免疫學實驗指導

1、免疫學實驗指導生命科學與工程學院生物工程、生物技術、動物醫(yī)學專業(yè)用 馮玉萍分組：4人/組 ，實驗用動物、器材以每組需要量設計班級 2006生物工程 、生物技術 學生人數(shù)：65人/58人 。 分16組/15組時間 2008年3月2008年7月 兩周一次4學時。 目 錄實驗一、免疫學實驗動物的一般操作實驗二、實驗動物免疫器官、免疫細胞觀察實驗三、實驗動物的采血方法、動物血清及紅細胞的制備方法實驗四、淋巴細胞分離與E玫瑰花環(huán)形成試驗實驗五、IgG的分離和純化實驗六、玻片凝集試驗(ABO血型鑒定)實驗七、環(huán)狀沉淀試驗實驗八、瓊脂擴散試驗（單向）實驗九、巨噬細胞吞噬功能試驗實驗十、白細胞吞噬試驗實驗一、

2、免疫學實驗動物的一般操作實驗原理 實驗動物的基本操作是免疫學實驗的基礎,抗原對動物機體的免疫效果，通過實驗動物進行驗證，因此必須掌握實驗動物的一般操作技術。目的要求1、 實驗材料的準備（棉球、注射器的準備與消毒）（演示）2、 了解免疫學實驗常用動物的生物學特性、用途及其健康要求。自學3、 學習實驗動物的編號、抓取、固定和幾種不同的注射途徑方法。4、 練習對小白鼠給藥的幾種不同途徑的注射方法。5、 練習小白鼠的取血方法。6、學習血涂片的制作及染色；觀察動物血液中有形成分的形態(tài)結構特點。 實驗動物 小白鼠，2只/組，共需18 20只。試劑 3%來蘇兒或3%石炭酸 100150 ml/組； 無菌生理

3、鹽水100150ml/組；磷酸鹽緩沖液2050ml/組（帶滴管、染色用）。 3 5% 苦味酸2050ml/組（帶滴管,編號用）； 5%品紅20ml50ml/組（帶滴管，編號用）； 瑞特氏（wrights）染色液50ml/組（帶滴管，染色用）；*抗凝劑一支器材 1ml注射器及針頭2支/組； 碘酒棉球、酒精棉球、無菌干棉球各適量； 手術剪刀2把/組；鑷子2把/組；載玻片、蓋玻片各6片/組； 毛細吸管2支、50100ml燒杯1個/組 顯微鏡6臺/組6 鼠籠1個/組操作步驟1、練習小白鼠抓取、編號、皮下注射、皮內注射、腹腔注射的方法。（見免疫學實驗P9-13。2、練習小白鼠尾靜脈取血法。（P15）實驗

4、報告要求：1、時間、地點、操作人、同組人、指導老師。2、實驗原理、目的要求3、實驗操作記錄（實驗步驟、結果）4、分析總結：依據(jù)實驗原理、目的要求，分析總結實驗是否成功，是否達到實驗目的？為什么？5、對實驗動物編號有何實際意義，你對書中關于小白鼠的編號方法有何想法？有無更簡便、實用的方法？6、若給動物注射傳染性材料應注意些什么？實驗二、免疫器官與免疫細胞觀察實驗原理 免疫器官、免疫細胞是動物免疫系統(tǒng)的主體。在胸腺、脾臟中有大量淋巴細胞存在，在外周血液中有大量淋巴細胞和白細胞等免疫細胞存在，發(fā)揮著免疫監(jiān)視作用。目的要求 1、練習血涂片的制作2、學習小鼠頸椎脫臼致死的方法，觀察小白鼠的解剖結構；3、

5、學習脾臟、胸腺的觸片制備與染色方法；觀察小鼠脾臟觸片、血液涂片中的免疫細胞，并畫圖。方法與步驟1、練習血涂片的制作（3張/組）1）準備一張潔凈玻片，取血1滴于玻片右側,另取一光邊玻片的一端,放在血滴前方,并逐漸后移接觸血滴,血液立即沿推片散開,然后將推片與載片保持30一45度角,平穩(wěn)地向前推動,至玻片另一端,載玻片上便留下一層血膜。良好的血膜象舌頭,頭、體、尾鮮明,厚薄適宜、分布均勻,邊緣整齊,兩側留有空隙。2）染色：A、瑞特氏(WrightFs)染色法：.血涂片制成后可在空氣中揮動，使迅速干燥，以免血細胞皺縮。選擇良好的血片，用特種玻璃鉛筆畫出兩邊界限(注意保留尾部，因體積大的細胞往往在此出

6、現(xiàn))，以防染液外溢。在血膜上滴加幾滴瑞氏染色液,左右晃動，使染液完全覆蓋血膜，注意染液不宜過多而溢出界限，亦不能過少而干燥。12min后，滴加等量磷酸鹽緩沖液或生理鹽水，23min后，可見表面有金屬光澤，即可用清水輕輕沖去染液，待血片自然干燥或用濾紙輕輕吸干。在正常的情況下，血膜外觀染成粉紅色。3）鏡檢：先在低倍鏡下檢查血片，染色是否合格，血細胞分布是否均勻等,然后換高倍鏡或油鏡觀察，并繪圖，指出淋巴細胞與白細胞、紅細胞。如自己圖片不成功，則對教學片進行觀察和繪圖。結果：血液涂片瑞特氏染色法染色的結果：中性粒細胞：是白細胞中數(shù)量最多的細胞，胞體大于紅細胞，細胞核藍紫色，呈分葉形，可分25葉。葉

7、間有細絲相連；細胞漿為粉紅色，其中充滿褐灰色的小顆粒。嗜酸性粒細胞：數(shù)量少，占白細胞總數(shù)的0.53%。胞體較中性粒細胞大，胞核藍色，顆粒粉紅色。嗜堿性粒細胞：細胞核藍紫色，顆粒藍色。紅細胞數(shù)量最大，邊緣厚（濃染），中央?。ǖ?。淋巴細胞細胞質天藍色，細胞核幾乎占據(jù)整個細胞。B、姬姆薩染色法： 用甲醇固定標本10分鐘，或醋酸：甲醇=1：3的混合液固定30分鐘。 用滴管吸取姬姆薩染色工作液布滿材料面，注意不要有氣泡。 染色1015分鐘后，用自來水沖洗，空氣干燥，二甲苯透明5分鐘。 用光學樹脂封片后觀察。結果：血液涂片姬姆薩染色法染色的結果：有核細胞的細胞核染成紫紅色或藍紫色，細胞漿染成粉紅色。無核

8、細胞染成：C、血液標本片觀察結果：2、練習小白鼠脊椎脫臼處死法。或用乙醚麻醉致死。 3、仔細解剖小鼠，觀察小鼠的內臟器官，找出脾臟、胸腺，分別做觸片（3張/組）并用瑞特氏(WrightFs)染色法或姬姆薩染色法染色、觀察。4、觀察標本片，繪圖描述人、小鼠血液中的幾種有形成分。結果1、脾臟觸片瑞特氏染色法染色的結果：2、脾臟觸片姬姆薩染色法染色的結果：3、標本片觀察結果：實驗報告要求：1、時間、地點、操作人、同組人、指導老師。2、實驗原理、目的要求3、實驗操作記錄（實驗步驟、結果）4、分析總結：依據(jù)實驗原理、目的要求，分析總結實驗是否成功，是否達到實驗目的？為什么？5、繪圖描述：人、鼠血液涂片中

9、的淋巴細胞、粒細胞、紅細胞實驗三、實驗動物的采血方法、動物血清及紅細胞的制備方法實驗原理 抗原免疫動物后，其相應的抗體就會產(chǎn)生并存在于動物的體液中。血清是體液的重要組成部分，存在大量抗體。學會了制備血清的方法，就學會了制備抗血清的方法。 紅細胞是免疫學反應中常用的顆粒性抗原，也是可溶性抗原的載體及補體結合反應中指示系統(tǒng)的組成成員。在許多免疫學檢測中都要用到紅細胞，因此，血清與紅細胞的制備技術，是免疫學實驗的基本技術。目的要求 1、 學習雞、兔的動脈、靜脈及心臟等部位的無菌采血方法；2、 學習動物血清、紅細胞的制備方法；3、 掌握離心機的使用方法。4、 解剖雞、兔，觀察免疫器官。實驗動物 雞、兔

10、各1只/2組，共需雞5只、兔5只。試劑 3%來蘇兒或3%石炭酸 50 100 ml/組； 無菌生理鹽水150ml/組；分兩瓶（100ml/瓶、50ml/瓶） 500單位/ml的肝素溶液25ml/班。器材 10ml注射器及針頭2支/組； 碘酒棉球、酒精棉球、無菌干棉球各適量；50-100ml燒杯1個/組； 手術刀、剪、鑷子各1把/組； 50100ml、帶玻璃珠的無菌三角燒瓶1個/組（可用20ml鏈霉素瓶代替）； 無菌試管及試管塞6套/組；離心管2支/組；（6）離心機1臺/6組，共3臺； 試管架1個/組、恒溫培養(yǎng)箱一個/班、冰箱一個/班。 操作步驟1、兔耳靜脈采血（P19）2、兔耳中央動脈采血（P

11、19）3、兔心臟采血：（P18）4、雞翼根靜脈取血（P19）5、雞心臟取血（P18）。6、離心法制備血清：取下注射器針頭將抽得的血液以無菌操作注入無菌的離心管中，平衡離心管，離心1020分鐘/20003000rpm。用毛細滴管吸出血清，將獲取的血清分裝于已滅菌的小瓶內，加蓋并用封口膠將瓶口封住，貼上標簽注明血清的名稱及制備日期，置低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?、沉淀法制備血清：取下注射器針頭將抽得的血液以無菌操作注入無菌試管（或平皿）內，加蓋置37溫室內2小時，凝固后用無菌滴管沿試管（或平皿）邊緣將血塊與皿壁脫離，然后放入48冰箱中過夜，使血清充分析出。吸取血清分裝于已滅菌的小瓶內備用。8、動物血紅細

12、胞制備：(1) 無菌操作取靜脈血，將血注入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，振搖數(shù)分鐘以脫纖維抗凝。(2)取適量的脫纖維血，用25倍無菌生理鹽水洗2次，每次2000rpm，離心10分鐘，棄上清后用無菌生理鹽水配成20%的紅細胞懸液，置4冰箱保存?zhèn)溆?。作業(yè)：實驗報告1、 簡述無菌采血應注意哪些事項？ 2、 離心機操作中應注意哪些問題？3、血清制備中應注意哪些問題？ 4、紅細胞制備中應注意哪些問題？備注：實驗前請仔細閱讀免疫學實驗！ 實驗四 血球凝集反應和交叉配血試驗實驗原理 紅細胞等顆粒性抗原與血清中相應的抗體，在適量電解質存在的條件下，經(jīng)一定時間后，凝集成肉眼可見的凝集物?？乖贵w的這種反應，稱為凝集

13、反應。在人的ABO血型中，A型血的紅細胞上有A抗原，血清中有抗B抗原的抗體；在B型血的紅細胞上有B抗原，血清中有抗A抗原的抗體；故A型血的紅細胞與B型血的血清混合時，在有電解質存在的條件下就可能發(fā)生凝集；同樣，B型血的紅細胞與A型血的血清混合，在有電解質存在的條件下也可能發(fā)生凝集；AB型血的紅細胞上，既有A抗原，也有B抗原，而其血清中既無抗A抗原的抗體，也無抗B抗原的抗體；而O型血的紅細胞上既無A抗原，也無B抗原，而其血清中既有抗A抗原的抗體，也有抗B抗原的抗體，故AB型血的血清與A型、B型、O型血的紅細胞混合，均不會發(fā)生凝集，也就是說，AB型血的人能接受A型、B型、O型血液的輸血；而O型血的

14、血清與A型、B型、AB型血的紅細胞混合，均可能發(fā)生凝集；既O型血的人不能接受A型、B型、AB型血液的輸血，但他卻是萬能輸血者，其紅細胞可以輸給任何血型的人。兔、雞是否也有相應的血型？尚不清楚。本實驗可自行設計，在有生理鹽水存在的條件下，利用不同組的兔與兔、雞與雞、雞與兔的紅細胞和血清的混合，觀察凝集現(xiàn)象和溶血現(xiàn)象，并分析、總結實驗結果。 目的要求 1、將實驗三所制備的雞、兔血清、紅細胞分別進行交叉，自行設計，觀察雞與雞、兔與兔、雞與兔之間血清與紅細胞交互混合，產(chǎn)生的凝集現(xiàn)象和溶血現(xiàn)象。 2、嘗試著利用抗原抗體反應的特異性對實驗結果進行解釋。試劑 0.85%生理鹽水，100ml/組；5ml注射器

15、2支/組。器材 載玻片每人1張、小試管4支/組，毛細滴管2支/每組。操作步驟 1、將制備好的雞、兔紅細胞用生理鹽水稀釋成0.5%的混懸液。2、兔與兔（雞與雞）配血，觀察血球凝集現(xiàn)象： 取1#兔（雞）血清1滴于載玻片上，加入2#、3#兔（雞）紅細胞，用火柴棒混勻，過1015分鐘，觀察，血球凝集現(xiàn)象。3、兔與雞（雞與兔）配血，觀察血球凝集現(xiàn)象 取1#、2#兔（雞）血清1滴于載玻片上，加入1#、2#雞（兔）紅細胞，用火柴棒混勻，過1015分鐘，觀察，血球凝集現(xiàn)象。4、兔與兔（雞與雞）配血，觀察溶血現(xiàn)象：取1#、2#兔（雞）血清0.51ml，加入0.5%的1#、2#雞（兔）紅細胞，混勻，靜止過1520

16、分鐘，觀察上清液是否溶血（變紅），血球是否凝集？（沉淀物邊緣是否整齊）。5、記錄結果如：兔與兔（雞與雞）配血，觀察血球凝集現(xiàn)象項目實驗1實驗21#兔血清1滴-1#兔紅細胞-1滴2#兔血清-1滴2#兔紅細胞1滴實驗結果凝集（或不凝集）凝集（或不凝集）如：兔與兔（雞與雞）配血，觀察溶血現(xiàn)象項目實驗1實驗21#兔血清0.5ml-1#兔紅細胞-0.5ml2#兔血清-0.5ml2#兔紅細胞0.5ml實驗結果凝集（或不凝集）凝集（或不凝集）溶血（或不溶血）溶血（或不溶血）6、總結、分析、討論。實驗報告附、玻片凝集反應試驗（ABO血型鑒定試驗）目的要求1、掌握玻片凝集試驗的操作方法，了解其特點和用途；2、學

17、習玻片凝集試驗結果的觀察方法3、了解ABO血型鑒定的原理，掌握其鑒定方法 試劑1、 診斷用人血型抗A血清；2、診斷用人血型抗B血清；3、無菌生理鹽水4、消毒液器材1、凹玻片或載玻片6片/組，2、無菌刺血針、小試管、尖嘴滴管、毛細吸管、牙簽、酒精棉球、無菌干棉球、顯微鏡各1個/人，每組6人；3、試管架、記號筆各1個/組。操作步驟(1)用酒精棉球消毒被檢者的指尖或耳垂,用無菌刺血針刺破皮膚,取血12滴放入盛有0.51ml生理鹽水的小試管中,搖勻即成為1%2%的紅細胞懸液。取血后,用無菌干棉球壓迫針眼止血。 (2)取雙孔凹玻片一張或載玻片一張,在二孔(或二端)處標明A、B。用尖嘴滴管分別吸取診斷用人

18、血型抗A和抗B血清,各加一滴于相應的孔內(注意兩滴管切勿混用)。(3)用尖嘴滴管吸取待檢紅細胞懸液于A、B血清中各加1滴。(注意勿使滴管尖端和血清接觸)。(4)分別用牙簽將抗血清與紅細胞懸液混勻(也可前后左右輕輕晃動載玻片使其混勻，用牙簽混勻時應分別用兩端攪拌,切不可用同一端在A、B兩抗血清中攪拌)。(5)充分混勻后,置室溫于實驗臺上靜置1015分鐘后觀察有無凝集發(fā)生。如混合液由均勻混濁的紅色逐漸變?yōu)橥该?并出現(xiàn)大小不等的紅色凝集塊,即為紅細胞凝集;若混合液呈均勻分散混濁狀,邊緣整齊,則為不凝集。如觀察不夠清楚,可置顯微鏡下用低倍鏡觀察。血型判定可參照下圖及表。紅細胞凝成大塊或有數(shù)個紅細胞凝集

19、在一起為凝集。 用抗血清鑒定血型的結果與判定血型抗A血清抗B血清ABABO表示凝集，表示不凝集。作業(yè)與思考題1.你的血型是何型?你是如何判斷的?2.你能接受何種血型的血液?能輸血給何種血型的人?為什么？3.根據(jù)下表中提供的凝集反應的結果,請將血型檢查結果填入表中：標準A型血清標準B型血清 待檢者血型 4.完成下表：血型紅細胞中的抗原血清中的抗體被凝集的紅細胞類型輸血中能接受的血型ABABO5、如果要檢測血清中血型抗體的效價，請你寫出主要的操作過程。備注：實驗前請仔細閱讀免疫學實驗P77-109 實驗五、淋巴細胞的分離與E玫瑰花環(huán)形成試驗目的要求1、學習血液中免疫細胞的分離方法。2、學習E花環(huán)試

20、驗的操作方法。3、觀察顯微鏡下E花環(huán)的形態(tài)。4、掌握花環(huán)計數(shù)的方法及其形成原理。5、了解檢測Ea、Et花環(huán)的意義。材料與試劑 人外周血：靜脈采血24ml，注入盛有23滴肝素（500單位/ml）的青霉素瓶中，搖勻。應在4小時內進行實驗。 Alsevers保存液 綿羊紅細胞（2周內）。 無菌及吸收過的小牛血清：將小牛血清置56水浴經(jīng)30分鐘滅活后，按每毫升小牛血清加入已洗滌過的壓積綿羊紅細胞0.1ml混勻，置37水浴中1小時，然后置4冰箱過夜。以2000rpm離心沉淀10分鐘，取上清過濾除菌，分裝小瓶，低溫保存?zhèn)溆谩?無鈣、鎂Hanks液； 淋巴細胞分離液，比重為1.0771.080。（上海試劑二

21、廠生產(chǎn)，密度P（g/ml）為1.077±0.002，避光低溫（4）保存，有效期23年。） 0.8%戊二醛，用0.43%NaCl溶液臨用前配制。 瑞氏染色液或1%美藍水溶液。器具水平式離心機、水浴箱、冰箱、離心管、吸管、試管、內放玻璃珠的三角燒瓶、顯微鏡等。操作步驟1. 制備淋巴細胞懸液(1)取1m1淋巴細胞分離液加1ml肝素抗凝血,使血液輕輕覆蓋在分離液上面,并使血液與分離液之間保持清晰的界面。(2)立即置水平式離心機中以2000rpm離心20分鐘。離心后分為四層,最上層為血漿,中間一層為分離液。上層和中層之間有一乳白色層含有大量淋巴細胞，小量大單核細胞。最下層為紅細胞。(見圖)(3

22、)用尖嘴滴管小心地吸取淋巴細胞于一試管中,加入無Ca2+、Mg2+的Hank,s液洗滌3次,每次以2000rpm離心10分鐘沉淀淋巴細胞,末次洗滌后棄上清,僅留約0.1ml液體,制成淋巴細胞懸液。細胞計數(shù),用Hank,s液配成5×106/m!的細胞懸液。 淋巴細胞分離過程 2.1%綿羊紅細胞懸液的制備取一定量阿氏液保存的綿羊血于離心管中,用無Ca2+、Mg2+的Harlks液洗3次,末次洗滌后取壓積的血球用上述Hank,s液配成1%懸液,細胞濃度約為2×108細胞/ml。3.活性T花環(huán)(Ea花環(huán))的形成(1)取淋巴細胞懸液0.1ml，加入小牛血清0.1ml和0.2ml1%的

23、綿羊紅細胞懸液混勻。(2)于水平式離心機內以500800rpm離心5分鐘,小心吸去上清液,留下約0.1ml液體,立即沿管壁加入一滴0.8%戊二醛溶液固定23分鐘,輕輕轉動試管小心混勻。(3)加入12滴1%美藍水溶液混勻,取一滴于載玻片上、置油鏡下汁數(shù)200個淋巴細胞中形成花環(huán)的淋巴細胞百分數(shù)。一般以淋巴細胞吸附三個以上綿羊紅細胞者為一個花環(huán)。4.總T花環(huán)(Et花環(huán))的形成(1) 取淋巴細胞懸液0.1ml加入小牛血清0.1ml及0.2m11%的綿羊紅細胞懸液,混勻,置37水浴5分鐘,其間搖動2次。 (2) 500800rpm離心5分鐘,置4冰箱24小時,吸去少許上清液,約留0.1ml液體,沿管壁

24、加入0.8%戊二醛溶液一滴,固定23分鐘,輕旋試管以混勻,其余同Ea花環(huán)步驟。注意事項1.必須采用新鮮抗凝血來分離淋巴細胞,從取血到試驗最多不超過4小時。否則,形成E花環(huán)的百分數(shù)會顯著下降。 2.綿羊紅細胞的質和量對花環(huán)形成有較大的影響。不新鮮的綿羊紅細胞可使花環(huán)形成顯著減少。綿羊紅細胞與淋巴細胞的比例以100:1為宜,比例過低,花環(huán)形成明顯降低,反之則升高。 3.pH值對花環(huán)的形成有影響。最適pH為7.27.40。過高、過低的pH值可使花環(huán)值下降。 4.在制片時需混勻花環(huán)懸液,懸浮時一定要輕旋試管,不可用滴管用力吹打或搖動試管,以免形成的花環(huán)脫落。5.鏡檢時有干片和濕片二種方法。濕片不能長期

25、保存。干片是推片法,標本片可長期保存,但推片時花環(huán)易脫落,花環(huán)形成細胞分布不均勻,推片尾部常高于頭部一倍以上。6.花環(huán)形成時,加入蛋白成分可提高花環(huán)的穩(wěn)定性,常用胎牛血清(或小牛血清),但需先經(jīng)5630J分鐘滅活,并用綿羊紅細胞吸收,以除去嗜異性抗體,否則此抗體可和綿羊紅細胞起反應并吸附于B細胞膜Fc受體上,產(chǎn)生B細胞花環(huán),從而影響試驗的準確性。作業(yè)與思考題1.用簡明扼要的方式表明Ea和Et花環(huán)形成的操作流程。2.你的實驗結果怎樣?請分析試驗成敗的原因。3.Ea和Et花環(huán)形成時的主要區(qū)別是什么?4.作E花環(huán)試驗時,為何加入小牛血清?不用小牛血清用人血清行嗎?加入的小牛血清為什么要經(jīng)5630分鐘

26、滅活,并用綿羊紅細胞吸收?備注：實驗前請仔細閱讀免疫學實驗P179-183實驗六、IgG的分離和純化目的要求 1、 學習動物血清中IgG的分離純化方法；2、 比較成年牛血清、新生牛血清IgG的含量；3、 了解分離、純化抗體的原理；4、 熟練掌握離心機的使用方法。試劑 成年牛血清20ml、新生牛血清20ml； pH7.4 、0.01mol/L磷酸鹽緩沖液250ml。 pH8.0、0.005mol/L磷酸緩沖液250ml； 飽和硫酸銨溶液500ml； 1%氯化鋇250ml。器材 無菌1ml、2ml、5ml、10ml吸管各2支/組； 酒精棉球適量； 離心管2支/組 離心機1臺/5組；2-3臺/班 試

27、管架1個/組、記號筆1支/組、4冰箱1個/班。操作步驟1.分別取成年牛血清、新生牛血清各2ml（X）于離心管中，加等量的pH7.4、0.01mol/L,磷酸鹽緩沖鹽水或生理鹽水,將血清稀釋一倍,慢慢搖動避免形成泡沫。2.在冰浴中逐滴加入4ml（2X）飽和硫酸銨溶液,邊加邊攪拌,以防止形成團塊,減少沉淀。此時即有大量的Y-球蛋白沉淀(主要是IgG)。3.置冰箱靜置30分鐘或更長時間后,冷凍離心(30004000rpm,15分鐘),棄上清。沉淀用2ml（X） 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水溶解。4.逐滴加入1ml（1/2 X）飽和硫酸銨邊加邊攪拌,使飽和度為33%,置4冰箱3060分鐘,離心收

28、集沉淀。同法重復3、4步驟3次,可得到較純的IgG。 作業(yè)與思考題實驗報告1.分離純化免疫球蛋白為什么盡可能在低溫條件下進行?所用溶液為何要先冷卻?2.常用的分離、純化免疫球蛋白的方法主要有哪幾種?各自得到的純度如何?3.五類免疫球蛋白分離純化的方法皆相同嗎?4.如果用血漿來分離純化IgG,需不需要去除纖維蛋白原?5.分離純化IgG時,為什么硫酸皺的飽和度先調至50%,然后調至33%?加入硫酸銨溶液時,為什么要一滴滴地加?6.如果要提取IgA,從初乳中提取是否比從血清中提取合算?為什么? 7.比較成年牛血清與新生牛血清中IgG含量并分析之。備注：實驗前請仔細閱讀免疫學實驗P44-48。實驗七、

29、單向瓊脂擴散試驗目的要求1、通過本試驗，學習一種抗原定量的測定方法。 2、了解沉淀環(huán)的直徑與抗原或抗體濃度的關系。材料與試劑1、 3%生理鹽水瓊脂；2、 正常人血清、已知IgG含量的人血清；3、 羊抗人IgG抗血清；4、 生理鹽水；5、 待測羊血清。器具1、 載玻片6張/組；2、 打孔器、微量加樣器、濕盒（盒內鋪二層濕紗布）、操作步驟1、溶化3%生理鹽水瓊脂,并置56水浴中保溫。2、 稀釋抗血清:將羊抗人IgG抗血清按1/2效價用生理鹽水稀釋(如效價為1:60,則稀釋成1:30),分裝于小試管,每管1.5ml，置56水浴保溫(溫度不能高于56,且時間不能過長)。3、.取上述56水浴保溫的瓊脂和

30、抗血清等量混合,小心傾注于置水平臺上的載玻片上(勿倒出玻片外!)。(板上的抗血清終濃度是多少?)4.稀釋參考血清:取參考血清一支,加入蒸館水0.5時,完全溶解后用生理鹽水倍比稀釋成1:101:160五種濃度,并算出IgG的相應含量(嚴g/ml)。如參考血清IgG含量為11.66mg/ml。參考血清稀釋度為1:10、1:20、1:40,則IgG相應含量為1166g/ml、583g/ml、291.5g/ml。5.將待測血清用生理鹽水稀釋成1:40的濃度。6.待瓊脂凝固后按模板用打孔器打孔,孔徑3mm,孔距10mm。孔中的瓊脂如未吸出,則用注射器針頭將其挑出,務必將孔中的瓊脂挑凈且不可損壞孔緣。7.

31、加樣:用微量加樣器吸取各濃度的參考血清,按順序加入各孔中,每孔加入10l。每一濃度加二個孔。已稀釋好的待測血清,每份標本也加二個孔,每孔10l。8.擴散: 將加好樣的瓊脂板平放于濕盒內，置30溫箱或室溫擴散2448小時。9.取出瓊脂板,即可見清晰的乳白色沉淀環(huán)。測量各濃度沉淀環(huán)的直徑。以兩相同稀釋度孔沉淀環(huán)直徑的平均值為橫坐標,相應孔中IgG的含量為縱坐標,在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線。10.待測血清標本中IgG的含量是根據(jù)標本孔中沉淀環(huán)直徑,在標準曲線上查得IgG含量乘以標本的稀釋倍數(shù),即為標本IgG含量。作業(yè)與思考題 備注：實驗前請仔細閱讀免疫學實驗P123-126 !1.在單向瓊脂擴散試

32、驗中,為什么一定要把板鋪平?如何才能使板鋪平呢?2.在本試驗中,加樣后進行擴散時,為什么一定要把板放平?為什么要保持潮濕環(huán)境?3.為什么水浴溫度要控制在56?超過60行不行?抗血清在56水浴中放置過長時間對實驗有無影響?4.為什么抗體板中抗體濃度越小,沉淀環(huán)越大,靈敏度越高？實驗八 雙向瓊脂免疫擴散試驗實驗原理 將抗原和相應抗體分別加入同一凝膠板內的相鄰小孔內，使兩者互相擴散，當擴散到兩者濃度、比例合適的部位相遇時，就會形成抗原抗體復合物的沉淀。呈現(xiàn)乳白色沉淀線。如果抗原抗體不相對應，則無沉淀線出現(xiàn)。故此試驗可用已知抗原檢測未知抗體；也可用已知抗體檢測未知抗原。如果加于瓊脂孔中的抗原、抗體，含

33、有兩種以上抗原、抗體系統(tǒng)時，由于各種抗原的濃度、分子量及擴散系數(shù)不同以及各對抗原抗體形成沉淀時所需的最適比例不同，擴散后變可形成多條沉淀線。每一條沉淀線代表一對抗原、抗體系統(tǒng)。所以本實驗可以用于分析、鑒定復雜的抗原物質成分，以及測定抗原或抗體的純度。根據(jù)沉淀線的形態(tài)和位置，可了解抗原、抗體的相對濃度和擴散速度。而擴散速度與分子量成反比。因此也可間接了解抗原抗體的分子量大小。操作步驟1）溶解瓊脂培養(yǎng)基，練習抗原、抗體雙向擴散試驗的載玻片鋪板、打孔的方法。每組選出一塊兩邊均打好梅花孔的載玻片。梅花孔孔徑3mm，孔距4mm。2）加樣：A測定抗原效價：在一組梅花孔中，以上方為第一孔，順時針方向分別為2

34、、3、4、5、6孔。加入1：4、1：8、1：16、1：32、1：64稀釋的抗原10ul；在中間孔加入抗體（1：4稀釋）10ul。B、樣品血清抗原檢測：在另一組梅花孔中，以上方為第一孔，順時針方向分別為2、3、4、5、6孔。在1、4孔中加入生理鹽水，作為陰性對照；2、5孔中加入1：4稀釋的抗原做陽性對照；3、6孔中加入1：20稀釋的待檢血清各10ul；在中間孔加入抗體（1：4稀釋）10ul。3）擴散：將加好樣的瓊脂板平放于濕盒內，置30溫箱或室溫擴散2448小時，觀察、分析實驗結果。作業(yè)：實驗報告 附：環(huán)狀沉淀試驗 目的要求1、了解環(huán)狀沉淀試驗的原理及用途2、通過沉淀素的效價測定，學習環(huán)狀沉淀試

35、驗的操作方法及觀察結果的方法。材料和試劑1、 人血清；2、 兔抗人血清3、 生理鹽水。器具1、 沉淀管（2.53.0mm的內徑，約30mm長）8支/組2、 5ml小試管7支/組3、 毛細吸管2支/組、吸管2支/組4、 記號筆1支/組5、 沉淀管架1支/組，50-100ml燒杯1個/組。操作步驟3.取8支沉淀管于試管架上并編號。4.用毛細吸管吸取1:2的兔抗人血清于各沉淀管底部,每管2滴。5.用另一毛細吸管吸取上面已稀釋好的人血清,按下表加入各管。沉淀管 1 2 3 4 5 6 7 8加液時應從最高稀釋度(第7管)加起,沿管壁徐徐加入,使兩液面間形成一明顯界面,切勿使之相混,如界面不清時應重做。

36、第8管加生理鹽水以作對照。6.于室溫中靜置1530分鐘后觀察結果,觀察二液面交界處有無乳白色沉淀環(huán)出現(xiàn)。凡有乳白色沉淀環(huán)出現(xiàn)者記作(+),無沉淀環(huán)者記作(-)。最高稀釋度的抗原與抗體交界面之間仍有乳白色沉淀者,該管的稀釋度即為沉淀素的效價。作業(yè)與思考題1、將試驗結果填入表中：試管12345678抗原稀釋度1：501：1001：2001：4001：8001：16001：3200生理鹽水結果沉淀素的效價是多少？2、 簡述環(huán)狀沉淀試驗的用途。3、 試比較凝集反應與沉淀反應的異同。4、請設計一個實驗用于鑒定血跡是人血還是動物血。備注：實驗前請仔細閱讀免疫學實驗P119-122實驗九、巨噬細胞的體內吞噬

37、試驗目的要求 1、 通過實驗，了解巨噬細胞在非特異性免疫中的作用。2、 觀察巨噬細胞吞噬雞紅細胞的現(xiàn)象。3、 掌握吞噬細胞百分數(shù)和吞噬指數(shù)的計算方法。實驗動物 小白鼠1只/組，共需10只/班試劑 1%雞紅細胞50ml。 6%可溶性淀粉肉湯50ml。 瑞特氏染色液50ml/組。 無鈣鎂Hanks液腹腔灌洗液。 PH7.07.2 磷酸鹽緩沖液50ml/組； 1%戊二醛固定液50 ml/組。器材 無菌1ml、2ml注射器及針頭各2支/組； 酒精棉球適量； 載玻片6片/組 計數(shù)器2個/組操作步驟* 小白鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能試驗(1)試驗前三天,每只小白鼠腹腔內注射6%淀粉肉湯1m1。(2)試驗當天,

38、給小白鼠注射1%雞紅細胞1ml。(3)注射1%雞紅細胞后約30分鐘，再于小白鼠腹腔注入灌洗液1ml輕揉腹邊緣部。約20分鐘后,用注射器吸取腹腔液少許,置于潔凈載玻片的一邊。用另一邊緣光滑的載玻片將腹腔液推向另一邊,制成薄推片,置室溫或37溫箱干燥。 固定：用1%戊二醛固定液固定23分鐘，用生理鹽水沖洗，干燥。染色:用Wright氏染液染0.51分鐘后，加雙倍量pH7.07.2的磷酸鹽緩沖液混勻,并注意不要使玻片上的染料干,12分鐘后以pB緩沖液沖去染液,以濾紙吸干后鏡檢。在油鏡下觀察小白鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞現(xiàn)象,隨機計數(shù)100個巨噬細胞(M)及其中吞噬有雞血球(CRBC)的巨噬細胞的個數(shù)

39、,即為吞噬百分數(shù):吞噬百分率=100個M中吞噬CRBC的M數(shù)×100%100(M數(shù))再數(shù)此100個M中總共吞噬了多少個CRBC,將此CRBC總數(shù)除以100,得出每個M吞噬CRBC的平均數(shù),即為吞噬指數(shù)。作業(yè)與思考題1.繪圖表示所觀察到的巨噬細胞吞噬雞紅細胞的現(xiàn)象。2.計算巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)。3.為什么要在小鼠腹腔內注射6%淀粉肉湯?4.巨噬細胞除吞噬清除異物外,還有哪些功能?5.請設計一個試驗方案用以檢測某一保健品對巨噬細胞吞噬功能的影響。備注：實驗前請仔細閱讀免疫學實驗P49-53實驗十、白細胞的體外吞噬試驗目的要求 熟悉和掌握白細胞吞噬功能試驗的方法和用途

40、。【原理】吞噬細胞主要包括血液中的中性粒細胞,巨噬細胞。當細胞或其它顆粒性異物進入機體時,吞噬細胞通過：辨認異物; 趨化和接觸; 胞飲或吞噬;消化排泄等步驟將其殺滅?！静牧稀?.菌液：葡萄球菌菌液5×109/ml，加熱10015分鐘殺死，4保存?zhèn)溆谩?.抗凝人全血(用3.8%拘橡酸納抗凝)。3.甲醇。4.快速染液甲液： 伊紅Y 1.00g無水磷酸氫二鈉 5.00g磷酸二氫鉀 6.25g蒸餾水 500 ml乙液: 美藍 0.80g天青I 0.50g無水磷酸氫二鈉 5.00g磷酸二氫鉀 6.25g蒸餾水 500 ml將甲乙兩液中的磷酸鹽先用蒸餾水溶解, 再分別加入染料, 混合溶解后,靜置24小時, 即可應用。5.小試管、載玻片、顯微鏡等。【方法】1.取抗凝血23滴于小試管內,用接種環(huán)取23環(huán)葡萄球菌菌液與抗凝血充分混勻,置37水箱孵育30分鐘。2.用接種環(huán)取出涂片,自然干燥。3.甲醇固定：滴2滴甲醇液在標本上,待自然揮發(fā)至干。4.快速染色法: 將固定好的標本片放入甲液內染3秒鐘, 水洗, 再放入乙液內染2秒鐘, 水洗, 待干后鏡檢。先用低倍鏡找到白細胞,再用油鏡觀察胞漿內吞噬的細菌?！窘Y果】可見中性粒細胞及大單核細胞漿中有許多葡萄球菌。中性粒細胞被染成藍色,胞核藍紫色,細菌呈