人正常胃黏膜細胞全長cDNA文庫的構(gòu)建及鑒定

1、人正常胃黏膜細胞全長cdna文庫的構(gòu)建及鑒定strong【摘要】/strong目的構(gòu)建人正常胃黏膜細胞的cdna文庫并鑒左文 庫質(zhì)量。方法運用mrna5'末端的模板轉(zhuǎn)換方法以powerscript逆轉(zhuǎn)錄酶 進行轉(zhuǎn)錄，在mrna的5末端添加一段5, oligo做為延伸后的模板，從而 富集全長cdna.擴增后的cdnas經(jīng)xhol酶切、柱層析洗脫,重組于pgadt7 載體并包裝后，測定滴度、重組率，擴增文庫。隨機挑取16個克隆行pcr 反應(yīng)擴增插入片段。結(jié)果構(gòu)建的cdna文庫滴度為4. 00x106pfu/ml,重組 率> 95%,擴增后滴度達9. 50x 109pfu/ml

2、, 16個插入片段長度為0. 5 2. okb.結(jié)論構(gòu)建的人正常胃黏膜細胞cdna文庫為高效全長的酵母雙雜交 cdna文庫，符合cdna文庫的要求，可進一步用酵母雙雜交的方法探尋與胃 疾病相關(guān)的基因。strong【關(guān)鍵詞】/strong胃黏膜細胞;cdna文庫;全長【 abstract 】 objectivetoconstructafull lengthcdnalibraryofhumangastricmucos aandidentifythequalityofthelibrary. methodsthelibrarywasconstruc tedbyusi ngthetemplate swi

3、 tchi ngtechni queat5 f endofmrna apowerscriptreversetranscriptasewasusedtotranscribe, a nda5 ' oligofragmentasanextendedlemplatewasaddedto5 !endofmrnatoenrichfull lengthcdnas afteramplification, thecdnasd igestedbyxhoianclsize fractionatedbycolumnswererecombinedintopg adt7vectors. afterpackage,

4、 thetiterofrecombinantvectorsandthereco mbinantrate(blue/white)weredetermined, thenthelibrarywasamplifie d. wei denti fi edtheli braryusi ngpcrreacti ontodetermi nethesi zeofthe inserts. resultsthetiterofcdnalibrarywas4. 00 106pfu/ml, therateofrecombinantwasabove95%, and the t i tero famp1i f i e109

5、pfu/ml. theinsertsizerangcdfromo. 5to2. okb. conclusionthcyoastt wo hybri dcdnalibraryofhumangastri cmucosaissuccessful1yconstruc tedandcanbeusedforscreeningbyyeasttwo hybridtofindthegenesrela tedtogastricdiseases.keywords gastricmucosa;cdnalibrary;full length隨著人類基因組計劃的初步完成,確定不同發(fā)育階段的功能基因成為 后基因組時代的重要

6、研究內(nèi)容,而構(gòu)建cdna文庫已成為研究功能基因組學(xué) 的基本手段之一，在分離、克隆、篩選新基因以及基因功能研究等方面具 有垂要作用1。本研究以pgadt7為表達載體，構(gòu)建了一個人正常胃黏膜 細胞全長cdna表達文庫,為今后胃疾病相關(guān)基因的研究工作奠定了基礎(chǔ)。strong 1材料與方法/strong1.1材料人ges 1細胞于2009年6月18日購自屮南大學(xué)湘雅屮心實驗室。 trizol提取試劑購自美國tnvitrogen公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、 pcrtaqmix 試劑盒、oligotex dt30mrnapurificationkit 購自大連寶生 物科技有限公司；其他生化試劑購自國內(nèi)生物公

7、司。12方法1. 2. 1總rna提取及poly(a)+rna純化細胞用含10%胎牛血清的dmem 培養(yǎng)基，在37°c,5%c02的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至旺盛生長期，傾盡培養(yǎng)液后 直接向培養(yǎng)瓶中加入trizol試劑(lml/10cm2),裂解細胞，并用吸頭將細胞 裂解物吹吸幾次，再經(jīng)氯仿抽提及異丙醇沉淀后，以75%乙醇洗滌，室溫 lixue自然干燥，干燥后溶于三蒸水中(decp處理)，并在5560°c放置 lomin讓其充分溶解。取出一小份稀釋后在紫外分光光度計下測rna含量 及純度，并做瓊脂糖凝膠電泳分析總rna完整性。以 oligotex dt30mrnapurificat

8、ionkit進行mrna分離純化，實驗步驟按說 明書進行。1. 2. 2第_鏈cdna的合成將模板rna(poly(a)+rna)5u g中加入h20,使其總量達到9.8u 1,于72°c孵育2min,冰中放置2min后在微量離心管中加入 5x lststrandsynthesisbuffer4 u 1、iststranddntpmixturel. 2 u 1、rnaseinhibitor(20u/ u 1)1.0 p 1>1 u g/ u101igo(dt)18anchorprimer序列為5' (ga) 10actagtctcg ag(t) 18v 3, (v: a

9、orcorg) 2. 0 p 1 于室溫放置 lomin后加入reversetranscriptase(m mlv) 1. ou 1,輕輕混勻，于42°c孵 育 60min,向反應(yīng)管中加入 200u/u isuperscriptllirtasel u 1, 52°c孵育 60min,反應(yīng)結(jié)束后置于冰中冷卻25min1.2.3雙鏈cdna合成在第一鏈cdna合成液(20 n 1)中加入5x 2ndstrandsynthesisbuffer30 u 1 、 2ndstranddntpmixture4.5 u 1 、 rnase freeh2087. 5 u 1、e. colir

10、naseh/e. colidnaligasemixture2 u 1、 e. colidnapolymerase i 2 u 1.用移液槍輕輕混勻后，16°c反應(yīng)2h, 70°c加 熱lomin,室溫放置5min,加入4u 1的tddnapolymerase輕輕攪拌,37°c反 應(yīng) lomin.經(jīng) pci 抽提、ci 抽提后，加入 3msodiumacetate (ph5. 2) 15 p 1, dr. gentleprecipi tati oncarri er3 p 1, 100%乙醇 400 u 1,立即進行室溫 下15000r/min共30min的離心。除去

11、上清后用70%的乙醇清洗，干燥沉淀 后，用3.5u 1的rnase freell20溶解沉淀。1.2. 4cdna與sal i adaptor的連接向上述雙鏈cdna溶液3.5u 1中加 入下列試劑:10 x t4dnaligasebufferl u 1, 0. 4 u g/ u !ecortadaptor3. 5 p 1, 350u/ m lt4dnaligasel y 1, lommratpl 卩 1,全量為 10 u 1.輕輕混勻，8°c過夜反應(yīng)，70°c保溫3045min,室溫放置5min.1.2.5限制酶xhol酶切反應(yīng)向adaptorligation溶液中加入:

12、10x hbuffer5 u 1, 50u/ u lxhoi3 u 1,輕輕混勻,37°c反應(yīng) 3h.1.2.6使用spincolumn除去短鏈cdna及文庫構(gòu)建單鏈 (singlestrand, ss)cdna 擴 增 后 合 成 雙 鏈 (doublestrand, ds)cdna, ds cdna經(jīng)xho i酶切及柱層析洗脫，收集0. 5 5kb之間的組分，在t4dna連接酶作用下，與pgadt7去磷酸化臂于16°c水 浴中過夜連接，隨后包裝蛋白包裝載體。1. 2. 7文庫滴定、重組率測定和擴增按照構(gòu)建的cdna文庫滴度文庫滴 定公式2:原始文庫滴度二克隆斑總數(shù)x稀釋

13、倍數(shù)x包裝體積，重組率測 定采用藍白斑篩選方法，即向含有酵母菌和e. coli. xl1 blue混合液的上 層瓊脂屮分別加入50 u 1100mmol/l的iptg和x2gal,于90mm平板上鋪板, 置37°c孵育過夜，分別pc計算藍色斑和無色斑數(shù)，重組率二無色噬菌斑數(shù) /(無色噬菌斑數(shù)+藍色噬菌斑數(shù))，隨后進行文庫的擴增。1. 2. 8cdna文庫質(zhì)量鑒定取擴增后的cdna文庫鋪板，隨機挑取16個克 隆斑行pcr擴增，以載體克隆位點兩端的序列設(shè)計引物(引物合成公司為大 連寶生物工程有限公司)：引物1:5， ggagtacccata cgacgtacc 3'及引 物 2:

14、5' tatctacgattcatctgcagc 3',反應(yīng)條件為：95°c預(yù)變性 lmin,于 95 °c 30s, 55 °c 30s, 72 °c 3min 循環(huán) 30 周，最后于 72 °c 延伸10min. l%agarosege 電泳，檢測 insertdna 的片段長度。strong 2結(jié)果與分析/strong2. 1總rna的制備和mrna的分離純化提取的總rna于紫外分光光度儀檢測吸光度0d二a260/a280二1.92,于 10g/l瓊脂糖凝膠電泳可見28s、18s、5s3條清晰帶,28s : 18s約為2

15、: 1（圖 1）,純化后的mrna于10g/l瓊脂糖凝膠電泳顯示為為0. 55kb的片狀條 帶,說明所提取的mrna質(zhì)量較純。2. 2cdna文庫的構(gòu)建poly（a）+rna經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄及擴增后，于llg/l瓊脂糖凝膠上電 泳,ds cdna在0.45kb之間形成一片狀條帶，經(jīng)酶切及柱層析洗脫后, 收集長度在0. 5kb以上的組分，經(jīng)乙醇沉淀濃縮后，溶于7nl去離子水中, 取3u 1于llg/l瓊脂糖凝膠上電泳,顯示為長度在0. 54kb的一片狀條 帶（圖2）,即可與載體pgadt7連接。構(gòu)建的文庫經(jīng)效價測定，文庫的克隆數(shù) 為4. 00x106pfu/ml,以藍白斑篩選檢測重組率>9

16、5%,文庫經(jīng)擴增后，滴 度達 9. 50x109pfu/ml.2. 3cdna文庫的質(zhì)量鑒定隨機挑取16個克隆斑，以載體克隆位點兩端引物進行pcr擴增插入的 cdna片段，以瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物，結(jié)果顯示,cdna插入片段長度均在 5002000bp（圖 3）ostrong 3 討論/strong冃前，構(gòu)建全長cdna文庫的方法主要有以下幾種:01igocapping法3 , capturc 法4, smart法56, cap select 法7, cap jumping法8以及cap trapper法9等。所有的這些方法都著眼于真核生物 mrna5,端的帽子結(jié)構(gòu)，但又各有其獨到z處總的說來

17、,cdna文庫構(gòu)建大致 經(jīng)分離總rna,純化mrna,反轉(zhuǎn)錄成cdna,然后與兩端帶有限制性酶切位點 的人工接頭相連接，并將莫插入到載體中，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，得到cdna文庫。 而酵母菌可替代大腸桿菌作為受體菌克隆真核基因。酵母菌屬真核單細胞 生物，基因組僅為人腸桿菌的4倍，但它卻可以像原核細胞一樣進行實驗操 作。因此,酵母菌是遺傳工程中用于表達真核細胞基因較理想的受體細胞 10 o成功地構(gòu)建一個全長cdna文庫，關(guān)鍵問題是要分離得到高質(zhì)量的mrna, 并且mrna種類越多,cdna文庫就越完整。導(dǎo)致rna質(zhì)量不高的原因主耍有 兩個:一是總rna有降解，在瓊脂糖凝膠電泳上表現(xiàn)為28s與18s條帶模

18、糊， 呈彌散狀,5s條帶出現(xiàn)高濃度。我們所提取的rna在瓊脂糖凝膠電泳上表 現(xiàn)為28s、18s、5s3條清晰條帶，其中28s : 18s約為2 : 1,說明rna沒有 降解。二是rna的污染，提取的rna于紫外分光光度計檢測a260/a280比 值在1. 90-2. 1時,rna質(zhì)量較純。a260/a280值低,說明有較多的蛋白質(zhì) 污染。這些蛋白質(zhì)可嚴(yán)重降低逆轉(zhuǎn)錄酶的催化效率。我們所提取的rna經(jīng) 檢測,a260/a280值為1. 92,說明所提取的rna較純。在cdna文庫構(gòu)建完成之后，一般需對載休中插入片段的大小進行檢 測。本研究得到了插入子片段，成功地進行了 cdna文庫的鑒定。插入片段

19、 長度在5002000bp之間，且長度并不均一，說明我們所構(gòu)建的文庫具有一 定復(fù)雜性。我們運用此方法構(gòu)建了高效的富集全長的人止常胃黏膜細胞全長 cdna文庫,經(jīng)滴度測定、重組率、pcr鑒定均符合cdna文庫的質(zhì)量要求, 可以對其進行隨機挑選克隆測序分析，并可在以后的工作屮利用酵母雙朵 交方法尋找引發(fā)胃疾病的相關(guān)基因。strong【參考文獻】/strong1 yuy,zhangc, zhoug, eta1. geneexpressionprofi1inginhumanfetal1iv erandi dentificationoftissuesnddevelopmentalstagespecifi

20、cgenesthroughcompiledexpressionprofilesandefficientcloningoffull lengthcdnasj. genomeres, 2001, 11 (8):13921403.2 吳曉林，琦祖和cdna文庫m/盧圣棟.dangdai現(xiàn)代分子生物學(xué) 實驗技術(shù).2版北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,1999:319328.3 maruyamak, suganos. 01i gocapping:asimplemethodtoreplacethecapstructureofeukaryoticmrnasw itholigoribonucleotidesj g

21、ene, 1994, 138:171174.4 ederyt, chull, sonenbergn, etal. anefficientstrategytoi solateful1lenglhcdnasbasedonanmrnacapretentionprocedure(capture)j molce llbiol, 1995, 15:33633371.5 chenchika, moqadamf, siebertp alaboratoryguidetorna:isolation,analysisandsynthesismnewyork:wileyliss,1996:273321.6 duxj, wangjx, lium, etal. identificatio