,只有極少數(shù)的細胞適合這種懸浮培養(yǎng)。 (六)動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術始于20世紀60年代初capstick及其同事為生產fdm 疫苗而對bhk細胞的研究。它是在傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術的基礎上,融合固定化細胞、流式細胞技術、填充床、生物反應器技術以及人工灌流和溫和攪拌技術等發(fā)展起來的。 1.中空纖維細胞培養(yǎng)法 1972年,里查德?克瑞克(richard kncazek)等模擬體內微環(huán)境,設計了中空纖維細胞反應器。中空纖維是由聚楓或丙烯的聚合物組成的半透膜,水分子、營養(yǎng)物質和氣體可以透過,細

20、胞能在表面生長。細胞能在中空纖維上不斷從流動的培養(yǎng)液中獲得營養(yǎng)物質,細胞代謝產物和培養(yǎng)物又可隨培養(yǎng)液的流走而運走。與前面介紹的細胞生長在二維空間的培養(yǎng)技術不同,中空纖維細胞培養(yǎng)技術是模擬細胞在體內生長的三維狀態(tài)。培養(yǎng)系統(tǒng)的核心部分由3至6層這樣的中空纖維組成,細胞接種于中空纖維的外腔。細胞向三維空間繁殖,形成類似組織的多層細胞群體,細胞密度可達109個/ml。培養(yǎng)一段時間后,可逐漸用無血清培養(yǎng)基代替天然培養(yǎng)基。此時細胞不在增殖,但可繼續(xù)分泌產物,分泌物的純度可達60%-90%。這種培養(yǎng)系統(tǒng)具有所占空間小,產物的分離純化比較方便,細胞保持高度活性等優(yōu)點,適合多種細胞的培養(yǎng)。 2.微載體培養(yǎng)技術

21、大多數(shù)動物細胞,都具有貼壁生長的特性,而傳統(tǒng)的適于貼壁生長的細胞培養(yǎng)系統(tǒng),由于表面積的限制,很難達到大規(guī)模生產的目的。最初采用的滾瓶系統(tǒng),雖然能增加細胞生長的貼壁面積,但所占的空間大,勞動強度大、細胞產率低、不易監(jiān)控等缺點限制了他的進一步發(fā)展。1967年,凡?維茨兒(van wezel)開發(fā)了微載體培養(yǎng)系統(tǒng)microcarrier,mc培養(yǎng)貼壁細胞。經過幾十年的研究,微載體培養(yǎng)已廣泛地應用于動物細胞的培養(yǎng),其中尤以pharmacia生物技術公司生產的微載體cytodex、cytopore、cytoline等使用范圍最廣。微載體培養(yǎng)是細胞在由葡聚糖制成的小球表面成單層生長,通過輕輕攪拌使細胞維持

22、懸浮狀態(tài)。這種培養(yǎng)較傳統(tǒng)的單層細胞培養(yǎng),面積大大增加。如將這種微載體在流化床式、固定床式反應器中進行培養(yǎng),則可獲得比原來多2050倍的高密度細胞。另外,這種培養(yǎng)的勞動強度減少,1升微載體培養(yǎng)生產的細胞相當于50個轉瓶490cm2/瓶所生產的細胞,省卻了玻璃容器等的清洗和準備工作。而且細胞與培養(yǎng)液的分離簡單,一旦攪拌停止,3分鐘后細胞即能依靠其重力而沉淀,只要去除上清液,而無須進行離心操作。減少了繁復的操作步驟,降低了污染率。目前,狂犬病毒精制滅活疫苗就是采用cytodex培養(yǎng)vero細胞而進行大規(guī)模生產的。 常用的微珠載體是deae-交聯(lián)葡聚糖微粒。近年來,國外新開發(fā)的mc主要有液體微載體、大

23、孔纖維素微載體、phema微載體、聚苯乙烯孔微載體、聚氨酯泡沫微載體、磁性微載體。其中磁性微載體是由鐵、鈷或鎳的磁性氧化物與經戊二醛處理的明膠混合、研磨,并用水解蛋白酶處理后制成,對疫苗、干擾素、生長素的生產均具有應用潛力,且產品質量較高。 但是,實心微載體的比表面積還是太小,于是人們設計了用微載體內部固定細胞。如海藻酸鈉系統(tǒng)、瓊脂糖系統(tǒng)、瓊脂糖?海藻酸鈉系統(tǒng)等。這類技術能維持很高的細胞密度,但很難達到2l以上的規(guī)模。1985年,verax公司開創(chuàng)了大孔微載體培養(yǎng)技術,接著有了percell系統(tǒng)和siran系統(tǒng)。1986年,nssina報道了明膠大孔微載體的制備及其在細胞培養(yǎng)中的應用。大孔微載

24、體除了有利于細胞高密度大規(guī)模培養(yǎng)外,在外源蛋白的長期高效表達方面也明顯的優(yōu)勢。 大多孔微載體以纖維素為基質,內部有許多網狀的相互連通的小孔通向載體表面,細胞在接種后,易于進入微載體內部生長分裂,以避免剪切力或氣泡的影響,即使大部分細胞免受機械損傷,又為細胞提供了充分的生長空間。onderwater等報道,使用大多孔微載體培養(yǎng)能表達人類細胞色素p450同功酶的v79細胞,細胞量從接種時的2105/ml,增加到六天后的1107/ml。zhaolie c等用多孔微載體cytopore培養(yǎng)重組cho細胞系4b3,最高細胞密度達到8.83106/ml11。胡顯文等將cytopore多孔微載體用于中試規(guī)模

25、的反應器,也收到了很好的效果。另外,由聚乙烯和二氧化硅制成的微載體cytoline,則適用于貼壁依賴性及非貼壁依賴性細胞的流化床或灌注培養(yǎng)。 3.微囊化培養(yǎng)技術 微囊是一種由半透膜制成的多孔微球體,酶及大分子不能從微囊中溢出,而小分子物質可以通過。微囊化技術是用固定化技術將細胞包裹在微囊里,在培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)。細胞微囊化后,由于生長在各自的微小環(huán)境里,減少了培養(yǎng)時攪拌對細胞的剪切力,細胞生長良好,培養(yǎng)液易于迅速改變,且無分離細胞與培養(yǎng)液的困難。在培養(yǎng)過程中,微囊化也能提供很高的細胞密度,產物濃度和細胞純度都有所增加。微囊化培養(yǎng)技術為單克隆抗體、干擾素、乙肝表面抗原等大規(guī)模生產提供了廣泛的應用前

26、景。 1987年,利姆(lim)和薩姆(sum)制成了細胞能在其生長繁殖的微囊。制備微囊化細胞所用的材料主要是海藻酸和多聚賴氨酸。將動物細胞和海藻酸溶液混合懸浮,經微囊發(fā)生器制成微球滴入氯化鈣溶液中,制成凝膠球。然后用聚賴氨酸處理,使膠球表面包裹一層膜。最后用檸檬酸溶液處理,使細胞得以懸浮在微囊中。得到的動物細胞微囊就可懸浮與培養(yǎng)基中培養(yǎng)。據(jù)報道,微囊中單抗?jié)舛群芨?可達2.5g/l,且無其它雜蛋白,容易獲得高純度單抗。目前,微囊工藝已用于生產以克計的單克隆抗體。高表達有工業(yè)價值蛋白質的重組細胞近年來亦更多地用微囊化培養(yǎng)。二、動物細胞培養(yǎng)生物反應器 生物反應器是生化工藝過程中唯一一個把原料轉化

27、為產物的地方。在細胞培養(yǎng)過程中,細胞培養(yǎng)生物反應器是整個過程的關鍵設備,它要為細胞提供適宜的生長環(huán)境并決定著細胞培養(yǎng)的質量和產量。因此,生物反應器的選擇對整個生物反應過程至關重要。動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)需要特殊的反應器,與微生物和植物細胞不同,動物細胞外層沒有細胞壁,質膜脆性大,對剪切敏感以及對體外培養(yǎng)環(huán)境有嚴格的要求。因此,傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵用的反應器不能用于動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng),而具備低的剪切效應、較好的傳遞效果和力學性質是這類反應器設計或改進所必須遵循的原則。70年代以來,細胞培養(yǎng)用生物反應器用很大的發(fā)展,種類越來越多,規(guī)模越來越大,但是反應器的主要結構形式仍以攪拌式、氣升式和固定床為主。在

28、國外,celltech公司建立了10000l規(guī)模的生物反應器,培養(yǎng)雜交瘤細胞生產單克隆抗體;sumitomo公司建立了8000l攪拌反應器生產病毒疫苗、干擾素和其它生物制品,我國在“七五”期間已經開始這方面的研究,已成功地研制了cellcul-20a等細胞培養(yǎng)用生物反應器。 除了以人工誘變?yōu)槟康牡呐囵B(yǎng)外,用于動物細胞培養(yǎng)的生物反應器的設計原則應該是盡量模擬培養(yǎng)物在生物體內的生長環(huán)境。由于動物細胞生長的特殊性,需要特別注意反應器結構設計以及特殊載體的選擇。動物細胞培養(yǎng)用生物反應器大致有:氣升式生物反應器,中空纖維管生物反應器,流化床生物反應器,攪拌罐生物反應器,堆積床生物反應器,一次性生物反應器

29、,膜生物反應器等。 (一)氣升式生物反應器(airlift bioreactor) 氣升式生物反應器是實現(xiàn)動物細胞高密度培養(yǎng)的常用設備之一,其特點是結構簡單,操作方便。目前,我國利用生物反應器生產了大量生物制劑,多采用的是氣升式細胞培養(yǎng)生物反應器。氣升式細胞培養(yǎng)生物反應器的原理及結構見本書第五章第二節(jié)。 戴曉萍等人在氣升式反應器中利用微載體培養(yǎng)技術,研究了vero細胞高密度培養(yǎng)的工藝條件。證明氣升式反應器中懸浮微載體培養(yǎng)vero細胞,在加入適量保護劑、營養(yǎng)供應充足的情況下,細胞可以正常生長至長滿微載體表面,終密度可達1.13106個/ml。香港大學的wen等人報道了一個新型的灌流裝置,由氣升式

30、反應器和澄清器組成,用于高密度培養(yǎng)動物細胞。在灌流循環(huán)中,細胞經過兩級沉降回到反應器,平均培養(yǎng)密度達到1.31107個/ml。 (二)中空纖維管生物反應器hollow-fiber bioreactor 中空纖維細胞反應器主體是由微孔中空纖維管束組成的,纖維束由外殼包裹,因此可分為殼體空間及管體空間兩部分,每部分各有其進出口。一般地說,細胞生長在殼體部分,新鮮培養(yǎng)液從殼體部分導人,氣體在管體部分通過,其中一部分則均勻地擴散至殼體部分。反應器結構如圖6-32、6-33所示。殼體部分的細胞如是附壁性的,則附著在纖維外側,在培養(yǎng)結束后用胰蛋白酶消化液將其消化并沖出;若是非附壁性的,應采用微濾材料將其截

31、留在殼體內而讓廢培養(yǎng)液排出。中空纖維管細胞培養(yǎng)裝置的產率與細胞分泌速度有關外,還與細胞培養(yǎng)裝置的設計有關。它由于剪切力小而廣泛用于動物細胞的培養(yǎng),既可培養(yǎng)懸浮生長的細胞,又可培養(yǎng)貼壁依賴性細胞,細胞密度最高可達109 cells/ml數(shù)量級。主要用于雜交瘤細胞生產單克隆抗體。 柱狀中空纖維反應器是最目前最常用的中空纖維反應器類型,是理查德?克瑞克(knazek)20世紀70年代初設計的。以endotronics公司生產的最著名的acusystpm大規(guī)模生產系統(tǒng)為例,這種反應器的套管是一圓柱體,包含了兩條獨立的流動通道,每條通道連接有6個中型的中空纖維反應器。整個反應器系統(tǒng)采用計算機監(jiān)控各種生長

32、參數(shù),諸如營養(yǎng)鹽供應、廢物排出、ph、do、t等。 因柱狀中空纖維反應器中營養(yǎng)供應和代謝產物會存在濃度梯度,所以細胞分布受到影響而不均勻,限制了培養(yǎng)系統(tǒng)的進一步放大。由此,人們開發(fā)出板框式中空纖維反應器。該反應器的中心是一束中空纖維淺床,置于兩個不銹鋼微孔濾板之間,營養(yǎng)液通過濾板垂直流向纖維床乎面。雖然一定程度上克服了柱狀中空纖維反應器的不足,但是因為中空纖維淺床厚度有限,因而培養(yǎng)系統(tǒng)也不可能太大。 john等報道了一個用于大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的徑向流中空纖維反應器。該反應器內有一個垂直的中央分配管,外面由中空纖維管與分配管呈平行組成一個環(huán)狀床層。培養(yǎng)液由中央分配管徑向流過中空纖維床,細胞在中空

33、纖維外壁貼附并生長?？諝夂蚦o2的混合氣體在中空纖維間與培養(yǎng)液成錯流流過床層,向細胞提供氧分并維持一定的ph值環(huán)境,細胞的代射物隨氣流帶出。在這個反應器中細胞生長的表面密度可達7.3106個/cm2。 guinn發(fā)明了一個可用于動物細胞培養(yǎng)的生物反應裝置,由中空纖維反應器和灌流系統(tǒng)組成。液體通過泵在反應系統(tǒng)內循環(huán),灌流系統(tǒng)補充或置換培養(yǎng)介質及移出代謝物。細胞在中空纖維膜的一側生長,培養(yǎng)介質在膜的另一側通過擴散向細胞傳遞營養(yǎng)。該反應器能為細胞提供一個溫和的生長環(huán)境。用泵控制培養(yǎng)介質在反應器內循環(huán)。培養(yǎng)液在中空纖維腔內流動并通過中空纖維膜向另一側供應細胞生長所需的養(yǎng)分。該反應器可控制溶氧、介質組成

34、、溫度和ph值,適合于細胞的高密度懸浮培養(yǎng),尤其適合于動物細胞培養(yǎng)反應器,由氧滲透膜管和中空纖維束構成內外空間,供細胞生長和向細胞提供營養(yǎng)。細胞培養(yǎng)密度幾乎能達到2108個/ml。該反應器可用于為大規(guī)模中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)預測不同介質、培養(yǎng)條件及其他因素對細胞生長可能產生的。中空纖維管反應器總的發(fā)展趨勢是讓細胞在管束外空間中生長,用這種方式,能獲的更高密度的細胞。 (三)流化床生物反應器fluidizbed bioreactor 流化床生物反應器的基本原理是培養(yǎng)液通過反應器垂直向上循環(huán)流動,不斷提供給細胞必要的營養(yǎng)成分,使細胞得以在呈流態(tài)化的微粒中生長。同時,不斷加入新鮮培養(yǎng)液。這種反應器的傳質性

35、能好,并在循環(huán)系統(tǒng)中采用膜氣體交換器,能快速提供給高密度細胞所需要的氧,同時排出代謝產物;反應器中的液體流速足以使細胞微粒懸浮卻不損壞脆弱的細胞。流化床生物反應器滿足了高密度細胞培養(yǎng),使高產量細胞長時間停留在反應器中,優(yōu)化了細胞生長與產物合成的環(huán)境等細胞培養(yǎng)的要求。流化床反應器可用于貼壁依賴性細胞和非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)。另外,流化床反應器放大也比較容易,放大效應小,已成功地從0.5l放大至10l,用于培養(yǎng)同種細胞生產單克隆抗體,體積生產率基本一致。 (四)攪拌罐生物反應器stirtank bioreactor 攪拌罐生物反應器基本結構為:一個旋轉過濾器、一臺用于控制溫度、ph值、攪拌速度和溶

36、氧do的數(shù)字控制裝置dcu和起通氣作用的底部環(huán)形噴氣結構?；驹硎切迈r培養(yǎng)基分散進入旋轉濾器的外部區(qū)域,從旋轉濾器的中間獲得無微載體的收集液。旋轉濾器一般由不銹鋼絲網構成,有良好的生物相溶性,易于清洗和消毒,可重復和長期使用。在攪拌式生物反應器中同樣可以培養(yǎng)懸浮生長的細胞,又能培養(yǎng)貼壁生長的細胞。它主要的優(yōu)點是能滿足高密度細胞培養(yǎng)的要求。celligen籠式通氣攪拌罐和20l雙層籠式通氣攪拌罐(cellcul-20)已經大規(guī)模培養(yǎng)多種細胞。1999年,美國人zhaolie-c在攪拌式生物反應器中利用重組cho細胞4b3生產了纖維蛋白溶酶原激活. (五)堆積床生物反應器packedbed bi

37、oreactor celligenplus堆積床生物反應器的工作原理為:當推進器impeller旋轉時,培養(yǎng)基通過推進器的中心空管螺旋式地從罐體底部往上流,然后從3個出口中流出,通過堆積床向下流動至罐體底部,再通過推進器的中心管往上流。細胞附著在堆積床的聚酯片上,氣體從噴射器噴出進入培養(yǎng)基中。通過調節(jié)氣體混合物的組成成分,完成對ph和do的控制,加入氧氣或氮氣以滿足培養(yǎng)過程中氧氣的吸收;當ph太高時加入co2;空氣作為一種填充氣體,保持氣體進入罐體時流速的穩(wěn)定。培養(yǎng)基通過蠕動泵從培養(yǎng)基儲存瓶mediareservoir中進入反應器,收集液通過蠕動泵從反應器中流出進入收集瓶。堆積床有以下特點:貼

38、壁依賴性和懸浮細胞可成功地在堆積床內附著;細胞不接觸氣液界面,低漩流和低剪切力,細胞受到的傷害很小;反應器能以分批式或連續(xù)/灌流方式運轉,并可維持長時間;聚酯片提供高的表面積/體積比率,維持高細胞密度。 國內有人采用美國new bruns wick scientific公司生產的celligen plus堆積床生物反應器,用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分泌rhepo的工程細胞株xp9501,用于大規(guī)模生產重組人促紅細胞生成素。 (六)一次性生物反器disposable bioreactor 這種生物反應器由預先消毒的、fda認可的、對生物無害的聚乙烯塑料箱組成,箱中部分填充培養(yǎng)基并接種細胞。箱中其余部分是

39、空的,培養(yǎng)過程中空氣連續(xù)通過這里,空氣通過完整的過濾器進入箱體。前后搖動箱體使液氣界面產生波動,大大提高了氧氣的溶解量,有利于排出co2,控制ph值,也促使培養(yǎng)液混合均勻,細胞和顆粒不會下沉。廢氣通過一個消毒過濾器和止逆閥。整個生物反應器置于傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)用co2培養(yǎng)箱中,便于控制溫度和ph值,或者在箱體底部加熱控制溫度。培養(yǎng)細胞的密度可達到7106ml-1和100l的工作體積.使用前箱體用射線消毒,用后丟棄。特殊的開孔可進行無菌加樣、取樣,而不必把生物反應器置于層流罩中。裝置簡單,易于操作,成本低,低剪切力,無空氣鼓泡,減低了氣泡對細胞的損害。可用于培養(yǎng)動物細胞和植物細胞,并十分適合生產病毒

40、。此反應器已成功懸浮培養(yǎng)重組ns0細胞生產單克隆抗體;懸浮培養(yǎng)人293細胞生產腺病毒adenovirus;用昆蟲sf9細胞生產棒狀病毒baculovirus;用微載體cytodex3培養(yǎng)人393細胞。 植物細胞培養(yǎng)生物反應器 植物細胞培養(yǎng)是指在離體的條件下,將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中,進行振蕩培養(yǎng),得到分散成游離的細胞,通過繼代培養(yǎng)使細胞增殖,從而獲得大量的細胞群體的一種技術。植物細胞含有人類所需的成分,而傳統(tǒng)的方法從植物中提取分離這些成分已很難滿足人們的需求。近年來,利用植物細胞培養(yǎng)來生產有用代謝產物已受到廣泛的關注,但是,只有一小部分的產品已成功用于商業(yè)化生產,其原因是反

41、應器設計、過程發(fā)展以及對反應機理知識的欠缺等工藝上的限制。植物細胞生長緩慢、需氧低,此外,由于它們體積較大、細胞壁較厚、液泡較大而對剪切敏感。因此氣升式和柱狀生物反應器應用較為普遍。隨著植物細胞懸浮培養(yǎng)技術的逐步完善,單細胞培養(yǎng)的成功,各種新型生物反應器的問世,利用植物細胞培養(yǎng)技術成為大規(guī)模生產植物代謝產物的有效途徑。 一、植物細胞培養(yǎng)過程植物細胞培養(yǎng)按照培養(yǎng)對象可分為單倍體細胞培養(yǎng)和原生質體培養(yǎng);按照培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng);按照培養(yǎng)方式可分為懸浮培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng)。 單倍體培養(yǎng) 一般是指花藥在人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),從小孢子(雄性生殖細胞)直接發(fā)育成胚狀體,然后再長成單倍體植株;也可

42、以通過愈傷組織誘導分化出芽和根,最終長成植株。 原生質體培養(yǎng) 將植物的體細胞(二倍體細胞)經纖維素酶等去掉細胞壁處理后,獲得的原生質體(protoplast)在無菌培養(yǎng)基上生長、分裂,最終長成植株。也可以將不同植物的原生質體融合而獲得體細胞雜交的植株。 固體培養(yǎng)是在微生物培養(yǎng)基礎上發(fā)展起來的植物細胞培養(yǎng)的方法。培養(yǎng)基添加一定比例的瓊脂配制,用培養(yǎng)皿、三角燒瓶或試管分裝,經高壓滅菌冷卻凝固后接種經消毒過的外植體,整個過程需無菌操作。 液體培養(yǎng) 也是在微生物培養(yǎng)基礎上發(fā)展起來的,可分為靜止與振蕩兩種。靜止培養(yǎng)無需任何設備,適合某些原生質體的培養(yǎng)。振蕩培養(yǎng)需要搖床或轉床等設備,可使培養(yǎng)物充分混合以利

43、于氣體交換。 細胞懸浮培養(yǎng) 是一種使組織培養(yǎng)物分離成單細胞并不斷擴增的液體培養(yǎng)技術。在進行細胞培養(yǎng)時需要提供容易碎裂的愈傷組織進行液體培養(yǎng)。與微生物培養(yǎng)相似,植物細胞的懸浮培養(yǎng)也包括分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)(也叫流加培養(yǎng))、連續(xù)培養(yǎng)三種方式。目前,植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)主要采用懸浮培養(yǎng)方式,這主要是由于懸浮培養(yǎng)可以增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面,促進營養(yǎng)的吸收;可帶走培養(yǎng)物產生的有害代謝產物,避免高濃度積聚對細胞的傷害;可保證良好的混合狀態(tài),從而獲得良好的氣體傳遞效果;可以借鑒發(fā)酵工程的成熟技術,容易放大實現(xiàn)規(guī)?；?。 固定化細胞培養(yǎng) 是在微生物和酶的固定化培養(yǎng)基礎上發(fā)展起來的。是固體培養(yǎng)的一種,但不是使

44、用固體培養(yǎng)基,而是與固定化酶或固定化微生物細胞培養(yǎng)類似的一種植物細胞培養(yǎng)技術,目前應用最廣泛的、能很好保持細胞活性的固定化方法是將細胞包埋于海藻酸鹽或卡拉膠中。具體培養(yǎng)方法將在下一節(jié)中介紹。 (一)植物細胞培養(yǎng)基 對植物細胞的生長而言,培養(yǎng)基的組成成分是一個決定性的因素。植物細胞培養(yǎng)與動物細胞培養(yǎng)相比,其最大的優(yōu)點是植物細胞能在簡單的合成培養(yǎng)基上生長。其培養(yǎng)基主要由無機鹽類、碳源、維生素、植物生長激素、有機氮源、有機酸等組成。 1.無機鹽類 對于不同的培養(yǎng)對象和形式,無機鹽的最佳濃度是不相同的。通常在培養(yǎng)基中至少含有25mmol/l的硝酸鹽和鉀。雖然硝酸鹽可以單獨作為無機氮源,但是加人一點銨鹽

45、對細胞生長有利。如果銨鹽單獨作為氮源,添加一些琥珀酸或其他三羧酸循環(huán)酸效果更好。對常規(guī)的愈傷組織培養(yǎng)和細胞懸浮培養(yǎng)來說,硝酸鹽加上銨的濃度可達到60mmol/l,說明銨可能對某些培養(yǎng)物有重要作用。鎂、鈣和硫元素的濃度在l3mmol/l范圍較為合適。所需的鈉、磷和氯化物有鈣鹽、磷酸鹽和微量營養(yǎng)物提供。微量元素包括碘、錳、鋅、鉬、銅、鈷和鐵。 2.碳源和能源 蔗糖或葡萄糖是常規(guī)的碳源,而果糖的利用效果較差。其他糖類均不合適作為單一的碳源。培養(yǎng)基中蔗糖被迅速分解為葡萄糖和果糖,葡萄糖首先被利用,然后再利用果糖。大多數(shù)植物細胞對蔗糖的需求范圍是2%到4%。通常增加培養(yǎng)基中蔗糖的含量,可增加培養(yǎng)細胞的次

46、生代謝產物量。 3.植物生長激素 植物激素是培養(yǎng)基中不可缺少的組成部分,大多數(shù)植物細胞培養(yǎng)基中都含有天然的和合成的植物生長激素。通常激素可分為二類:生長素和細胞分裂素。生長素能促進細胞分裂,常用的有吲哚乙酸(iaa)、吲哚丁酸(iba)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-d)和萘乙酸(naa)。前兩種不穩(wěn)定,能被細胞釋放的酶降解,而后兩種被細胞降解的較慢,對熱穩(wěn)定。細胞分裂素常用的是6-芐基瞟憐(6-ba),激動素(kt)和玉米素(zeatin)。將分裂素和生長素一起使用,效果更佳。使用量在0.110mg/l之間,可根據(jù)不同細胞株而異。 4.維生素 在各種維生素中,硫胺素(維生素b2)可能是必需

47、的,而煙酸和吡哆辛(維生素b6)對生長有促進作用。一般在培養(yǎng)基中都加了較多的肌醇,它能促進愈傷組織的生長。 5.有機氮源 通常采用的有機氮源有水解酪蛋白、谷氨酰胺或氨基酸混合物。在細胞初級培養(yǎng)的早期生長階段,有機氮源可促進胚胎發(fā)生和多胚性出現(xiàn)。 6.有機酸在以銨鹽作為單一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)時,加人丙酮酸或者三羧酸循環(huán)中間產物如檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸等,能夠保證植物細胞生長,并且耐受鉀鹽的能力也有所提高。 (二)植物細胞培養(yǎng)基的制備 配制培養(yǎng)基所用的蒸餾水最好是用玻璃容器蒸餾過的去礦質鹽的蒸餾水,所用的無機鹽、碳源、維生素應該采用高純度級的藥品。生長激素在使用前需要重結晶提純,其酒精-水溶液要用吸

48、附法脫色處理。蛋白水解液最好用酶水解。對于吲哚乙酸、吲哚丁酸、2,4-二氯苯氧基乙酸和萘乙酸這樣難溶于水的生長激素類物質,配溶液時可先溶于95%的酒精中,然后慢慢加人蒸餾水,稍微加熱,稀釋至所需體積,再調節(jié)ph。由于培養(yǎng)基配比中有些組分量很小,可按培養(yǎng)基配方濃度配成使用濃度的10倍或者更多倍的母液,分成小瓶后冷凍保存,使用時再稀釋到正常濃度。為了防止在高濃度下培養(yǎng)基組分間相互作用產生沉淀,鈣鹽、鈉鐵鹽等要單獨配制保存,使用時再稀釋混合。維生素每種也是分開配制的。配制細胞分裂素物質,應先用少量濃度為0.5或1mol/l的鹽酸來溶解,然后加蒸餾水至所需量。在培養(yǎng)基配制過程中可用0.5mol/l的h

49、cl或0.2mol/lnaoh凋節(jié)ph,固體培養(yǎng)基加人瓊脂0.6%1.0%,121蒸汽滅菌1520min。大多數(shù)培養(yǎng)基成分都經得起高溫滅菌,對于一些熱敏性化合物,如l谷氨酰胺、植物生長激素等應該用過濾法滅菌,然后再按無菌操作加人到己滅茵的培養(yǎng)基中。二、植物細胞培養(yǎng)生物反應器 與天然栽培法相比,利用植物細胞培養(yǎng)技術生產藥用代謝產物、食品添加劑、化妝品等具有明顯的優(yōu)勢,但能成功地把搖瓶培養(yǎng)的結果放大到生物反應器中而實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)的較少,可見研究合適的生物反應器對于植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產有用代謝產物是非常重要的。植物細胞培養(yǎng)反應器最初大多采用微生物反應器。由于植物細胞與微生物細胞形態(tài)結構不同,植物細

50、胞較微生物細胞大,對氧需求小,對剪切力卻很敏感,因此不象微生物培養(yǎng)那樣采用高剪切的攪拌,而混合顯得更重要。目前,由于植物細胞懸浮技術的發(fā)展,單細胞培養(yǎng)的成功,加上各種新型生物反應器的問世,使得植物細胞有可能像微生物那樣在發(fā)酵罐中大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)。用于植物細胞培養(yǎng)的反應器主要有攪拌式、非攪拌式及其它新型生物反應器,另外還有植物細胞固定化反應器和膜反應器等。 (一)機械攪拌式生物反應器 機械攪拌式生物反應器混合程度高,適應性廣,能獲得很高的溶氧系數(shù)kla,在大規(guī)模生產中廣泛使用。但是攪拌罐中產生的剪切力大,容易損傷細胞,且植物細胞培養(yǎng)一般只需較低的溶氧系數(shù)。因而對于有些對剪切力敏感的細胞,傳統(tǒng)的機械

51、攪拌罐并不適用。為此,對攪拌罐進行了改進,包括改變攪拌形式、葉輪結構與類型、空氣分布器等,力求減少產生的剪切力,同時滿足供氧與混合的要求。kaman等采用帶有1個雙螺旋帶狀葉輪helicalribbonimpeller和3個表面擋板的攪拌罐,證明適于剪切力敏感的高密度細胞培養(yǎng)。jolicoeur等進行了類似的研究,在反應器中得到與搖瓶相同的高濃度生物量。鐘建江等通過培養(yǎng)紫蘇細胞進行比較,發(fā)現(xiàn)帶以微孔金屬絲網作為空氣分布器的三葉螺旋槳反應器mrp能提供較小的剪切力和良好的供氧及混合狀態(tài),優(yōu)于六平葉渦輪槳反應器,并認為在高濃度細胞培養(yǎng)時,mrp型反應器將顯示更大的優(yōu)越性。離心式葉輪反應器centr

52、ifugalim-pellerbioreactor與細胞升式反應器cell-liftbiore-actor相比具有較高升液能力,較低剪切力,較短混合時間,在高濃度下具有高得多的溶解氧系數(shù),表明有用于剪切力敏感的生物系統(tǒng)的巨大潛力。另有方框型槳式攪拌、蝶型渦輪攪拌等不同形式的機械攪拌罐用于植物細胞培養(yǎng)的生產和研究,結果證明不同葉輪產生剪切力大小順序為渦輪狀葉輪平葉輪螺旋狀葉輪。一種升流式生物反應器lift-streambioreactor利用罐中心一根連有多孔板的桿上下移動達到攪拌的目的,可用于培養(yǎng)剪切力敏感細胞。 (二)非攪拌式生物反應器 相對于傳統(tǒng)攪拌式反應器,非攪拌式反應器所產生的剪切力較

53、小,結構簡單,因此被認為適合植物細胞培養(yǎng)。其主要類型有鼓泡式反應器、氣升式反應器和轉鼓式反應器等。通過對培養(yǎng)紫蘇細胞的生物反應器比較發(fā)現(xiàn)鼓泡式反應器優(yōu)于機械攪拌式反應器。但由于鼓泡式反應器對氧的利用率較低,如果用較大通氣量,則產生的剪切力會損傷細胞。研究表明,噴大氣泡時,湍流剪切力是抑制細胞生長和損害細胞的重要原因。較大氣泡或較高氣速導致較高剪切力,從而對植物細胞有害。氣升式反應器廣泛應用于植物細胞培養(yǎng)的研究和生產。通過胡蘿卜細胞培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn),比較攪拌罐、氣體噴射罐和帶通氣管的氣升式反應器,最高細胞濃度和最短倍增時間可從氣升罐中得到。氣升式反應器用于多種植物細胞懸浮培養(yǎng)或固定化細胞培養(yǎng),但其操作彈性較小,低氣速時,尤其h/d大,高密度培養(yǎng)