第10章化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)

1、第一章第一章 血液標(biāo)本采集與處理血液標(biāo)本采集與處理 臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 第十章第十章 化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn) 張國(guó)軍張國(guó)軍 目 錄 第一節(jié) 概述 第二節(jié) 化學(xué)發(fā)光劑的特征 第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的類型 第四節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的臨床應(yīng)用 第五節(jié) 臨床常用化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)試劑方法特點(diǎn) 第六節(jié) 影響化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的主要因素 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述 重點(diǎn)提示 發(fā)光 化學(xué)發(fā)光 化學(xué)發(fā)光的條件 化學(xué)發(fā)光的效率 化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的分類 化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的非均相分離方式 一、發(fā)光的分類一、發(fā)光的分類 發(fā)光：發(fā)光：是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài) （較低能級(jí)）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級(jí)），

2、然后再返回到 基態(tài)，并釋放光子的過程。 根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為: 光照發(fā) 光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光。 光照發(fā)光光照發(fā)光是指發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長(zhǎng)的入射光照 射后，躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，發(fā)射出較長(zhǎng)波 長(zhǎng)的可見光（熒光）。 生物發(fā)光生物發(fā)光是指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲 的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下 ，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài) 時(shí)多余的能量以光子的形式釋放出來。 化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn) 象，由于化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生電子能級(jí)處于激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，后者 通過躍遷釋放能量產(chǎn)生光子，從而導(dǎo)致的發(fā)光現(xiàn)象。

3、二、化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的條件二、化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的條件 一些化學(xué)反應(yīng)能釋放足夠的能量把參加反應(yīng)的物質(zhì)激 發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)的是一個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物 分子，則這種反應(yīng)過程叫直接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程可簡(jiǎn)單 地描述如下： A + BC* C*C + h 若激發(fā)能傳遞到另一個(gè)未參加化學(xué)反應(yīng)的分子D上， 使D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí) 發(fā)光，這種過程叫間接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程可表示如下： A + BC* C* + DC + D* D*D + h 無論直接化學(xué)發(fā)光還是間接發(fā)光，一個(gè)化學(xué)反應(yīng)要產(chǎn)生發(fā) 光現(xiàn)象，必須滿足以下條件: 1.該反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能，并由某一步驟單獨(dú)提供 ，因?yàn)榍耙徊?/p>

4、反應(yīng)釋放的能量將因振動(dòng)弛豫消失在溶液中而不 能發(fā)光。 2.要有有利的反應(yīng)過程，使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種 物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)。 3.激發(fā)態(tài)分子必須具有一定的化學(xué)發(fā)光效率釋放出光子， 或者能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個(gè)分子使之進(jìn)入激發(fā)態(tài)并釋放出 光子。 三、化學(xué)發(fā)光效率三、化學(xué)發(fā)光效率 化學(xué)發(fā)光效率決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā) 效率（CE）和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率（EM）?；瘜W(xué)發(fā) 光反應(yīng)的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完 全由發(fā)光物質(zhì)的性質(zhì)所決定，每一個(gè)發(fā)光反應(yīng)都具有其特 征性的化學(xué)發(fā)光光譜和不同的化學(xué)發(fā)光效率。 四、化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的分類四、化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的分類 化學(xué)發(fā)光免疫分

5、析，根據(jù)待測(cè)分子的大小可設(shè)計(jì)成多種反 應(yīng)模式，如夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法等。 根據(jù)游離標(biāo)志物和結(jié)合標(biāo)志物是否需要分離，可分為均相 和非均相測(cè)定兩種。 根據(jù)化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)中標(biāo)志物的不同及反應(yīng)原理的不同，大 體可分為四種類型：直接化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光酶免疫 試驗(yàn)、電化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)、發(fā)光氧通道免疫試驗(yàn)。 五、化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的非均相分離方式五、化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的非均相分離方式 為實(shí)現(xiàn)游離標(biāo)記物和免疫復(fù)合物標(biāo)記物的分離，各系統(tǒng) 采用的方法各有不同，主要采用固相、過濾、珠式、順磁性 顆粒分離等方式 第二節(jié)第二節(jié) 化學(xué)發(fā)光劑的特性化學(xué)發(fā)光劑的特性 重點(diǎn)提示 直接化學(xué)發(fā)光劑 電化學(xué)發(fā)光劑 酶促反應(yīng)發(fā)光劑 在化學(xué)

6、發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的 形式釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。 直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化 作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光 的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體，常用的為吖啶酯。 三聯(lián)吡啶釕 RU(bpy)32+是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供 體三丙胺（TPA）在陽(yáng)電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧 化反應(yīng)。 酶促反應(yīng)發(fā)光劑是利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（ 底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑稱為酶促反應(yīng) 發(fā)光劑。常用的有魯米諾及其衍生物和AMPPD。 化學(xué)發(fā)光劑的發(fā)光原理詳見第四章。 第三節(jié)第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的類型化學(xué)發(fā)

7、光免疫試驗(yàn)的類型 重點(diǎn)提示 直接化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn) 電化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn) 發(fā)光氧通道免疫試驗(yàn) 一、直接化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)一、直接化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn) 原理：原理：用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng) 的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原- 吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH 使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能 ，這部分光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì) 算出待測(cè)抗原的含量。 直接化學(xué)發(fā)光的原理直接化學(xué)發(fā)光的原理- -雙抗體夾心法雙抗體夾心法 二、電化學(xué)發(fā)光免

8、疫試驗(yàn)二、電化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn) 原理：原理：磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯(lián)吡啶釕 標(biāo)記抗體(抗原)，待測(cè)標(biāo)本與相應(yīng)的抗原 (抗體)發(fā)生免疫反應(yīng) ，形成磁性微粒包被抗體-待測(cè)抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物 ，這時(shí)將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室，同時(shí)引人TPA緩沖液。當(dāng)磁性 微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未 結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，使三 聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光 的強(qiáng)度與待測(cè)抗原的濃度成正比。 電化學(xué)發(fā)光的原理電化學(xué)發(fā)光的原理- -雙抗體夾心法雙抗體夾心法 三、發(fā)光氧通道免疫試驗(yàn)三、發(fā)光氧通道免疫試驗(yàn) LOCI

9、技術(shù)基于抗原抗體反應(yīng)，此檢測(cè)體系中用了三種試劑： 1. 感光微粒 感光微粒是覆蓋有親和素和酞菁染料的乳 膠聚苯乙烯微粒，可以吸收680nm的光，生成高能單線態(tài)氧。 2. 發(fā)光微粒 發(fā)光微粒含有烯烴染料和特異性抗體（抗 原），可以與單線態(tài)氧反應(yīng)，放出612nm光信號(hào)。復(fù)合物釋放 的化學(xué)光在612nm被LOCI檢測(cè)器讀取。只有兩種粒子形成二聚 體才能生成化學(xué)光信號(hào)。 3. 生物素化抗體 特異的抗體與生物素結(jié)合后，形成 生物素化抗體，可以與含有親和素的感光微粒結(jié)合。 發(fā)光微粒與感光微粒結(jié)構(gòu) 示意圖 LOCILOCI技術(shù)的原理技術(shù)的原理是高能單線態(tài)氧的產(chǎn)生和傳遞。在受到紅 色激光（680nm）照射后，

10、感光微粒能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化 為高能單線態(tài)氧，高能單線態(tài)氧的生存時(shí)間僅為4微秒。短暫 的生存時(shí)間決定了離子氧的傳播直徑很?。s為200nm）。如 果發(fā)光微粒在200nm范圍之內(nèi)就能接受離子氧，并發(fā)出高能級(jí) 的光（610nm）。相反，如果在200nm直徑范圍內(nèi)沒有發(fā)光微粒 ，高能態(tài)離子氧就會(huì)回落到基態(tài)氧而沒有信號(hào)產(chǎn)生。 在LOCI系統(tǒng)中，包被有特異性抗體的發(fā)光微粒、生物素 化的特異性抗體與待測(cè)物結(jié)合形成發(fā)光微粒-待測(cè)物-生物素 化抗體復(fù)合物，該復(fù)合物可以與含有親和素的感光微粒結(jié)合 ，從而拉近了感光微粒與發(fā)光微粒的距離，使得距離200nm 。當(dāng)680nm的光照射時(shí)，感光微粒使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為

11、高 能單線態(tài)氧，高能單線態(tài)氧被發(fā)光微粒捕獲，與化學(xué)微粒發(fā) 生反應(yīng)，釋放出612nm光信號(hào)，被檢測(cè)器讀取。 發(fā)光氧通道免疫試驗(yàn)發(fā)光氧通道免疫試驗(yàn)原理原理 四種化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)的比較 直接化學(xué)發(fā)光酶促化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光 發(fā)光氧通道 化學(xué)發(fā)光劑吖啶酯ALP/HRP三聯(lián)吡啶釕 感光微粒 免疫反應(yīng)模式夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法 夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法 光信號(hào)閃光輝光電激發(fā)閃光 激發(fā)光 反應(yīng)速度快速較快速快速 快速 影響結(jié)果的因 素 少較多少 少 發(fā)光底物NaOH-H2O2金剛烷、魯米諾電激發(fā) 發(fā)光微粒 檢測(cè)成本高低高 低 均相/非均相反 應(yīng) 非均相非均相非均相 均相 第四節(jié)第四節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的

12、臨床應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的臨床應(yīng)用 由于化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)技術(shù)具有無放射性污染、可自 動(dòng)化、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高特異性的特點(diǎn)，因此已廣 泛應(yīng)用于各種激素、腫瘤標(biāo)志物、治療性藥物濃度監(jiān)測(cè)、 傳染性疾病的篩查、出生缺陷的產(chǎn)前診斷、細(xì)胞因子等的 臨床測(cè)定。 第五節(jié)第五節(jié) 臨床常用化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)試劑方臨床常用化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)試劑方 法特點(diǎn)法特點(diǎn) 重點(diǎn)提示 直接化學(xué)發(fā)光試劑特點(diǎn) 電化學(xué)發(fā)光試劑特點(diǎn) 發(fā)光氧通道試劑特點(diǎn) 一、直接化學(xué)發(fā)光試劑一、直接化學(xué)發(fā)光試劑 該類分析試劑通常采用磁顆粒包被抗原或抗體，增加反應(yīng)的 表面積，提高反應(yīng)的靈敏度，縮短反應(yīng)的時(shí)間。應(yīng)用磁力吸附分 離，沖洗徹底，提高反應(yīng)的特異性。

13、 有的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑還采用專利技術(shù)的吖啶酯類（N- 磺?；然被衔镒鳛闃?biāo)記物，在非競(jìng)爭(zhēng)免疫分析模式中 有極好的測(cè)試靈敏度和極寬的線性范圍。背景噪音極大降低，從 而檢測(cè)靈敏度大大提高；同時(shí)，該復(fù)合物還有極好的穩(wěn)定性，有 更長(zhǎng)的試劑效期和全面的、極好的試劑表現(xiàn)。 二、電化學(xué)發(fā)光二、電化學(xué)發(fā)光試劑試劑 電化學(xué)發(fā)光試劑采用獨(dú)特的磁性微粒子固相載體技術(shù) 、專利的鏈霉親合素生物素間接包被技術(shù)以及獨(dú)到的信號(hào)檢 測(cè)系統(tǒng)，使得檢測(cè)反應(yīng)速度快、靈敏度高、線性范圍寬。 三、發(fā)光氧通道免疫試驗(yàn)試劑試劑 發(fā)光氧通道免疫試驗(yàn)試劑主要由感光微粒、發(fā)光微粒和 生物素化的抗體三部分組成。感光微粒與發(fā)光微粒均勻分布

14、 在反應(yīng)體系中，在分子作用力下自由運(yùn)動(dòng)，能更快速、充分 的完成免疫反應(yīng)，所以光激化學(xué)發(fā)光的免疫反應(yīng)時(shí)間更短。 由于反應(yīng)原理的特殊性，整個(gè)反應(yīng)過程穩(wěn)定，不易受到pH值 、離子強(qiáng)度和溫度的影響，同時(shí)檢測(cè)的靈敏度更高。 四、酶促化學(xué)發(fā)光試劑四、酶促化學(xué)發(fā)光試劑 詳見第九章詳見第九章 第六節(jié)第六節(jié) 影響化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的主要因素影響化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)的主要因素 重點(diǎn)提示 標(biāo)本的影響 試劑的影響 其它影響 一、標(biāo)本的影響 新鮮標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果更能準(zhǔn)確反映機(jī)體的真實(shí)情況，應(yīng) 在采血后24小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)；血液標(biāo)本采集后必須使其充分 凝固后再分離血清，血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血 清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，易造成假陽(yáng)性結(jié)果； 標(biāo)本反復(fù)凍融，也容易造成假陽(yáng)性。 若待測(cè)抗原濃度過高，易出現(xiàn) “鉤狀效應(yīng)”，使結(jié)果 偏低，應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋。 二、試劑的影響 化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑廠家較多，不同廠家生產(chǎn)的試劑 靈敏度與特異性存在一定的差別，選擇高質(zhì)量的試劑是保證 結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。試劑應(yīng)按照說明書要求保存，