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1、基因工程試驗綠色熒光蛋白（GFP）在E·coliBL21中的表達(dá)前言綠色螢光蛋白(green fluorescent protein)，簡稱GFP，這種蛋白質(zhì)最早是由下村修等人在1962年在一種學(xué)名Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)。分子質(zhì)量為26kDa，由238個氨基酸構(gòu)成，其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長范圍的光線激發(fā)下，會發(fā)出綠色螢光（第6567位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團，是主要發(fā)光的位置）。這個發(fā)光的過程中還需要冷光蛋白質(zhì)Aequorin的幫助，且這個冷光蛋白質(zhì)與鈣離子(Ca2+)可產(chǎn)生交互作用。其發(fā)光團的形成不具物種專一性，發(fā)出熒光穩(wěn)定，且不需

2、依賴任何輔因子或其他基質(zhì)而發(fā)光。綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后很穩(wěn)定，對多數(shù)宿主的生理無影響，是常用的報道基因。應(yīng)用：1 GFP作為報告基因GFP作為基因報告可用來檢測轉(zhuǎn)基因效率，把GFP基因連接到目的基因的啟動子之后，通過測定GFP的熒光強度就可以對該基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。2 GFP作為融合標(biāo)簽GFP最成功的一類應(yīng)用就是把GFP作為標(biāo)簽融合到主體蛋白中來檢測蛋白質(zhì)分子的定位、遷移、構(gòu)象變化以及分子間的相互作用，或者靶向標(biāo)記某些細(xì)胞器。3.作為生物傳感器4. 檢測pH 野生型GFP和其許多突變體都具有依賴于pH的熒光變化，因而可以被用來檢測活細(xì)胞內(nèi)的pH。3.2.2 檢測鹵素離子 YFP（

3、H148Q）變體不但對pH敏感而且對不同離子也同樣敏感，故可以用來檢測亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中鹵素離子的濃度和傳遞17。5. 其他檢測應(yīng)用 另外，GFP可以應(yīng)用于檢測電位、氧化還原水平以及在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中作為Ca2+指示劑18。6. GFP在細(xì)胞生物學(xué)上的應(yīng)用GFP具有同宿主蛋白構(gòu)成融合子的性質(zhì)，利用這一性質(zhì)，可以將GFP定位到特定的細(xì)胞器和膜系統(tǒng)中，進(jìn)行細(xì)胞生理過程、細(xì)胞動力學(xué)等的實時觀測，或直接應(yīng)用于定量分析。7.GFP在篩選方面的應(yīng)用1） GFP用于細(xì)胞的篩選 基于GFP的熒光特性，并且熒光穩(wěn)定以及檢測方法快速、方便，GFP在細(xì)胞篩選上得到應(yīng)用廣泛。2）.GFP用于藥物的篩選 利用GFP對目的物進(jìn)行標(biāo)記

4、，追蹤GFP，分析目的物在細(xì)胞中的變化情況，如酶分子分布狀態(tài)、生物活性、受體、離子通道等變化，從而篩選出與體內(nèi)信號分子功能相似的化合物。一材料1.1試驗儀器1.5mL離心管，0.2mLPCR管，1mL吸頭，100uL吸頭，10uL吸頭，1mL移液器，100uL移液器，10uL移液器，電泳儀，三角瓶，試管，燒杯，量筒，記號筆，IPTG，氨芐青霉素，TAE緩沖液及其配制，瓊脂糖凝膠板及其制備。1.2試驗試劑大腸桿菌菌株：E. coli JM109；E. coli BL21質(zhì)粒：pCAMBIA還有GFP基因，作為模板；pMD19-T克隆載體（T載體），用于PCR產(chǎn)物的克?。籶ET21b大腸桿菌中的表

5、達(dá)載體，表達(dá)外源基因用。培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基。試劑：taqDNA聚合酶，T4DNA連接酶，氨芐青霉素，限制性內(nèi)切酶：EcoRI，HindIII；IPTG；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），大腸桿菌感受態(tài)（takala，大連寶生物公司）；瓊脂糖，TAE buffer，PCR相關(guān)試劑：10Xbuffer，dNTP，Mg2+, H2O。二試驗方法實驗路線：用pCAMBIA載體作為模板-PCR擴增GFP基因- DNA電泳檢測有無PCR產(chǎn)物-PCR產(chǎn)物和T載體連接-轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，涂0.2mL菌液和氨芐青霉素于LB平板，37C培養(yǎng)過夜-含重組質(zhì)粒（p

6、MD18T-GFP）陽性克隆的篩選-陽性菌株接種5mL LB液體試管-37C培養(yǎng)過夜-提質(zhì)粒（質(zhì)粒提取試劑盒）-酶切質(zhì)粒（EcoRI/HindIII），同時將pET21b載體做同樣雙酶切-電泳觀察-回收pET21b載體和GFP基因片段（膠回收試劑盒）-GFP和pET21b連接-轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，涂0.2mL菌液和氨芐青霉素于LB平板，37C培養(yǎng)過夜-挑取陽性克隆-接種5mL LB液體試管，37C培養(yǎng)過夜-提質(zhì)粒-轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-涂0.2mL菌液，IPTG和氨芐青霉素于LB平板，37C培養(yǎng)過夜-此日在紫外線下觀察結(jié)果，看是否有綠色熒光出現(xiàn)在大腸桿菌菌落上。2.1 PCR擴增GFP模板

7、（25ul）2.1.1在滅菌的PCR管里，依次加入：ddH2O 16.5µ l 10× PCR Buffer（含） 2.5µ l Mg2+ 0.5µ l dNTP（10mM） 2µ l引物 1µ l個模板DNA 1µ lTaq酶（5U/µ l） 0.5µ l總體積 25µ l2.1.2混合后按下面程序進(jìn)行擴增 94 5min 94 45s 58 45s(30個循環(huán)) 72 1min30s 72 10min 4 2.1.3 GFP擴增引物：5端引物：CCGGAATTCGATGGTAGATCTGAC

8、 3' EcoR I3端引物：CCCAAGCTTTCACACGTGGTGGTG 3 Hind III2.2電泳取8µl采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查產(chǎn)物情況2.3和PMD-18T連接轉(zhuǎn)化E.coliJM109挑選陽性克隆培養(yǎng)取5µlPCR擴增產(chǎn)物與大腸桿菌感受態(tài)混合均勻，在0吸附30分鐘，在42熱激30秒（大腸桿菌膨脹，細(xì)胞表面DNA進(jìn)入細(xì)胞），再在0保溫2-3分鐘（使細(xì)胞收縮，防止進(jìn)入細(xì)胞的DNA再出來），加入20µlLB培養(yǎng)基在37的溫度條件下在搖床上震蕩45分鐘，取出一定量的培養(yǎng)物涂平板，培養(yǎng)12-16小時。2.4提質(zhì)粒2.4.1取15毫升個過夜培養(yǎng)的菌

9、懸液,加入離心管中,12000rpm離心1分鐘，盡量吸去上清。注意：如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?0kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，同時按比例增加BufferP1,P2,N3的用量；可以適當(dāng)延長吸附和洗脫時間，以提高洗脫效率。2.4.2向留有菌體沉淀的離心管中加入250微升BufferP1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。注意：如果細(xì)菌未徹底混勻，將會影響裂解效果，使提取量和純度偏低。2.4.3向離心管中加入250微升BfferP2,溫和的上下顛倒混勻4-6次，使菌體充分裂解，此時菌液應(yīng)變的清亮粘稠。所用時間不應(yīng)超過5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。注意：不要劇烈震蕩，以免造成所提質(zhì)粒中出現(xiàn)

10、基因組DNA污染。如果溶液未變的清亮，提示可能菌量過大，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。2.4.4向離心管中加入350微升BufferN3，立即溫和的上下顛倒4-6次，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000rpm離心10分鐘，此時在離心管底部形成沉淀。注意：BufferN3加入后應(yīng)立即充分混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中和還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。2.4.5柱平衡：向已裝入收集個管的吸附柱中加入200微升BufferPS，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。2.4.6將步驟4中所得上清液加入到已裝入收集管的吸附中，注意不要析出沉淀，12000rpm離心

11、1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。2.4.7向收集管中加入600微升BufferPW，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的液體。2.4.8重復(fù)步驟7。2.4.9將吸附柱重新放回收集管中，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底涼干。注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇?xì)埩魰绊懞罄m(xù)的酶促反應(yīng)。2.4.10將吸附柱置于一個新的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50100微升BufferEB，室溫放置數(shù)分鐘，12000rpm離心1分鐘，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。-20保存質(zhì)粒.注意1)為了增加質(zhì)粒的回收效率,可將得到的溶液重

12、新加入到吸附柱中,重復(fù)步驟10.BufferEB在65-70水域預(yù)熱，適當(dāng)延長吸附和洗脫時間，可以增加提取效率。2)洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水作洗脫液，應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5，pH值低于7會影響洗脫效率。3）如果使用TE洗脫，需要考慮其中含有的EDTA是否會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)。2.5表達(dá)載體和目的蛋白的酶切酶切質(zhì)粒（EcoRI/HindIII），同時將pET21b載體做同樣雙酶切。2.6膠回收試劑盒組成Dp209_02(50次)Dp209_-3(200次)平衡液LB30ml120 ml溶液膠PN50 ml2*100 ml漂洗液pw15 ml50 ml洗脫緩沖液EB15

13、 ml30 ml吸附柱CA250個200個收集管（2ml）50個200個說明書1份1份2.6.1將單一目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切出多余部分），放入干凈的離心管中，稱取重量。注意：若膠塊的體積過大，可將膠塊切成碎塊。2.6.2向膠塊中加入3倍體積BufferPG:當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度2時，建議使用6倍體積BufferPG。2.6.3 50孵育10分鐘，其間不斷溫和的上下顛倒離心管，以確保膠塊充分溶解。入股還有微解的膠塊，可再補加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾分，直至膠塊完全溶解。2.6.4 柱平衡：向已裝入收集管中的吸附柱中加入200微升BufferPs，12000rpm離心2分鐘，倒掉艘集管

14、中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。2.5.5將步驟3或步驟4中所得溶液加入到已裝入收集管的吸附柱中，室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘，倒掉吸附柱中的廢液，將吸附柱放回收集管中。2.6.6向吸附柱中加入650微升BufferPW,12000rpm離心1分鐘，倒掉吸附柱中的廢液，將吸附柱放回收集管中。2.6.7 12000rpm離心2分鐘，倒掉吸附柱中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底涼干。注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇?xì)埩魰绊懞罄m(xù)的酶促反應(yīng)。2.6.8將吸附柱放到一個新離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50微升BufferEB(pH8.5),室溫放置2分鐘，1

15、2000rpm離心2分鐘，收集DNA溶液。-20保存DNA。注意：1）洗脫液的pH值對于洗脫效率喲很大影響。若用水作洗脫液，應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5。2）為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，重復(fù)步驟10。3）洗脫體積不應(yīng)小于30微升，體積過少會影響洗脫效率。4）如果用TE脫，需要考慮其中含有的EDTA是否會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)。5）回收大于10kb的DNA片段時，BufferEB應(yīng)在50水浴中預(yù)熱，適當(dāng)延長吸附和洗脫時間，可增加回收效率。2.7 重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.7.1 jm109 和BL-21感受態(tài)細(xì)胞的制備1) 將04 保存的jm109和BL-21菌種分別接種

16、在LB液體培養(yǎng)基中37 下250 r/min過夜培養(yǎng)16 h 。2) 將分別接種過夜菌：LB按1:50的比例接種于2 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 活化培養(yǎng)23 h至OD=0.30.5 。3) 取1.5 mL菌液轉(zhuǎn)入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 下5000 r/min離心5 min。棄上清液，沉淀加入0.1 mL預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2緩和懸菌。冰上放置15-30 min后，4 下5000 r/min離心10 min。4) 棄上清液，沉淀用0.1 mL預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）緩和懸菌，放在20 冰箱內(nèi)保存。2.7.1 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化1)

17、取制備好的感受態(tài)細(xì)胞100 l，冰上解凍，均勻懸浮。2) 加入2 l酶連產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上靜置10-30 min。3) 42 水浴中熱擊70 sec后，冰上放置2 min。4) 加入200 l LB液體培養(yǎng)基，37 ，50-100 rpm振蕩培養(yǎng)1 h。5) 取200 l懸浮細(xì)胞涂布在含合適抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，用涂布器均勻涂布，平皿正放靜置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 培養(yǎng)倒置12-16 h。2.7.3 堿法提質(zhì)粒1) 感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，平皿內(nèi)有但菌落長出。2) 用滅菌吸頭挑取單菌落，浸沒于2 mL含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 , 180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。3

18、) 取1.5 ml 培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機于4 、11000 r/min 離心1分鐘，吸棄上清。4) 向離心管中加入150 ml用冰預(yù)冷的溶液，用微量移液器吹打重懸沉淀。5) 加入200 ml新配制的溶液 ，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，冰上放置5分鐘。6) 加入150 ml用冰預(yù)冷的溶液 ，輕輕混勻，冰上放置35分鐘。7) 用微量離心機于4 、11000 r/min離心5分鐘，吸取上清轉(zhuǎn)移到另一離心管。8) 加等體積氯仿400 ml抽提，振蕩混勻，用微量離心機于4 、11000 rpm離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。9) 吸取上清液300 ml，向上清中加入2倍體積的無水

19、乙醇，混勻后，于室溫放置2分鐘；用微量離心機于4 、11000 rpm離心5分鐘，棄上清。10) 用70%乙醇洗滌2次，再次4 、11000 rpm離心5分鐘，沉淀于空氣中干燥。向已干燥的離心管內(nèi)加20 ml超純水溶解質(zhì)粒DNA，加入2 ml 10 mg/ml RNA酶，37 處理1小時后于-20 貯存。2.7.4 酶切鑒定1) 取提取的質(zhì)粒8 ml于另一微量離心管中，加入2 ml Bam H I和Not I的酶切混合液，輕彈管外混勻反應(yīng)物。2) 離心，使溶液聚集在管底部。3) 37 ，酶切反應(yīng)。2.7.5 瓊脂糖凝膠電泳1) 稱取0.8 g瓊脂糖，放入到錐形瓶中，加入100 mL 1

20、5;TAE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全融化，冷卻至60 左右。2) 輕緩倒入封好兩端和加上梳子的電泳膠板中，靜置冷卻30分鐘以上。3) 將膠板除去封膠帶，加電泳緩沖液至電泳槽中，加液量要使液面沒過膠面1-1.5毫米，輕輕拔除梳子。4) 吸取10 ml的質(zhì)粒與2 ml的上樣液混勻，吸取混合液將加入加樣孔。5) 接通電泳槽與電泳儀的電源，設(shè)置電泳數(shù)據(jù)U=100 V, I=30 mA。6) 當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動到距凝膠前沿1-2 cm處，停止電泳。7) 在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果。2.7.6 PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1) 將PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反應(yīng)體系各成分PCR反應(yīng)體系各成分

21、的量template0.1 mlP1(20 mM)0.2 mlP2(20 mM)0.2 mldNTPs(10 mM)0.4 mlTaqs(5 U/ml)0.2 ml10×PCR buffer2 mlddH2O16.9 mlTotal20 ml2) 將PCR管放入PCR儀中，設(shè)定PCR儀的循環(huán)參數(shù)。預(yù)變性95 3 min，變性95 30 s，退火60-55 30 s，延伸72 1 min 10個循環(huán)，每個循環(huán)降0.5 。變性95 30 s，退火55 30 s，延伸72 1 min 20個循環(huán)，72 延伸 2 min。3) PCR擴增完畢后，取出PCP管放在冰盒上。4) 取8 ml擴增后

22、產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。2.7.7 pET-21b-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌jm109 1) 取100 l感受態(tài)jm109，冰上慢速解凍，均勻懸浮。加入2 l經(jīng)過酶切鑒定成功提取重組質(zhì)粒pET-28a-GFP，輕輕混勻，冰上靜置10-30 min。2) 42水浴熱激70 s，冰上放置2 min。3) 加入200 l 含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37 ，60 r/min震蕩培養(yǎng)30 min。4) 吸取200 l菌液涂布于含抗生素的LB平板上，用涂布器均勻涂布，平皿正放靜置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 培養(yǎng)倒置12-16 h。2.8轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，重組綠色熒光蛋白（GFP）的誘導(dǎo)

23、表達(dá)。1) 挑選陽性克隆，取GFP重組菌接種于5 ml LB培養(yǎng)液(含Kana 100 mg/l)中，37 150-220 r/min過夜培養(yǎng)。2) 取100 l感受態(tài)BL21，冰上慢速解凍，均勻懸浮。加入2 l經(jīng)過酶切鑒定成功提取重組質(zhì)粒pET-28a-GFP，輕輕混勻，冰上靜置10-30 min。3) 42水浴熱激70 s，冰上放置2 min。4) 加入200 l 含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37 ，60 r/min震蕩培養(yǎng)30 min。5）吸取200ul菌液在涂有氨芐青霉素和IPTG培養(yǎng)基LB平板繼續(xù)培養(yǎng)，37過夜. 4） 用紫外線照射菌體沉淀，保存照片。三實驗結(jié)果和分析在紫外燈的照射下，

24、培養(yǎng)基呈現(xiàn)綠色熒光。實驗成功。參考文獻(xiàn)1 梁國棟. 最新分子生物學(xué)實驗技術(shù) M . 北京: 科學(xué)技術(shù)出版社, 2001, 174.2 賈艷華，李國勛，張杰 熒光蛋白及其應(yīng)用3 Katharine Sanderson 2008 年諾貝爾化學(xué)獎成果:綠色熒光蛋白(GFP)的研究分子植物育種 624 Shimomura O,Johnson FH,Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, abioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea J.

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