基于RNA-seq技術(shù)的宮頸癌與癌旁組織差異表達(dá)基因分析

1、基于rna-seq技術(shù)的宮頸癌與癌旁組織 差異表達(dá)基因分析張志珊蔣燕成陳紫萱陳婉花李愛祿李純孝福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院摘要：目的探討宮頸癌的發(fā)病機(jī)制。方法應(yīng)用rna-seq技術(shù)分析3對(duì)宮頸癌及癌旁組 織轉(zhuǎn)錄組，利用生物信息方法對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體(go)分析和通路富集 性分析。結(jié)果在宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)1755個(gè)差界表達(dá)基因，其中758個(gè)基因表達(dá) 上調(diào)，997個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。功能富集分析表明，差異基因富集于細(xì)胞粘附、dna 損傷有關(guān)的信號(hào)通路上。且宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)rab22a-bcas1等融合基因。結(jié)論 細(xì)胞粘附信號(hào)通路、rab22a-bcas1融合基因可能與宮頸癌的發(fā)生機(jī)制有關(guān)。關(guān)鍵詞：宮

2、頸癌;rna-seq;轉(zhuǎn)錄組;差異表達(dá)基因;融合基因;收稿日期：2017-06-22基金：福建省自然科學(xué)基金(編號(hào):2014j01436)analysis of differently expressed genes of tumor and adjacentnon一tumor tissues from patients with cervical cancer by rna sequencingzhang zhishan jiang yancheng chen zixuanquanzhou first hospital, fujian medicaluniversity;abstract：o

3、bjective to explore the possible pathogenesy of cervical cancer. methods rna sequencing was performed to screen the differently expressed genes of 3 pairs of cervical carcinoma and matched adjacent non-tirnior tissues. the differently expressed genes were identified with gene ontology (go) analysis

4、and pathway cnrichment emalysis. rcsuits there were a t otal of 1755 cliff ere ntly expressed genes in the samples, including 758 up-regulated genes and 997 down-regulated genes. these differently expressed genes were enriched in pathway related to cell adhesion and dna damage. moreover, rab22 a-bca

5、s1 fusion gene was found in cervical ceincer tissues. conclusion the pathway of cell adhesion and rab22 a-bcas1 fusion gene may be related to the tumorigenesis and development of cervical cancer.keyword：cervical careinoma; rna-seq; transcriptome; differently expressed gene; fusion gene;received： 201

6、7-06-22宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，人乳頭狀瘤病毒(hpv)的感染是引起宮 頸癌的重要因素，但并非所有感染hpv的患者都會(huì)發(fā)展為宮頸癌，只有hpv持續(xù) 感染導(dǎo)致細(xì)胞的基因組異常才最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。本研究擬收集福建醫(yī)科大 學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院婦科就診的宮頸癌患者3例，釆用rna-seq技術(shù)分析宮頸癌 組織與癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組，篩選出差異表達(dá)基因，進(jìn)而分析差異表達(dá)基因所涉 及的信號(hào)通路以及融合基因表達(dá)，有利于闡明宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找宮頸癌 特異的分子標(biāo)志物，同時(shí)也為基因藥物的開發(fā)提供候選的藥物作用靶點(diǎn)。1材料與方法1.1研究對(duì)象收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院婦科就診的宮頸癌患者3例

7、，術(shù)前經(jīng)未經(jīng) 放化療及藥物治療，經(jīng)病理組織學(xué)確診為宮頸癌iib期，同時(shí)取癌組織和癌旁 組織(距離宮頸癌癌灶邊緣3 cm),置于rna保存液中-80°c保存。1.2 rna提取及質(zhì)檢3對(duì)癌組織及癌旁組織分別用qiagen微量rna提取試劑盒按操作說(shuō)明書提取 rna。瓊脂糖凝膠電泳分析rna的純度和完整性，nanodrop檢測(cè)rna的純度(0d 260/280比值),qubit 2.0對(duì)rna濃度進(jìn)行精確定量,agilent 2100精確檢測(cè) rna的完整性。1. 3文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 用帶有oligo (d t)的磁珠富集真核生物mrna,加入fragmentationbuffer將 mr

8、ta打斷成短片段，以mr-na為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers) 合成一鏈c dna,加入緩沖液、d ntps和dma polymerase i和rnase h合成二 鏈c dna,利用ampurc xp beads純化雙鏈c dna。純化的雙鏈c dna先進(jìn)行末 端修復(fù)、加a尾并連接測(cè)序接頭，再用ampure xpbeads進(jìn)行片段大小選擇。采 取pcr擴(kuò)增，用ampure xp beads純化pcr產(chǎn)物，得到文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先 使用qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)，使用agilent2100對(duì)文庫(kù)的插入片段 進(jìn)行檢測(cè)，使用q-pcr方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度

9、進(jìn)行準(zhǔn)確定量，保證文庫(kù)質(zhì)量。文 庫(kù)檢測(cè)合格后，使用illumina高通量測(cè)序平臺(tái)(hi scq/mi sep)進(jìn)行測(cè)序。1. 4測(cè)序數(shù)據(jù)分析測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量主要分布在q30以上，才能保證后續(xù)高級(jí)分析的正常進(jìn)行。將原 始數(shù)據(jù)中包含的接頭(adapter)信息、低質(zhì)量堿基、未測(cè)出的堿基去除，得到 最終的有效數(shù)據(jù)(clean data)。利用top hat2軟件將獲得的數(shù)據(jù)與參考基因 組進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)到指定的參考基因組上的reads稱為mapped reads,利 用cufflinks軟件將mapped reads進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本拼接，利用cufflinks軟件計(jì)算 癌組織和癌旁組織基因表達(dá)量。1. 5

10、差異表達(dá)基因篩選應(yīng)用cuff di ff軟件進(jìn)行分析，在不同樣本組差異表達(dá)rna檢測(cè)過(guò)程中，將fold change2且fdr0. 05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異倍數(shù)(fold change)表示兩樣品間 表達(dá)量的比值。1. 6差異表達(dá)基因通路富集及基因本體(go)分析應(yīng)用信號(hào)通路分析軟件(ipa)對(duì)2組樣木差異表達(dá)基因進(jìn)行信號(hào)通路富集、疾 病功能富集分析，利用軟david工具進(jìn)行g(shù)0分析。1. 7融合基因分析應(yīng)用top hat fusion分析融合基因，tophat fusion通過(guò)將未能比對(duì)到參考基 因組的reads打碎成25 bp的片段，然后采用bowtie將25 bp的片段比對(duì)到基 因組，從而

11、找岀比對(duì)到兩個(gè)染色體的片段或者比對(duì)到同一染色體不同位置的 readso2結(jié)果2.1差異表達(dá)基因分析將癌組織和癌旁組織相比，共發(fā)現(xiàn)1755個(gè)差異表達(dá)基因，癌組織相對(duì)于癌旁組 織樣本中有758個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，997個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)。2. 2 go及通路分析 1755個(gè)差異基因共富集到582條go_bp, 1755個(gè)差異表達(dá)基因共富集到378條 通路。這些差異表達(dá)的基因主要涉應(yīng)粘附、dna損傷等通路。最有意義的前5條 信號(hào)通路富集結(jié)果如表1所示。表1癌組織和癌旁組織差界表達(dá)基因前5條信號(hào)通路富集結(jié)果下載原表2. 3融合基因分析癌組織屮存在的融合基因，分析結(jié)果及說(shuō)明見表2。表2融合基因分析結(jié)果及說(shuō)明

12、下載原表3討論雖然高危型hpv的持續(xù)感染是引起宮頸癌的根本原因，但僅有一小部分感染者 發(fā)展為宮頸癌£11。目前眾多研究證實(shí)宮頸組織基因水平上表達(dá)異常會(huì)誘發(fā)宮頸 癌的發(fā)生宜。rna-seq技術(shù)不僅能檢測(cè)組織已知基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，還能檢測(cè)未 知基因rl本研究中收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院婦科就診的宮頸癌患者3例，采 取rna-seq技術(shù)，共發(fā)現(xiàn)1755個(gè)差異表達(dá)基因，共富集到582條go種類和378 條通路，這些差異表達(dá)的基因主要涉及粘附、dna損傷等通路。排在前2位的通 路均與細(xì)胞粘附和滲出有關(guān)，而細(xì)胞粘附分子在細(xì)胞的粘附與滲出中起重要的 作用。研究顯示細(xì)胞粘附分子與宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移

13、有密切關(guān)系。在宮頸癌的形成、 發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，細(xì)胞粘附分子起著至關(guān)重要的作用皿?；罨准?xì)胞粘附分 子在不同惡變程度宮頸癌屮的表達(dá)存在差異，并在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程屮表 達(dá)量呈上升趨勢(shì)固。因此我們推測(cè)與細(xì)胞粘附相關(guān)的信號(hào)通路可能在宮頸癌的 發(fā)生中起一定的作用。融合基因是指兩個(gè)基因的編碼區(qū)首尾相連構(gòu)成的嵌合基因。融合基因編碼的蛋白 通常具有致癌性，會(huì)影響細(xì)胞的正常生理功能，是導(dǎo)致癌癥的主要原因之一。目 前，在肺癌、甲狀腺、乳腺癌等疾病屮，都發(fā)現(xiàn)了融合基因的存在6-7,但是 與宮頸癌的相關(guān)性尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)rna-seq技術(shù)檢測(cè)宮頸癌組織和癌旁 組織的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，3個(gè)宮頸癌組

14、織中都存在不同程度的融合 基因。其中rab22a-bcas1融合基因有2個(gè)宮頸癌樣木中同時(shí)存在orab22a是ras 相關(guān)的小g蛋白家族成員，是囊泡運(yùn)輸重要的調(diào)節(jié)因子。rab22a在包括肝癌、 黑色素瘤、卵巢癌、骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤中過(guò)表達(dá)吐1。乳腺癌擴(kuò)增序列-1 (bcas1)位于20ql3.2區(qū)域，bcas1高表達(dá)在乳腺癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作 用10, bcas1還參與三陰乳腺癌的發(fā)生11。此外，有研究表明，bcas1還與 前列腺癌、胃食管連接處腺癌、月夷腺癌相關(guān)12。rab22a. bcas1與宮頸癌的相 關(guān)性尚未見報(bào)道，而rab22a-bcas1融合基因以及本研究中發(fā)現(xiàn)的其他融合基

15、因 是否為導(dǎo)致宮頸癌的潛在致癌基因，在后續(xù)的研究中，我們將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行 進(jìn)一步的驗(yàn)證。綜上所述，我們通過(guò)高通量rna-seq技術(shù)分析宮頸癌及癌旁轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)1755 個(gè)差異表達(dá)基因，這些差異表達(dá)基因富集到與細(xì)胞粘附、dna損傷等信號(hào)通路上, 且發(fā)現(xiàn)了 rab22a-bcas1等融合基因，推測(cè)可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，為 后續(xù)進(jìn)一步研究宮頸癌的發(fā)生機(jī)制提供了新的方向和思路。參考文獻(xiàn)1 moody ca, laimins la. hunrnn papillomavirus oncoproteins:pathways totransforniationjnat rev cancer, 2010

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