臨床常見微生物標本采集法及影響臨床微生物檢驗的因素

1、臨床常見微生物標本采集法及影響臨床微生物檢驗的因素引子： 流行病學調(diào)查顯示，臨床感染病原菌種類不斷發(fā)生變化，對抗微生物藥物的耐藥性不斷增強，因此，臨床醫(yī)生在抗感染治療中越來越重視病原學的檢測，對微生物室的工作要求越來越高。微生物室任務越來越愛繁重。臨床醫(yī)生要求微生物室應做到： 菌種鑒定準確 藥敏試驗準確 回報結(jié)果快速及時 做好咨詢與解釋工作螺旋體螺旋體 衣原體衣原體 支原體支原體 病病 毒毒真菌真菌 細菌細菌病原體常見病原體種類流 程 微生物學檢查個體治療感染性標本 診斷及鑒別診斷感染性疾病 在細菌檢驗中，許多因素可以影響檢測結(jié)果的準確性，我們在工作時應當加以注意，主要包括以下幾個方面： 標本

2、的采集與運送 細菌的鑒定及藥敏試驗 結(jié)果的審核與報告 標本的采集與運送對于檢驗結(jié)果的重要性標本的采集與運送對于檢驗結(jié)果的重要性 正確的采集與運送標本是保證檢驗結(jié)果準確的最基本條件，如果得不到一份合格的標本，鑒定及藥敏結(jié)果再準確，結(jié)果也是不可信的。而從目前狀況看，采集一份合格的標本，不是一件容易的事情，微生物檢驗標本的正確采集、運送及處理，與細菌的培養(yǎng)、鑒定結(jié)果有十分密切的關系，醫(yī)生、護士、檢驗人員均應重視微生物標本的正確采集的有關問題,并有責任向患者及家屬進行正確采集標本的宣傳和指導.典型案例 我們在臨床檢驗工作當中遇到過這樣的事情，腦積水患兒準備進行手術，術前三次腦脊液培養(yǎng)均分離出表皮葡萄球

3、菌，腦脊液常規(guī)檢查正常，污染菌？病原菌？臨床請求會診。 標本采集運送中的影響因素 抗微生物藥物對標本的影響 抗菌藥物抑制細菌生長，影響檢出率，應當在應用抗微生物藥物之前采集標本，或者停藥35天采集標本，或在血漿藥物濃度最低時采集標本。 標本留取是否正確 無菌部位的標本采集是要嚴格消毒，無菌操作，避免污染。如：血液、無菌體液。主要注意兩個方面，一是穿刺部位的消毒，二是在將標本注入容器時的無菌操作。 如： 肺感染 痰 泌尿系感染尿 膿腫膿汁 顱內(nèi)感染腦脊液 發(fā)熱血、骨髓、尿等臨床實驗室細菌分類需氧、微需氧或兼性厭氧菌非苛養(yǎng)菌：包括腸桿菌科細菌、假單胞類非發(fā)酵菌、不動桿菌、葡萄球菌屬、腸球菌屬、鏈球

4、菌屬（不含肺炎鏈球菌）苛養(yǎng)菌：嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌厭氧菌 標本采集和運送標本采集的時間、部位、種類和數(shù)量注明相關信息（由各種病原體所致感染性疾病的病程來決定）微生物標本采集、運送、驗收和處理注意事項 1、標本采集（1）申請單必須標記清楚姓名、性別、年齡、病原號、標本來源（具體寫明）、檢查項目（目的要明確）檢查項目（目的要明確）等，以便試驗室能夠合理選擇培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)基。（2）盡量在抗生素應用前采集標本、以提高陽性檢盡量在抗生素應用前采集標本、以提高陽性檢出率和避免漏檢。出率和避免漏檢。（3）標本采集應嚴格執(zhí)行無菌操作。（4）采集標本的容器必須經(jīng)滅菌處理，不可用消毒劑。

5、 2、標本運送（1）標本采集后應盡快運送到細菌室。（2）標本采集后在室溫下超過室溫下超過2 2小時小時未送到細菌室的，可視為不合格標本。 3、標本驗收（1）實驗室只接受和處理合格標本。（2）實驗室對不合格標本退回必須說明原因、并及時與臨床聯(lián)系。注意事項 （1）微生物檢驗樣本必須要求采集轉(zhuǎn)運，否則將影響檢查結(jié)果，并給評價其意義帶來麻煩甚至誤導。 （2）微生物樣本極易被污染，污染的樣本雜菌大量繁殖抑制病原菌生長，條件致病菌也是致病菌，如污染條件致病菌將誤導臨床，造成對患者的損害以及經(jīng)濟和時間的浪費。 （3）某些標本離體極易死亡，應在床邊采取和接種或立即保溫送至實驗室檢驗。室溫放置或延遲送檢，可使檢

6、出的陽性率降低；不能使用冷藏的樣本檢驗。 （4）厭氧菌樣本采取必須隔絕空氣，混入空氣的樣本影響檢驗結(jié)果，不能使用。血液標本血液標本 正常人血液是無菌的，血液標本病原學檢查有助正常人血液是無菌的，血液標本病原學檢查有助于菌血癥、敗血癥的診斷和疑由菌血癥所致其他癥于菌血癥、敗血癥的診斷和疑由菌血癥所致其他癥狀，如皮疹、肝脾腫大、關節(jié)疼痛、昏迷休克等的狀，如皮疹、肝脾腫大、關節(jié)疼痛、昏迷休克等的鑒別診斷。并通過藥敏試驗為臨床治療提供合理的鑒別診斷。并通過藥敏試驗為臨床治療提供合理的抗生素選擇抗生素選擇。 采集時間發(fā)熱初期發(fā)熱初期寒戰(zhàn)期寒戰(zhàn)期抗生素應用之前抗生素應用之前下次用藥之前下次用藥之前臨床常見

7、的采血指徵 發(fā)熱（38c）或低溫（36c） 寒戰(zhàn) 白細胞增多（計數(shù)大于10，000109/l，特別有“核左移” 未成熟的或桿狀核的白細胞） 粒細胞減少（成熟的多核白細胞1000109/l） 血小板減少 皮膚粘膜出血 昏迷 ，休克多器官衰竭 crp升高采血指徵指徵 采集方法采集方法2.采樣量：不少于培養(yǎng)基的1/10。成人采血510ml骨髓1-2ml兒童采血15ml 3.培養(yǎng)要求：除有明確的感染特征，應同時送需氧、厭氧培養(yǎng)。1 1.采血部位：肘靜脈：無菌采集，1-3次其他部位：亞急性心內(nèi)膜炎等病人，從肘動脈或股動脈等多次采血標本采集后立即送檢標本采集后立即送檢, , 不宜存放于冰不宜存放于冰箱箱。

8、標本運送標本運送采集數(shù)量對結(jié)果的影響因素 血培養(yǎng)的數(shù)量研究表明，當每套血培養(yǎng)采血20ml時一套檢出率：65%二套檢出率：80%三套檢出率：96%目前的指南推薦采集23套血培養(yǎng)一套血培養(yǎng)瓶（一套血培養(yǎng)瓶（blood culture setblood culture set）：血培養(yǎng)瓶接種的是同一來源的）：血培養(yǎng)瓶接種的是同一來源的標本（同一穿刺）標本（同一穿刺） principle and procedure for blood culture ， clsi， m47-p, 2006how many blood culture sets should be drawn?需要抽取多少份血培養(yǎng)樣本？

9、需要抽取多少份血培養(yǎng)樣本？ 抽取2-3份血培養(yǎng)樣本可使敗血癥病原菌檢出率達到 99%敗血癥患者在初期千萬不要（never draw only 1 blood）僅抽取一瓶血培養(yǎng)注意：“份”是指單獨的靜脈穿刺的數(shù)量。 懷疑急性原發(fā)性菌血癥真菌菌血癥腦膜炎 2或3份血培養(yǎng)骨髓炎關節(jié)炎肺炎 采血份數(shù)采血份數(shù)徐英春，倪語星等。血培養(yǎng)操作規(guī)范，上?？茖W技術出版社，2002,1-31血培養(yǎng)份數(shù)和時間不明病源的發(fā)熱，如：隱性膿腫 采集2或3份 傷寒熱波浪熱 估計體溫升高之前 （下午） 再采2份以上 24h24h至至36h36h后后徐英春，倪語星等。血培養(yǎng)操作規(guī)范，上?？茖W技術出版社，2002,1-31血培養(yǎng)份

10、數(shù)和時間 1h2h內(nèi) 采集3份 24h后陰性 再采3份以上 前前2周周用抗生素用抗生素第第1天天 第第2天天 第第3天天2份份2份份2份份急性心內(nèi)膜炎急性心內(nèi)膜炎徐英春，倪語星等。血培養(yǎng)操作規(guī)范，上海科學技術出版社，2002,1-31或可疑亞急性心內(nèi)膜炎患者每間隔一個小時采集一份,共采集3份標本.送檢目的：送檢目的：有助于泌尿系感染的診斷和鑒別診斷有助于泌尿系感染的診斷和鑒別診斷 尿液標本尿液標本采集時間細菌培養(yǎng)在未使用抗生素前取晨尿，結(jié)核細菌培養(yǎng)在未使用抗生素前取晨尿，結(jié)核分枝桿菌檢查應停用抗結(jié)核藥物分枝桿菌檢查應停用抗結(jié)核藥物1 12 2天后天后留留24h24h尿送檢尿送檢. .因尿道口寄

11、居有正常菌群,故采集標本應避免雜菌污染。晨起第一次中段尿，保證尿液在膀胱內(nèi)停留時間4小時以上，留尿前 清洗外陰，排尿過程不要中斷，避免污染。培養(yǎng)后有四種以上細菌生長，考慮污染，防止在尿袋中直接采集尿液標本。尿液標本要定量報告 將尿液標本接種于增菌液中或離心后取沉渣進行培養(yǎng)都是錯誤的。采集辦法采集辦法尿液標本的采集方法有:1.中段尿采集法2.導尿法、3.腎盂尿采集法、4.膀胱穿刺尿采集法、5.24h留尿法 中段尿采集法最常用的方法，女性患者用中段尿采集法最常用的方法，女性患者用肥皂水沖洗外陰及尿道口肥皂水沖洗外陰及尿道口; ; 男性患者用肥皂男性患者用肥皂水沖洗尿道口，排出前段尿，再收集中段水沖

12、洗尿道口，排出前段尿，再收集中段尿尿 3 35ml5ml于無菌容器內(nèi)送檢于無菌容器內(nèi)送檢。 中段尿采集法中段尿采集法使用導尿管導尿是一種較好的無菌采集法,可以防止雜菌染。導尿法導尿法用導尿管采集腎盂尿,用于確定菌尿是否來自腎臟。首先充分沖洗膀胱,以最后一次沖洗尿作對照,然后用導尿管插入輸尿管,分別標記左右側(cè),收集三次尿;如果輸尿管菌數(shù)比對照管菌數(shù)多或第三次尿中菌數(shù)比第一次多,該菌尿可能來自腎臟。反之，則可能來自膀胱。 腎盂尿采集法腎盂尿采集法將病人恥骨上皮膚經(jīng)碘酒消毒后，以無菌空針作膀胱穿刺。主要用于尿液厭氧菌的培養(yǎng)，也可用于采集中段尿困難者或培養(yǎng)結(jié)果與患者病情有矛盾時。 膀胱穿刺尿采集法膀胱

13、穿刺尿采集法用一潔凈容器，留取24h尿液，取其沉淀部份盛于清潔瓶內(nèi)送檢。主要用于結(jié)核分枝桿菌的檢查。 24h24h留尿法留尿法尿菌落計數(shù)低于標準時應考慮如果尿培養(yǎng)菌落數(shù)較少 除考慮污染因素外，還可能有以下原因： 用抗生素治療 尿液稀釋 尿ph8.5細菌生長受阻 尿頻，在膀胱貯存時間短，菌落數(shù)少 尿道口消毒液混入標本中 標本采集后立即送檢(1h內(nèi)), 不能立即運送者應存放在4冰箱內(nèi)保存。 標本運送標本運送糞便標本糞便標本送檢目的：糞便標本病原學檢查有助于對一些腸道感染性疾病進行病原學診斷和鑒別診斷；為臨床治療提供合理的抗生素選擇；及對腸道菌群進行監(jiān)測，預防菌群失調(diào)。 總體原則：應在腹瀉急性期(3

14、天內(nèi))及用藥前采樣。 1、腹瀉患者于急性期，盡量在用藥前采 集糞便。 2、傷寒患者于發(fā)病2周后采集糞便。 3、懷疑霍亂時立即采集糞便送檢。采集時間采集時間1. 1.自然排便采集法：自然排便采集法：自然排便后，固體糞便挑取膿血、粘液部份23；液體糞便取絮狀物23ml，盛于無菌容器內(nèi)送檢。 2.2.直腸拭子法：直腸拭子法：對不易獲取糞便者，將無菌棉簽用甘油鹽水濕潤后，插入肛門內(nèi)45cm(幼兒23cm)處，輕輕旋轉(zhuǎn)，擦取直腸表面粘液后取出,插入無菌試管或保存液中送檢。 采集方法采集方法標本采集后應立即送檢(1小時以內(nèi)), 不能立即送檢時應放入ph7.0的磷酸鹽甘油中保存。 標本運送標本運送呼吸道標本

15、呼吸道標本上呼吸道標本：咽拭子、鼻拭子下呼吸道標本：痰上呼吸道標本：上呼吸道標本：最好在清晨，用清水漱口，由檢查者將舌最好在清晨，用清水漱口，由檢查者將舌向外拉，使懸雍垂向外牽引，用無菌棉拭向外拉，使懸雍垂向外牽引，用無菌棉拭子在扁桃體區(qū)域、咽后壁及口腔潰瘍處局子在扁桃體區(qū)域、咽后壁及口腔潰瘍處局部反復涂抹采樣，然后放入無菌試管內(nèi)立部反復涂抹采樣，然后放入無菌試管內(nèi)立即送檢即送檢。采集辦法采集辦法下呼吸道標本：下呼吸道標本：要求采集肺深部的痰液, 避免采到唾液，常見方法：自然咳痰法：最好采集晨痰, 在取標本之前, 用清水反復漱口幾次，再從氣管深部咳出第一口痰，盛入無菌容器中立即送檢。氣管鏡采集

16、法：在病灶附近用導管或用支氣管刷直接取得標本。小兒采集法：用彎壓舌板向后壓舌，用無菌棉拭深入咽部，小兒經(jīng)壓舌刺激咳嗽時，可噴出肺部和氣管分泌物，粘在棉拭上，將棉拭放入無菌管中立即送檢。氣管穿刺法：通過氣管穿刺取得痰液，主要用于厭氧菌培養(yǎng)。 通常以自然咳痰法采集標本最常見。應囑咐患者晨起漱口，咳深部痰，告知唾液的培養(yǎng)結(jié)果對臨床無指導意義，以便引起患者對留取標本的重視。檢驗痰液標本是否合格應進行涂片。涂片合格后的痰標本建議使用鹽水稀釋方法接種于相應培養(yǎng)基上 痰涂片顯微鏡檢查判別標準分類細胞數(shù)/低倍視野標本判別白細胞鱗狀上皮細胞a 2510合格，用于細菌培養(yǎng)b251025尚合格，可用于細菌培養(yǎng)c10

17、 25不合格，建議重送標本標本采集后應立即送檢, 以防某些細菌在外環(huán)境中死亡。作結(jié)核分枝桿菌或真菌培養(yǎng)的痰液如不能及時送檢，應置于4冰箱保存。 標本運輸標本運輸分級劃線區(qū)菌落數(shù)目1區(qū)2區(qū)3區(qū)少見（1+）10少量（2+）105中量（3+）1055多量（4+）1055 痰標本在平板上的菌落量化指標注：1+ 多為污染，2+ 污染可能，3+ 感染可能，4+多為感染病原菌一般應在用藥之前或停止用藥12天后采集標本。1、腦脊液標本（1）采集時間：懷疑腦膜炎時應立即采集腦脊液，最好是在應用抗生素之前采集腦脊液。（2）采集方法:無菌腰穿采集腦脊液腦脊液1-3ml1-3ml注入血培養(yǎng)瓶注入血培養(yǎng)瓶中中。2、穿刺

18、液標本（1）穿刺液標本包括胸腹水、關節(jié)液等。（2）無菌操作穿刺抽取標本1ml立即送檢。3、胃液及膽汁：抽取5ml左右后置于無菌管中立即送檢。4、深部膿液：用無菌注射器抽取后立即送檢。腦脊液與其他無菌體液標本腦脊液與其他無菌體液標本 采集方法采集方法1.腦脊液標本：無菌操作腰椎穿刺，抽取腦脊液23ml于無菌試管中送檢。其它無菌體液標本以無菌操作抽取標本送檢。2.其他無菌性體液：無菌操作（漿膜腔穿刺液）大量留取腦脊液標本采集后應立即保溫送檢或床旁接種, 不宜置于冰箱保存。 胸水、腹水等無菌體液標本采集后立即送檢或置于冰箱4保存。 腦脊液不能存放于標本腦脊液不能存放于標本其他標本可放于冰箱保存其他標

19、本可放于冰箱保存 立即送檢立即送檢標本運輸標本運輸眼、耳部標本眼、耳部標本 無菌采集 拭子采樣 局部麻醉后取角膜刮屑 立即送檢 一般應在用藥之前或停止用藥710天采集標本。泌尿生殖道標本泌尿生殖道標本 男性尿道拭子男性尿道拭子女性宮口取材女性宮口取材按摩前列腺按摩前列腺采集方法采集方法男性尿道口分泌物：先用生理鹽水局部清洗，用無菌棉拭插入尿道口12cm，停留半分鐘，輕輕旋轉(zhuǎn)采集標本女性陰道及宮頸口分泌物：則需在窺陰器下操作,用長的無菌棉拭采集分泌物前列腺液：按摩標本采集后應立即送檢或放于保存液中置4冰箱內(nèi)保存（淋球菌培養(yǎng)除外）。 標本運送標本運送創(chuàng)傷、組織、和膿腫標本創(chuàng)傷、組織、和膿腫標本最好

20、在抗生素使用之前采集標本。在創(chuàng)傷出血時、敷用藥物2h內(nèi)及燒傷后12h內(nèi)不應采集標本。總體取材原則：取接近新生組織處的標本，既可以提高陽性率，又能獲得該部感染病原菌，中心部位的膿汁，由于營養(yǎng)差，不利于細菌生長，陽性率低。開放部位的膿汁采集，應首先用無菌生理鹽水沖洗表面污染菌，然后擠壓深部組織里的膿汁進行培養(yǎng)。取組織進行培養(yǎng)最好。1. 清創(chuàng)、消毒2.大面積創(chuàng)傷：多部位采樣3.封閉性膿腫：無菌注射器抽取4.開放性膿腫：無菌棉拭子采集膿液及病灶深部的分泌物，5.瘺管：取組織碎片6. 厭氧菌感染：應采集深部膿液并隔絕空氣運送。排凈注射器內(nèi)空氣，針頭插入無菌橡皮塞送檢采集方法采集方法傷口標本采集要求 1、

21、在傷口切開排膿時留取標本 2、不能在傷口清潔消毒后留取標本 3、盡量采集傷口深部的濃汁送檢組織或吸取物中革蘭染色的評價鏡下所見備注出現(xiàn)鱗狀上皮細胞標本采集技術不過關，培養(yǎng)提示皮膚菌群污染大量中性粒細胞長時間仔細尋找病原菌，這時菌有可能在細胞內(nèi)大量的中性粒細胞，混合g-和g+小細菌混合厭氧或兼性厭氧菌感染少見或可見破損的中性粒細胞和粗大g不定的或g+b可能是梭菌屬細菌引起的組織壞死，手術應激，提示產(chǎn)期莢膜梭菌引起的氣性壞疽中性粒細胞罕見，無其他體細胞病人沒能產(chǎn)生足夠的免疫反應，或細菌沒有能激活中性粒細胞（如球菌），仍然高度懷疑細菌感染細胞內(nèi)微生物活動性細菌感染小的、淺的、不規(guī)則、鏈狀排列g+c呈

22、堆排列如果分離自膿腫,提示咽峽炎鏈球菌群(米勒鏈球菌)很細小g-b特別是如果標本為淋巴結(jié)或組織時，這些菌可能為生物恐怖病原菌（布氏桿菌，耶爾森菌，弗朗西斯菌），標本須在安全柜里處理。平皿需用膠帶封起來，培養(yǎng)物只能在生物安全柜中進行。不可聞平皿。膿液標本采集后應立即送檢或存放于保存液中。 標本運輸標本運輸影響微生物檢驗的其它因素 標本容器是否合格應該采用無菌、清潔、干燥、無溢漏的容器盛裝標本，血液、骨髓、無菌體液等標本采用儀器法培養(yǎng)時，應將標本直接注入特定培養(yǎng)瓶中，但在注入標本之前，應該將瓶塞進行消毒。 根據(jù)標本的種類選擇合適的容器。 厭氧菌培養(yǎng)，應將標本置厭氧環(huán)境容器中送檢，以免厭氧菌接觸空氣

23、死亡 送檢時間 標本 采集后應立即送檢，一般細菌培養(yǎng)送檢時間不應超過 2小時，苛養(yǎng)菌應在30分鐘內(nèi)送檢，否則，細菌死亡，導致培養(yǎng)結(jié)果陰性。對于客觀條件限制，不能立即送檢的標本，應用轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基保存標本送檢。血培養(yǎng)標本應放置室溫保存。 標本采集的量要符合標準 太少：捕捉細菌的幾率少；太多：與培養(yǎng)基比例不適當，營養(yǎng)供給不足不合格標本的處理 標本標識與申請單不一致； 采集的標本與申請單不一致； 非無菌容器留取的標本或采用不合格的容器； 容器中無標本； 將有菌容器的標本重新倒入無菌容器； 盛標本的容器未加蓋； 取材后將標本放置時間過長； 換藥后取材； 從輸液管直接采集標本； 正在點滴抗菌藥物過程中采集血

24、液標本； 用注射器直接送檢血液標本； 從尿液收集袋中直接抽取標本； 用拭子采集厭氧菌標本； 對于這些不合格的標本實驗室應拒絕接受，在拒絕接受的同時，要及時通知臨床醫(yī)生或護士，說明標本采集不合格的原因，并給予正確指導。 血平板：適合于各類細菌生長 巧克力平板：含v、x因子 中國藍平板或伊紅美蘭平板：弱選擇性培養(yǎng)基 麥康凱平板：中等強度選擇培養(yǎng)基 ss瓊脂平板：強選擇培養(yǎng)基 堿性瓊脂或tcbs瓊脂：弧菌 血液增菌培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯 厭氧平板 標本接種 平板培養(yǎng)基在使用前應放孵育箱中烘干表面的水分， 取材 接種方式：不同的標本有不同的要求 培養(yǎng)環(huán)境：氣體（氧氣，co2，）、厭氧、溫度、濕度 培養(yǎng)時間

25、病原菌的選擇及純化 根據(jù)標本來源不同，選擇有臨床意義的病原菌，特別注意有正常菌群部位標本中病原菌的選擇（如痰、咽、糞便標本）。將挑選出的細菌分純、涂片后進行菌種鑒定。 結(jié)果回報結(jié)果回報 審核：包括患者信息和檢驗結(jié)果及報告內(nèi)容。 核對患者的信息資料：如姓名、性別、年齡、標本種類、檢驗項目等。 病人結(jié)果的確認：審核菌種和所測試的藥敏結(jié)果，包括以下內(nèi)容： 藥敏結(jié)果與菌株鑒定是否一致 單個藥敏結(jié)果與特定藥物種類中活性規(guī)則層次是一致的（如三代頭孢菌素對腸桿菌科細菌抗菌活性高于一、二代頭孢菌素）。 分離株未被證明耐藥及“僅有敏感”解釋標準的藥物是敏感的，如化膿性鏈球菌和無乳鏈球菌對萬古霉素是敏感的；頭孢噻肟和頭孢曲松對流感嗜血桿菌是敏感的。 出現(xiàn)非常見或者不一致結(jié)果，應分析錯誤原因： 謄寫錯誤 試劑污染 查找非常見或不一致結(jié)果