分子生物學(xué)在獲取中藥有效成分方面的研究與應(yīng)用(精)

1、分子生物學(xué)在獲取中藥有效成分方面的研究與應(yīng)用摘要： 中藥有效成分的提取是中藥研究的一個(gè)重要任務(wù)，一種藥材經(jīng)過(guò)復(fù)雜的分離提取后獲得的有效成分往往十分微量。 如何獲得更多的有效成分是中藥研究的重要內(nèi)容。 分子生 物學(xué)技術(shù)能為此研究提供新的方法， 研究人員通過(guò)尋找中藥有效成分的相關(guān)功能基因， 并通 過(guò)基因工程的方法對(duì)其進(jìn)行高效表達(dá)， 大大提高了中藥有效成分的得率， 并降低了提取成本。關(guān)鍵字：分子生物學(xué) 有效成分 中藥 石斛當(dāng)今， 以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)， 以基因工程為主導(dǎo)的生物技術(shù)正以其巨大的活力推動(dòng) 著生命各學(xué)科的發(fā)展。進(jìn)入 21 世紀(jì)，這一高新技術(shù)，在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域中亦開(kāi)始陸續(xù)被推 廣應(yīng)甩。綜合

2、近幾年國(guó)內(nèi)外的研究 成果，主要有以下幾個(gè)方面：1 分子生物學(xué)與中藥鑒定 中藥的傳統(tǒng)鑒定方法主要依靠基源鑒定、 性狀鑒定、 顯微鑒定以及理化鑒定四大類(lèi)方 法。單純依賴(lài)于以上傳統(tǒng)的鑒定方法， 已經(jīng)不能有效防止中藥的混淆代用和故意偽制的發(fā)生。 基于 DNA 分析的分子鑒定技術(shù)，具有特異性高、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，已成為傳統(tǒng) 鑒定方法的重要補(bǔ)充手段為中藥品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范管理的國(guó)際化開(kāi)創(chuàng)良好開(kāi)端。2 分子生物學(xué)與中藥資源保護(hù) 傳統(tǒng)的藥用植物資源研究，主要采用形態(tài)分類(lèi)學(xué)方法劃分物種。由于此方法僅建立在 個(gè)體形狀描述和宏觀觀測(cè)的水平上，得到的結(jié)論并不完善。通過(guò)引入分子生物學(xué)方法，分 析藥用植物的遺傳特性以及

3、建立遺傳圖譜， 使植物分類(lèi)和資源的研究更加科學(xué)化1。肉蓯蓉 屬名貴中藥材， 主要來(lái)源植物為荒漠肉蓯蓉和管花肉蓯蓉， 目前野生肉蓯蓉資源已僅剩幾 個(gè) 主產(chǎn)區(qū)。通過(guò)提取樣本 DNA 運(yùn)用 RAPD 技術(shù)對(duì)荒漠肉蓯蓉野生居群和管花肉蓯蓉野生居群進(jìn)行研究，利用 P0PGENE3 版軟件分析其群體的遺傳多樣性。結(jié)果顯示，兩種肉蓯蓉的遺傳多樣性均呈低下，不利于其適應(yīng)環(huán)境變化的能力。通過(guò)分析肉蓯蓉遺傳多樣性的差異，為如何保護(hù)肉 蓯蓉提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)遺傳學(xué)依據(jù)2。3 分子生物學(xué)與中藥的機(jī)理研究 中藥的機(jī)理研究通過(guò)應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)已深入到幾乎是最根本的基因轉(zhuǎn)錄水平，并在該水平上對(duì)中藥的療效獲得了一定解釋?zhuān)?但

4、整體上還處于探索階段。 已有的研究主要是應(yīng) 用如核酸分子雜交、RT -PCR 技術(shù)等考察“單基因”的技術(shù)，應(yīng)用如 DD -PCR DNA 車(chē)列等研究多基因的技術(shù)的報(bào)道較少。 中藥調(diào)節(jié)機(jī)體平衡的特點(diǎn)決定了對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響很可能 是對(duì)多基因的協(xié)同影響，如對(duì)補(bǔ)腎生血方的系列研究已表明此方的功效與影響 EP0R SCF、c-myc、 Bel- 2、 GM-CSf基因表達(dá)有關(guān)。因此，應(yīng)用研究多基因表達(dá)的技術(shù)考察對(duì)多基因的 協(xié)同影響將是未來(lái)中藥基因轉(zhuǎn)錄水平作用機(jī)理研究的主要方向。相信隨著現(xiàn)有技術(shù)的不斷發(fā)展和完善、 新技術(shù)的出現(xiàn)及多種技術(shù)相結(jié)合加上疾病細(xì)胞分子水平研究的深入，復(fù)雜的中藥作用機(jī)理會(huì)逐步得到闡釋

5、， 中藥的療效和可能發(fā)現(xiàn)的新功效將從機(jī)理上獲得科學(xué)依據(jù)，為中藥獲得像西藥一樣的市場(chǎng)準(zhǔn)人權(quán)提供有力的支撐3。4. 分子生物學(xué)與中藥有效成分的獲?。?雖然隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，中藥材的提取方法得到了飛速發(fā)展，一些新的提取方法如 超聲提取技術(shù)、 超臨界流體提取技術(shù)、 微波輔助提取技術(shù)、 半仿生提取技術(shù)等得到一定的應(yīng) 用，但各種方法不但有自身存在的缺點(diǎn)， 更重要的是它們不能從根本上增加藥材有效成分的 含量。 因此， 在一味的追求更好的提取方法的同時(shí)， 也應(yīng)該在提高藥材自身成分含量上作出 相應(yīng)的研究4。本文以下主要介紹該方法的研究與應(yīng)用概況。該方法目前主要是利用理化因子定向誘導(dǎo)藥材某個(gè)藥用部位，如根莖、種

6、子等， 獲得 穩(wěn)定的藥材藥用部位突變體， 并運(yùn)用 cDNA-AFL 技術(shù)對(duì)突變體表達(dá)進(jìn)行分析； 以 Mrna - cDNA 克隆法，單克隆抗體等構(gòu)建以獲得差異表達(dá)mRNA 反義基因； 構(gòu)建相應(yīng)的載體，轉(zhuǎn)化藥材，分析轉(zhuǎn)基因石斛中的成分石斛堿的變化 ， 對(duì)反義基因進(jìn)行篩選， 確定石斛堿功能基因； 并 進(jìn)行基因的全長(zhǎng)克隆， 從而獲得藥材有效成分相關(guān)功能基因， 再進(jìn)一步對(duì)運(yùn)用基因工程方 法對(duì)藥材有效成分進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。單克隆抗體是由單個(gè)細(xì)胞 ( 雜交瘤細(xì)胞 )增殖而形成的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的完全均一的、 單 一特異性的抗體。 因此， 制作出針對(duì)中藥不同成份的單克隆抗體， 然后用來(lái)鑒定中藥的成份 或

7、測(cè)定其含量的多少。是一種簡(jiǎn)便而又高靈敏度的、重復(fù)性好的測(cè)定方法。而且， 單克隆抗體不僅可以作為測(cè)定試劑 還可以制成親和層析柱， 迅速地、 高特異性地從復(fù)合物中提取出 相應(yīng)的有效成份5。石斛為傳統(tǒng)名貴中藥材，為蘭科 (Orchidaceae) 石斛屬 ( Dend obium Sw)， 以新鮮或 干燥的莖人藥 ， 我國(guó) 76 種石斛屬植物中有 30 多種作為藥用， 著名的有鐵皮石斛、 金釵石 斛、霍山石斛等， 其具有“ 滋陰養(yǎng)胃、清熱生津、潤(rùn)肺止咳、明目強(qiáng)身”之功效， 神農(nóng) 本草經(jīng)將其列為上品，被譽(yù)為“ 中華九仙草”之首。藥用石斛的有效成分主要是生物堿 和多糖。現(xiàn)代藥理研究表明， 石斛還具有抗腫

8、瘤、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、擴(kuò)張血管及 抗血小板凝集、 有效減輕肝損傷等作用， 對(duì)眼科疾病也有明顯的治療作用。 但由于石斛對(duì)環(huán) 境的要求十分嚴(yán)格， 自然條件下 ，種子萌發(fā)率極低，生長(zhǎng)極緩慢， 再加上過(guò)度采挖及環(huán)境 的惡化，藥材資源日趨枯竭。為保護(hù)利用這一珍稀中藥材，增加產(chǎn)量，不少學(xué)者進(jìn)行了石斛組織培養(yǎng)快速繁殖研究， 并取得了一定的進(jìn)展 。但試管苗移栽成活率低， 產(chǎn)量低， 目 前還沒(méi)能應(yīng)用試管苗進(jìn)行大面積栽培， 不能滿(mǎn)足藥材市場(chǎng)的需求。 因此石斛藥源一直處于相 當(dāng) 緊張狀態(tài)， 亟待解決6,7. 應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)來(lái)解決才是長(zhǎng)遠(yuǎn)之計(jì)，本 文以藥用石斛的分子生物學(xué)在提高其有效成分石斛堿這

9、一方面作一介紹。石斛堿為石斛主要藥用有效成分之一 ，目前已能進(jìn)行人工合成， 但人工合成成本很高。 因此石斛堿相關(guān)功能基因的獲得， 為下一步通過(guò)基因工程大量生產(chǎn)石斛堿奠定基礎(chǔ)。 研究人 員利用理化因子定向誘導(dǎo)鐵皮石斛種胚原球莖已經(jīng)獲得穩(wěn)定的石斛堿缺失的突變體；運(yùn)用 cDNA AFLP 技術(shù)、用差異顯示對(duì)突變體表達(dá)進(jìn)行分析；以mRNA- cD A 克隆法構(gòu)建鐵皮石斛差減 cDNA 文庫(kù)；以獲得的差異表達(dá)的mRNA 勺反義基因構(gòu)建相應(yīng)的載體，轉(zhuǎn)化石斛，分析轉(zhuǎn)基因石斛的成分石斛堿的變化， 對(duì)反義基因進(jìn)行篩選 ，確定石斛堿功能基因； 并進(jìn)行基 閃的全長(zhǎng)克隆， 從而獲得石斛堿相關(guān)功能基因這些都為有效利用、

10、 開(kāi)發(fā)、 保護(hù)及開(kāi)拓石斛資 源創(chuàng)造條件。Yang H H 等從石斛中分離出了色素合成基因，并得到了高效表達(dá)。 Kuehnle H 等用帶 有植物表現(xiàn)Nos NPrrH基因和番木瓜病毒(PRV)膜蛋白(CP)基因的質(zhì)粒 pGA482 G G /cpP RV4 包被的微粒轟擊石斛的原球莖進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。通過(guò)4 次雜交得到的近 2 8 0 個(gè)原球莖被粒子轟擊，轉(zhuǎn)化與否表現(xiàn)在組織是否變綠。培養(yǎng)基為 12 MS+2 蔗糖 +( 5 0 01 0 0 )mg /L硫酸卡那霉素。PCR 分析表明，由 2 次雜交得到了 13 株具有卡那霉素耐受性植 株帶有 Nos NPrr基因，而只有 1 株帶有 PRVC

11、P 基因。這些結(jié)論表明用粒子轟擊的方法 可以實(shí)現(xiàn)單子葉植物石斛的轉(zhuǎn)基因。 此外， 石斛屬植物轉(zhuǎn)基因組織和植物的篩選還可用熒光 素酶基因做為標(biāo)記。 Chia 等 用帶有 35Sluc嵌合基因質(zhì)粒包被的鎢顆粒 ( 1.3u m) 轟擊 石斛的原球莖，3 周后，向轉(zhuǎn)化組織中加入 1 mmojZ的熒光素，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可通過(guò)低光視頻顯微鏡及其輔助圖像處理設(shè)備檢測(cè)生物性發(fā)光辨別。 將轉(zhuǎn)化的組織切割下來(lái)培養(yǎng)生長(zhǎng)， 然后 進(jìn)行第 2輪篩選。這樣經(jīng)過(guò) 3 輪的生長(zhǎng)和篩選后，表達(dá)熒光素酶的組織表明基因在該組織 中轉(zhuǎn)化成功。同時(shí)Southern 雜交也證明熒光素酶基因已結(jié)到植物基因組，該方法也可用于 其他植物基 因轉(zhuǎn)化

12、的檢測(cè)。除了用粒子轟擊的方法來(lái)進(jìn)行石斛原球莖轉(zhuǎn)基因的研究外， 有關(guān)石斛的研究還涉及了農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因。利用根癌農(nóng)桿菌 Agrobacterium rhizogenes 侵染宿主植物受傷部位 的細(xì)胞并產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)化毛狀根， 與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比， 轉(zhuǎn)化毛狀根具有生長(zhǎng)迅速、 傳 性狀穩(wěn)定及激素自養(yǎng)型等特點(diǎn)，克服了植物細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)原植物激素的依賴(lài)性， 是生產(chǎn)次塵 代謝產(chǎn)物較理想的組織。 農(nóng)桿菌侵染植物的關(guān)鍵之一是細(xì)菌侵入性基 因誘導(dǎo)物的作用 ，誘 導(dǎo)物在轉(zhuǎn)化過(guò)程中可將 T DNA 的加下和轉(zhuǎn)運(yùn)通道激活，誘導(dǎo)Vir 區(qū)基因的活化表達(dá)。在雙子葉植物中，許多天然酚性化合物如乙酰丁香酮、 香豆醇和芥子

13、醇等都是已知的細(xì)菌侵 入性基因的誘導(dǎo)物。但在石斛中，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這類(lèi)誘導(dǎo)物質(zhì)。Nan 研究發(fā)現(xiàn)石斛組織培養(yǎng)中原球莖發(fā)育早期有大量的松柏醇產(chǎn)生， 可誘導(dǎo)毒性基因的表達(dá)。 如果將在暗處培養(yǎng)的原球莖 轉(zhuǎn)入光照條件下，其含量呈 6 倍增加。原球莖松柏醇的產(chǎn)量是葉的 11 倍，這使通過(guò)農(nóng)桿菌 介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因植物， 即將克隆的花色基因、 主要藥用成分表達(dá)基因等通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 轉(zhuǎn)入石斛原球莖成為可能。 但是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因在石斛中并未取得成功， 這個(gè)研究結(jié)果 提示農(nóng)桿菌對(duì)單子葉植物石斛的不敏感性可能存在著新的機(jī)制。以上主要是以利用分子生物學(xué)中常用的粒子轟擊和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的技術(shù)與原理使石斛中 控制石斛堿的基

14、因得到高效表達(dá)， 從而達(dá)到提高石斛中有效成分石斛堿含量的目的。 分子生 物學(xué)在基因水平下來(lái)提高藥材的有效化學(xué)成分是獲得優(yōu)質(zhì)藥材的有效途徑，隨著技術(shù)的不斷更新與進(jìn)步，相信此方法在不久的將來(lái)將會(huì)得到廣泛的利用。參考文獻(xiàn)1 . 陳士林，蘇鋼強(qiáng)等中國(guó)中藥資源可持續(xù)發(fā)展體系構(gòu)建 J 中國(guó)中藥雜志， 30(15) ： 1141.2 .崔光紅，陳敏，黃璐琦等.藥用肉蓯蓉的遺傳多樣性RAP 分析J.中國(guó)中藥雜志，2004,29(8):72.3 .范秀娟,郭姣，楊國(guó)柱，羅朵生.分子生物學(xué)技術(shù)在中藥作用機(jī)理研究中的應(yīng)用 J .廣 東藥學(xué)院學(xué)報(bào) ,2007.23(5):592-595.4 .莫雪梅.分子生物學(xué)在中藥

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