實(shí)驗(yàn)5、葉綠體色素的提取及含量測(cè)定

1、 1、提取原理：提取原理：葉綠體色素是酯類(lèi)化合物均不溶葉綠體色素是酯類(lèi)化合物均不溶于水，而溶于含有水的有機(jī)溶劑，故常用于水，而溶于含有水的有機(jī)溶劑，故常用95的酒精和的酒精和80丙酮提取，或用酒精、丙酮和水丙酮提取，或用酒精、丙酮和水的混合液提取。葉綠體色素易受光氧化，提取的混合液提取。葉綠體色素易受光氧化，提取色素應(yīng)在弱光中進(jìn)行，并避光保存色素。新鮮色素應(yīng)在弱光中進(jìn)行，并避光保存色素。新鮮的葉片可用無(wú)水丙酮提取。葉干粉用的葉片可用無(wú)水丙酮提取。葉干粉用85丙酮丙酮提取。提取。 根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收，利用分光光根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)下

2、測(cè)定其消光度，即可用公式計(jì)算出提度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)下測(cè)定其消光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。取液中各色素的含量。 根據(jù)朗伯根據(jù)朗伯比爾定律，某有色溶液的消光度比爾定律，某有色溶液的消光度 D 與其中溶質(zhì)與其中溶質(zhì)濃度濃度 C 和液層厚度和液層厚度 L 成正比，即：成正比，即： D = kCL （ 1 ） 式中：式中： k 為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為厚度為 1cm 時(shí)，時(shí)， k 為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)可通過(guò)測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)液在不同波長(zhǎng)下的

3、比吸收系數(shù)可通過(guò)測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的消光度而求得。在不同波長(zhǎng)下的消光度而求得。 如果溶液中有幾種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波如果溶液中有幾種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總消光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下消光度的總和，長(zhǎng)下的總消光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下消光度的總和，這就是這就是消光度的加和性消光度的加和性。測(cè)定葉綠體色素混合提取液中。測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素葉綠素 a 、 b 和類(lèi)胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取和類(lèi)胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在液在 3 個(gè)特定波長(zhǎng)下的消光度個(gè)特定波長(zhǎng)下的消光度 D ，并根據(jù)葉綠素，并根據(jù)葉綠素 a 、 b 及類(lèi)胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的比

4、吸收系數(shù)即可求出其濃及類(lèi)胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素度。在測(cè)定葉綠素 a 、 b 時(shí)，為了排除類(lèi)胡蘿卜素的時(shí)，為了排除類(lèi)胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。收峰。 已知葉綠素已知葉綠素 a 、 b 的的 80 丙酮提取液在紅光區(qū)的丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為最大吸收峰分別為 663nm 和和 645nm ，又知在波長(zhǎng)，又知在波長(zhǎng) 663nm 下，葉綠素下，葉綠素 a 、 b 在該溶液中的比吸收系數(shù)分在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為別為 82.04 和和 9.27 ，在波長(zhǎng)，在波長(zhǎng) 64

5、5nm 下分別為下分別為 16.75 和和 45.60 ，根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：，根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式： D 663 = 82.04C a +9.27C b （2 ） D 645 = 16.75C a +45.60C b （ 3） 式中：式中： D 663 和和 D 645 ：葉綠素溶液在波長(zhǎng)：葉綠素溶液在波長(zhǎng) 663nm 和和 645nm 時(shí)的消光度；時(shí)的消光度； C a 和和 C b ：葉綠素：葉綠素 a 和和 b 的濃度的濃度mg/L 。 解方程組解方程組 （2）和）和 （ 3）得：）得： C a = 12.72D 663 2.59D 645 （ 4） C b = 22.

6、88D 645 4.67D 663 （5 ） 將將 C a 與與 C b 相加即得葉綠素總量相加即得葉綠素總量 C T ： C T = C a +C b =20.29D 645 + 8.05D 663 （ 6） 另外，由于葉綠素 a 、 b 在 652mn 的吸收峰相交，兩者有相同的比吸收系數(shù)（均為 34.5 ），也可以在此波長(zhǎng)下測(cè)定一次消光度（ D 652 ）而求出葉綠素 a 、 b 總量： C T = （ D 652 1000 ） 34.5 （ 7 ） 在有葉綠素存在的條件下，用分光光度法也可以同時(shí)測(cè)定出溶液中類(lèi)胡蘿卜素的含量。 Lichtenthaler 等對(duì) Arnon 法進(jìn)行了修正，

7、提出了 80 丙酮提取液中 3 種色素含量的計(jì)算公式： C a = 12.21D 663 2.81D 646 （ 8 ）C b = 20.13D 646 5.03D 663 （ 9 ）C x = （ 1000D 470 3.27C a 104C b ） 229 （ 10 ） 式中： C a 、 C b 葉綠素 a 和 b 的濃度。 C x 類(lèi)胡蘿卜素的總濃度。 D 663 、 D 646 和 D 470 葉綠體色素提取液在波長(zhǎng) 663 nm 、 646 nm 和 470 nm 下的消光度。 由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時(shí)，計(jì)算公式也有所不同。葉綠素

8、a 、 b 在 95 乙醇中最大吸收峰的波長(zhǎng)分別為 665nm 和 649nm ，類(lèi)胡蘿卜素為 470nm ，可據(jù)此列出以下關(guān)系式： C a = 13.95D 665 6.88D 649 （ 11 ） C b = 24.96D 649 7.32D 665 （ 12 ） C x = （ 1000D 470 2.05C a 114C b ） /245 （ 13 ） 二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備 （一）實(shí)驗(yàn)材料 新鮮植物葉片（或其他綠色組織）。 （二）試劑 95 乙醇（或 80 丙酮）。 石英砂。 碳酸鈣粉。 （三）儀器設(shè)備 分光光度計(jì)，研缽 1 套，剪刀 1 把，玻棒， 25 mL 棕色容量瓶 3

9、 個(gè)，小漏斗 3 個(gè)，直徑 7 cm 定量濾紙，吸水紙，擦鏡紙，滴管，電子天平（ 0.01 g 感量）。 1. 取新鮮植物葉片，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。 2. 稱(chēng)取剪碎的新鮮樣品 0.5 g ，分別放入研缽中，加入少量石英砂和碳酸鈣粉及 5ml丙酮，研成勻漿，再加80丙酮5 mL ，繼續(xù)研磨至組織變白，靜止 3 5 min 。 3. 取濾紙 1 張，置漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，過(guò)濾到 25mL 棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?4. 用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色

10、為止。最后用乙醇定容至 25 mL ，搖勻。 5. 把葉綠體色素提取液倒入比色杯內(nèi)。以 95 乙醇為空白，在波長(zhǎng) 665 、 649 和 470 nm 下測(cè)定消光度。 6. 按公式 17 11 、 17 12 、 17 13 （如用 80 丙酮，則按公式 17 8 、 17 9 、 17 10 ）分別計(jì)算葉綠素 a 、 b 和類(lèi)胡蘿卜素的濃度（ mg/L ）， 17 11 、 17 12 式相加即得葉綠素總濃度。 四、結(jié)果計(jì)算 求得色素的濃度后再按下式計(jì)算組織中各色素的含量（用每克鮮重或干重所含葉綠體色素的毫克數(shù)表示）： （ mg/g ） 注意事項(xiàng) 1. 為了避免葉綠素的光分解，操作時(shí)應(yīng)在弱光

11、下進(jìn)行，研磨時(shí)間應(yīng)盡量短些。 2. 葉綠體色素提取液不能渾濁?？稍?710 或 750 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量消光度，其值應(yīng)小于當(dāng)波長(zhǎng)為葉綠素 a 吸收峰時(shí)消光度值的 5 ，否則應(yīng)重新過(guò)濾。 3. 用分光光度計(jì)法測(cè)定葉綠素含量，對(duì)分光光度計(jì)的波長(zhǎng)精確度要求較高。如果波長(zhǎng)與原吸收峰波長(zhǎng)相差 l nm ，則葉綠素 a 的測(cè)定誤差為 2 ，葉綠素 b 為 19 ，使用前必須對(duì)分光光度計(jì)的波長(zhǎng)進(jìn)行校正。校正方法除按儀器說(shuō)明書(shū)外，還應(yīng)以純的葉綠素 a 和 b 來(lái)校正。4. 在使用低檔型號(hào)分光光度計(jì)（如： 72 、 125 、 721 型等）測(cè)定葉綠素 a 、 b 含量時(shí)，因儀器的狹縫較寬，分光性能差，單色光的

12、純度低（ 5 7 nm ），與高中檔儀器如島津 UV-120 、 UV-240 等測(cè)定結(jié)果相比，葉綠素 a 的測(cè)定值偏低，葉綠素 b 值偏高， a b 比值嚴(yán)重偏小。因此，使用時(shí)必須用高檔分光光度計(jì)對(duì)低檔的分光光度計(jì)進(jìn)行校正。 【附注】 葉綠體色素簡(jiǎn)便提取方法 采用上述研磨方法提取葉綠體色素，既費(fèi)工費(fèi)時(shí)，又容易出現(xiàn)誤差。為此，可采用乙醇丙酮混合液浸泡法。其方法是，將待測(cè)葉片剪碎，裝入具塞刻度試管中，加入乙醇丙酮混合液（ 1 l ， v v ） 10 mL ，使葉片完全浸入液體之中，加蓋。放置于暗處，如能置于 30 40 溫箱中更好。當(dāng)葉片完全變白時(shí)即可比色。此法簡(jiǎn)便易行，重現(xiàn)性好，尤其適用于大量樣品的測(cè)定。最好是在浸泡過(guò)程中輕輕搖動(dòng)幾次。思考題思考題 1、為什么提取葉綠素時(shí)干材料一定要用、為什么提取葉綠素時(shí)干材