雌激素脂肪酯及其酯解酶與妊娠期糖尿病相關(guān)性的研究

1、雌激素脂肪酯及其酯解酶與妊娠期糖尿病 相關(guān)性的研究The correlation between estradiol fatty acid estersand its esterase with gestational diabetes研究生： 至重筮導(dǎo)一級(jí)學(xué)科：鱉鏖匡堂論文課題起止時(shí)間：2Q!Q生Z旦=2 Q!生魚旦論文完成時(shí)間：至Q 1 2生三月中國醫(yī)科大學(xué)(遼寧)2 01 2年3月刪中國醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人申明所呈交的學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及 取得的研究成果據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論 文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也

2、不包含為獲得我?；?其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料，與我一同工作的同志對(duì)本研 究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名：蘭!翌速日期： M2，、f曠中國醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解中國醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即：研究生在 攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬中國醫(yī)科大學(xué)。本人保證畢業(yè)離 校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為中國醫(yī)科大學(xué)，且導(dǎo)師 為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國醫(yī)科大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國 家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學(xué)

3、 校可以公布學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容(保密內(nèi)容除外)，以采用影印、縮 印或其他手段保存論文論文作者簽名：乏勉一指導(dǎo)教師簽名：盔毖日目錄一、摘要中文論著摘要 1 英文論著摘要 4 二、英文縮略語 7三、論文前言翮I舌 ·” ··”芍·”8 材料與方法 9 結(jié)果 ····”· ··17 討論 “···· 20 結(jié)論 ·“·”一·24四、本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià) 25 五、參考文獻(xiàn) 26 六、附錄 30 綜述”·3

4、0 在學(xué)期間科研成績·一40致謝 ···”··”41 個(gè)人簡介 42·中文論著摘要·雌激素脂肪酸酯及其酯解酶與妊娠期糖尿病 相關(guān)性的研究目的1、比較GDM孕婦及正常孕婦血清雌激素脂肪酯(Estradiol fatty acid esters， E2FAE)及游離雌二醇(Estradiol，E2)的差異，分析E2-FAE及E2與糖、脂代謝 指標(biāo)的相關(guān)性，探討GDM的可能機(jī)理。2、檢測GDM孕婦及正常孕婦皮下脂肪組織中的激素敏感性脂肪酶(Hormonesensitive lipase，HSL)水平的變化，探討HSL與糖

5、、脂代謝的聯(lián)系。方法1、研究對(duì)象選擇中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院住院并分娩的孕晚期單胎足月孕婦31例為 研究對(duì)象(孕前體質(zhì)指數(shù)(BMI)=185，239 kgm2)。其中GDM孕婦14例(GDM 組)：孕婦年齡(3329_+589)歲，孕周(3830-*063)周，孕前體重指數(shù)(2112_+210)kgm2，孕期體重增加(1982+401)kg。正常無任何合并癥與并發(fā)癥孕婦17例(正 常對(duì)照組)：孕婦年齡(2988±372)歲，孕周(3879_+073)周，孕前體重指數(shù)(1983-+217)kgm2，孕期體重增加(1900+497)kg。2、收集標(biāo)本各組孕婦入院后空腹踮12小時(shí)，于次晨抽

6、取肘靜脈血5ml，提取血清，一80低溫冰箱保存，待測定血清糖脂代謝指標(biāo)、E2FAE、E2。皮下脂肪標(biāo)本于剖宮 產(chǎn)手術(shù)中采集，立即放入液氮罐并轉(zhuǎn)運(yùn)到一80低溫冰箱保存?zhèn)溆茫郎y定HSL 蛋白表達(dá)。該研究得到中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，每位參加研究的孕婦 均簽訂知情同意書。由于收集皮下脂肪組織有一定限制，GDM組收集皮下脂肪組織8例，正常組收集皮下脂肪組織9例。3、測定指標(biāo)及方法(1)孕婦年齡、分娩孕周、收縮壓(Systolic blood pressure，SBP)、舒張壓 (Di舔tolic Mood pressure)、孕前體重、身高等基本信息從住院病歷及詢問病史中 獲得，空腹血糖(Fa

7、sting blood glucose，F(xiàn)BG)、血清總膽固醇(Total cholesterol， TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein， LDL)、高密度脂蛋白(nigh density lipoprotein HDL)，載脂蛋白A-I(Apo A-I)， 載脂蛋白B(ApoB)等指標(biāo)查閱化驗(yàn)結(jié)果獲得。(2)改良銅試劑比色法測定血清游離脂肪酸(Free fat acid，n狐)水平。酶 聯(lián)免疫法測定血清空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平。采用HOMA穩(wěn)態(tài)模型計(jì)算HOMA-IR，HOMA-m=

8、FBG×FS225，HOMA-IR數(shù)值越大表明胰島素抵抗程度越重； (3)采用時(shí)間分辨熒光免疫分析測定兩組孕婦血清E2FAE和游離E2濃度。比較兩組孕婦血清E2FAE和游離E2水平的變化，并分析其與糖、脂代謝指標(biāo)之 間的關(guān)系；(4)Western blot半定量法測量兩組孕婦皮下脂肪組織HSL的蛋白水平表達(dá)，并分析其與血清糖、脂代謝指標(biāo)之間的關(guān)系。4、統(tǒng)計(jì)方法采用SPSSl70統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(工±s)表示，兩 組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析。以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。結(jié)果1、GDM組FINS、HOMA-IR及F

9、FA明顯高于正常對(duì)照組(P-003，P-0049， P=0oo)。患者年齡、孕周、孕前體重增長、DBP、SBP、TG、TC、LDL、HDL、 FBG、舢地“I、AimB水平在兩組之間無明顯差異(P>005)。2、血清E2FAE、E2及血清E2-FAEE2在兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P2>O05)。3、血清E2FAE水平與HOMA-IR呈正相關(guān)(r-043，P=O02)，E2水平與FBG 呈正相關(guān)(仁040，P=003)。3、GDM組皮下脂肪HSL蛋白表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組(P-002)。4、皮下脂肪組織HSL蛋白表達(dá)與FFA、FINS、HOMA-IR及E2FAE均呈 負(fù)相關(guān)(r=-

10、065，P-002；r=-070，P=001 r=-059，P=004；r=-056，P=003)。結(jié)論1、GDM孕婦存在高胰島素血癥、高胰島素抵抗和高血中FFA。2、GDM組和正常組血清E2FAE和游離E2水平?jīng)]有明顯差異，但血清E2-FAE水平與HOMA-IR呈正相關(guān)。血清游離E2水平與FBG呈正相關(guān)，提示血 清E2FAE和游離E2與糖代謝可能存在聯(lián)系。3、GDM患者皮下脂肪HSL蛋白表達(dá)下降，且皮下脂肪組織HSL蛋白表達(dá) 與FFA、FINS、HOMA-IR及E2-FAE均呈負(fù)相關(guān)，提示HSL可能通過脂代謝及 E2FAE的水解，影響胰島素抵抗，參與GDM發(fā)病及發(fā)展。關(guān)鍵詞妊娠期糖尿病：胰島

11、素抵抗；雌激素；雌激素脂肪酯；激素敏感性酯解酶；3·英文論著摘要·The correlation between estradiol fatty acid esters and its esterase with gestational diabetesObjectives1、To detect the serum level of the estradiol fatty acid esters(E2-FAE)and free eatradiol(E2)in the gestational diabetes mellitns(GDM)group and control gr

12、oup， and thief correlation with lipid and glucose metabolism2、To determine the expression of hormone-sensitive lipase(HSL)in subcutaneousf缸o(hù)f GDM group and control group，and to explore the correlation between HSL andlipid and glucose metabolismMate：rials and methods1、SubjectsThe subjects were 31 ter

13、m pregnant women who visited the Shengjing hospital， They were divided into two groups：GDM group and control groupGDM group：age (3329+_589)years，gestational week(3830_+063)week，progestationBMI(2112_+210)kgm2,weight gain in the gestational(1982+401)kgControl group：age (2988+_372) years，gestational we

14、ek(3879_+073)week，progestation BMI (1983+217)kgm2,weight gain in the gestational(1900_+497)kg2、Collection of blood and tissue samplesAfter overnight fasting,a 5一mL sample of blood in EDTA(1 mgmL)was obtained from each woman who volunteered tO participate in the studyThe samples were stored at·8

15、0until analysisSubcutaneous fat Was obtained from cesarean section and then stored at-80until analysisThe study Was approved by the ethicsCommittee，and all the women participating in the study gave informed written4consentbut because the limitation of the select of subcutaneous fat，there was eight G

16、DM subjects provided the subcutancous fat，and 9 control subjects provided the subcutaneous fat3、Measurements and methods(1)The age、gestational week、SBP、DBP、height、progestation weight of the subjects we坨collected from the clinical historyThe fasting blood glucose、total cholesterol、triglyceride、low de

17、nsity lipoprotein、high density lipoprotein、Aim A-I、ApoB were collected from clinical analysis results(2)Serum free fat acid(FFA)was messureed by improved cyclohexane oxalyl dihydrazone colorimetric method,and the level of serum fasting insulin Was messureed by euzymelinked immunosorbent assayInsulin

18、 resistance Was estimated using the homeostatic model assessmentinsulin resistance(HOMA-m)index，calculated as(FBGxFINS)225(3)The concentrations of E2-FAE and free E2 in serum were determined by time·resolved fluoroimmunoassay Cm·F認(rèn))The changes of serum E2-FAE and free E2 concentrations in

19、subjects with two groups and the correlation between them and metabolic indicators were analyzed(4)HSL protein levels in subcutaneous fat tissue were analyzed by Western blotThe correlation between protein levels of HSL and metabolic indicators wereperformed3、Statistical analysisAll data are express

20、ed as means_+SEMThe significance of the difference in mean values between GDM group and control group Statistical significance was evaluated using the t testThe correlation analysis USeS the near correlation analysisStatistical significance Was set at a P value of less than 005Resultsl、Serum FINS、HO

21、MA-IR and FFA levels were higher in GDM group than5control group(P-O03，P=0049，P=0oo)The age、gestational week、SBP、DBP、TG、TC、LDL、HDL、FBG、APOA-I、APOB levels didnt differ in tWO groups(P>O05)The results of E2-FAE、free E2 concentrations and the ratios of E2-FAE tO freeE2showed no significant differenc

22、e betWeen tWo groups(P>O05)2、The serum E2-FAE and HOMA-IR positively correlates to each other(r=043， P=002)ne serum concentrations of E2 correlated positively to FBG(蘆O40， P-003)3、The HSL protein level in subcutanous fat was lower in GDM group than controlgroup(P=001)4，The HSL protein level corre

23、lated negatively with serum FFA，F(xiàn)INS，HOMA-IR and E2-FAE(r=-065，P-002：r=-070，P=001：r=-059，P=004；r=-056，P=003)。Conclusionl、GDM patients has high insulinemia,high insulin resistance and high levels of眥2、The results of E2-FAE、free E2 concentrations showed no significant difference betWeen GDM group and

24、control group，The$crum E2一FAE and HOMA-IR positively correlates to each otherThe serum concentrations of E2 correlated positively to FBG S0 E2-FAE and free E2 perhaps has closely correlation with glucose metabolism3、The HSL protein level in subcutanous fat Was lower in GDM group than control group，a

25、nd its level correlated negatively with serum FFA、FINS、HOMA-IR and E2-FAE Therefore，HSL protein has closely correlation with lipid and glucose metabolismMay be HSL involved in the incidence and the severity of the GDMKey wordsGestational diabetes mellitus；Insulin resiatance；Estradiol；Estradiol fatty

26、 acidester；Hormone sensitive lipase6·英文縮略語·7·論文·雌激素脂肪酸酯及其酯解酶與妊娠期糖尿病 相關(guān)性的研究刖吾妊娠期糖尿病(Gestational Diabetes Mellitus，GDM)是在妊娠期首次發(fā)現(xiàn)或發(fā) 生的糖代謝異常，GDM發(fā)生率在世界各國報(bào)道為1-14i¨。GDM的發(fā)病機(jī)制并未 完全確定。經(jīng)典觀點(diǎn)認(rèn)為孕期胎盤生乳素、催乳素、糖皮質(zhì)激素、雌激素及孕激 素等拮抗胰島素激素水平的升高及其造成的胰島素抵抗(Insulin，m)狀態(tài)是主要 原因12l。雌激素既參與脂代謝，同時(shí)又參與胰島素抵抗，雌激

27、素在脂肪組織中的含量 明顯高于血液中的濃度，大約為血液中的十倍左右，而脂肪組織的雌激素多以雌 激素脂肪酯(髂tradiol fatty acid esters，E2FAE)的形式存在I孤。作為一種長效雌 激素，E2-FAE是雌二醇(1radiol，E2)與長鏈脂肪酸通過酯化作用形成的一類親脂 性雌激素衍生物【4l。血清中的E2-FAE是E2與脂肪酸在高密度脂蛋I蘭t(High density lipopfitein，HDL)協(xié)同的卵磷脂一膽固醇酯轉(zhuǎn)移酶催化作用下生成，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)到 其他脂蛋白顆粒，如低密度脂蛋白(hlw density lipoprotein，LDL)和極低密度脂 蛋白(Very

28、 low density lipoprotein，VLDL)【51。E2·FAE同游離E2一樣在孕晚期婦女血漿中表達(dá)增加，大約四分之三的E2FAE包含于脂蛋白 61。目前尚不完全清楚其 在妊娠婦女及非孕婦女體內(nèi)的生理作用，Shwaery等報(bào)道f7uIE2FAEn-I能作為一種 抗氧化劑保護(hù)脂蛋白氧化。LDLt辦同的E2一嶇的濃度增加可能有助于提高u)L抵 抗銅誘導(dǎo)的氧化，而GDM患者經(jīng)常伴隨著脂質(zhì)代謝異常，以及LDLg化易感性增加f鉚，U)嗡化易感性增加可引起胎盤損害進(jìn)而導(dǎo)致胎兒死亡及胎兒宮內(nèi)生長受限【lol。高脂血癥，雄激素，孕激素，高血糖均可加速LDL-g化，而維生素E，雌激 素

29、則增強(qiáng)U)L的抗氧化能力【1¨。8E2-FAE不能與雌激素及孕激素受體結(jié)合，需要水解成游離E2才能發(fā)揮其生 理作用。研究顯示，激素敏感性脂肪酶(hormone sensitive lipase。HSL)是負(fù)責(zé)催 化雌激素脂肪酯及其他甾體激素脂肪酶水解的關(guān)鍵酶【121，HSL也是脂肪分解的限速酶，能水解甘油三酯(Triglyceride，TG)、甘油二酯(Diglyceride，DG)、甘油一 酯、膽固醇酯和其他脂質(zhì)及水溶性底物，產(chǎn)生甘油和脂肪酸，在整個(gè)能量代謝中 發(fā)揮著非常重要的作用。其活性受胰島素調(diào)節(jié)，胰島素可以抑锘IJHSL的活性，在m或循環(huán)中胰島素增多時(shí)HS齬性下降1131。另

30、外瓜和糖尿病患者游離脂肪酸(Freefat acid,FFA)濃度升高，通過抑制脂肪分解可以降低血漿H劃(平，從而改善胰島素的敏感性【141。因此，E2-FAE作為E2在脂肪組織中的主要表達(dá)形式，HSL是水解E2-FAE 的關(guān)鍵酶，也是脂解的關(guān)鍵酶。它們與糖、脂代謝之間可能存在著非常密切的交 互作用。本研究通過檢測及比較GDM患者、無妊娠合并癥及并發(fā)癥的單胎孕婦 血清E2一FAE、E2水平及皮下脂肪組織中HSL蛋白水平變化，分析E2-FAE、E2 及HSL與GDM的相關(guān)性，進(jìn)而探討E2一FAE、E2及HSL在其中的可能的致病機(jī) 理。材料與方法一、研究對(duì)象選擇2010年7月到2011年1月于中國

31、醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院住院并分娩的 孕晚期單胎足月孕婦31例為研究對(duì)象(孕前體質(zhì)指數(shù)(BMI)=185239 kgm2)。 其中GDM孕婦14例(GDM組)：孕婦年齡(3329±589)歲，孕周(3830±063)周，孕前體重指數(shù)(2112±210)kgm2，孕期體重增加(1982±401) kg。正常無任何合并癥與并發(fā)癥孕婦17例(對(duì)照組)：孕婦年齡(2988±372) 歲，孕周(3879±073)周，孕前體重指數(shù)(1983±217)kgm2，孕期體重增 加(1900±497)kg。GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2010年國際

32、妊娠與糖尿病研究組織 (International Association of Diabetes and Pregnancy Study Groups，IADPSG)制定的GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)l捌，即OG3T試驗(yàn)空腹、1 h和2 h血糖診斷界值分別為951mmolL、100 mmolL和85 mmolL，三項(xiàng)中任何一項(xiàng)的值達(dá)到或超過上 述標(biāo)準(zhǔn)即可診斷GDM。BMI-體重(kg)身高2(m2)，參照2001年中國肥胖問 題工作組制定的中國成人體質(zhì)指數(shù)分類建議1161，BMI 18-239 kgm2為正常體重。二、研究方法 (一)一般資料 孕婦年齡、分娩孕周、孕產(chǎn)次、收縮壓、舒張壓、身高、體重等基本信

33、息從住院病歷及詢問病史中獲得，空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，血清總 膽固醇(Total cholesterol，TC)、TG、LDL、HDL，載脂蛋白A-I(Apo A-I)， 載脂蛋白B(ADo B)等指標(biāo)從患者住院化驗(yàn)結(jié)果中獲得。(二)標(biāo)本的采集與處理各組孕婦入院后空腹812小時(shí)，于次晨抽取肘靜脈血5ml，于3000轉(zhuǎn)分， 離心10分鐘提取血清，血清分裝后置于一踟冰箱保存?zhèn)溆?，待測量E2-FAE、 E2、空腹胰島素(Fasting insulin，F(xiàn)INS)及FFA。皮下脂肪標(biāo)本于剖宮產(chǎn)手術(shù)中采集，立即放入液氮罐并轉(zhuǎn)運(yùn)到一80低溫冰箱保存?zhèn)溆茫郎y定HSL

34、蛋白表達(dá)。該研究得到中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，每位參加研究的孕婦均簽訂知情 同意書。由于收集皮下脂肪組織有一定限制，GDM組收集皮下脂肪組織8例，正 常組收集皮下脂肪組織9例。(三)實(shí)驗(yàn)材料1、主要儀器設(shè)備(1)測量雌激素的時(shí)間分辨熒光免疫分析儀器分別為由DELFIA洗板機(jī)、 DELFIA搖板機(jī)以及多標(biāo)記檢測儀(CTOR 1420 MULTILABEL COl膩TER)， 同時(shí)配備時(shí)間分辨熒光測量的分析軟件(芬蘭Wallac公司)(2)液體閃爍計(jì)數(shù)儀(Rack-Beta,芬蘭Wallac公司) (3)一20和一80低溫冰箱(日本三洋公司) (4)真空干燥機(jī)10(5)離心機(jī)BIOFUGE(

35、美國基因有限公司) (6)恒溫金屬浴(杭州博日科技有限公司) (7)酶標(biāo)儀(8)水浴鍋 (9)電泳儀 (10)超聲粉碎器 (11)化學(xué)發(fā)光顯影儀2、雌激素和對(duì)照樣本(1)雌激素(1713一雌二醇和1713一雌二醇硬脂酸酯)由Steraloids公司購買，4保存。 (2)氚標(biāo)記的雌二醇雙油酸由化學(xué)方法合成，原材料為氚標(biāo)記的雌二醇和油 酸氯合成。 (3)對(duì)照樣本由男性血清池添加雌二醇硬脂酸組成，分別為低、中、高濃度 (相對(duì)應(yīng)的E2濃度為110 pmolL、257pmol598皮pmol)。其濃度由分光光度測定法和氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀確認(rèn)，一20保存?zhèn)溆谩?、有機(jī)溶劑和試劑(1)甲醛，己烷，醋酸乙酯

36、，為HPLC純(Rathburn，Chemicals Ltd)(2)二乙醚為蒸餾純(Rathburn,Chemicals Ltd)(3)氯仿(Merck)(4)葡聚糖凝膠LH一20(Amersham Pharmacia Biotech AB)(5)Sep-Pak C18柱(Waters Corp)(6)Lipidex 5000，甲醛混懸液內(nèi)，4保存(Packard Instrument Company) (7)TrisHCI緩沖液 (8)雌激素時(shí)間分辨熒光免疫分析盒(芬蘭Wallac公司) (9)FFA超敏測定試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)(10)蛋白提取所用試劑 Western及口細(xì)胞裂解

37、液(碧云天)11BCA蛋白弄測定試劑盒(碧云天)PBS：KCh 014克，KH2P04：01359，NaCI：409，NaHP04-12H20：09879(11)Western所用試劑SDSPAGE：分離膠緩沖液15M TrisHCI PH88：Tris：18159加50ml蒸餾水，濃鹽酸 調(diào)PH至88，再加水至100ral濃縮膠緩沖液10M TrisHCI PH68：Tris：12109加50ml蒸餾水，濃鹽酸 調(diào)PH至68，再加水至100ml30Acrbis：丙烯酰胺：299NN雙丙烯酰胺19溶于60ml蒸餾水中，37"C 水浴至溶解，補(bǔ)水至體積為100ml，避光4"C

38、保存。10SDS：SDSlog加蒸餾水90ml，68水浴至溶解，補(bǔ)水至100ml10APS：APSl00mg，加蒸餾水lml，現(xiàn)用現(xiàn)配 TEMED：實(shí)驗(yàn)室提供5X loading buffer(蛋白上樣緩沖液)：碧云天 電泳緩沖液(10X)(running buffer)：Tris：15159 Glycine：729 SDS：59，加蒸餾水至500ml，用時(shí)取100ml加入900ml蒸餾水，即為1x電泳緩沖液 轉(zhuǎn)膜緩沖液(10X)(trancferbuffer)：Tris：15159 Glycine：729加蒸餾水至500ml。用時(shí)取100ml加入700ml蒸餾水，200ml甲醇。 洗膜液(1

39、0X)(TBST)：Tris：1219NaCh 409，加蒸餾水至500ml，用時(shí)取100ml加入900ml蒸餾水，加lmlTween-20(現(xiàn)用現(xiàn)加)。Marker：Fermentas公司封閉液：5脫脂牛奶：5 g脫脂牛奶加1XTBST 100ml。一抗：HSL總蛋白抗體：兔抗人多克隆抗體，Santa公司，1：700稀釋。GAPDH 內(nèi)參(36KD)：鼠抗人單克隆抗體，Santa公司，1：10000稀釋。二抗：山羊抗兔辣根氧化酶標(biāo)記IgG：北京中杉金橋公司1：2000稀釋。山羊 抗小鼠辣根氧化酶標(biāo)記kG：北京中杉金橋公司1：2000稀釋。ECL發(fā)光液：碧云天，用時(shí)A、B液各lml混合。(四)

40、血清生化指標(biāo)的測定酶聯(lián)免疫法測定FINS水平(試劑、儀器均為美國貝克曼公司產(chǎn)品)，胰島素 抵抗評(píng)價(jià)采用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估法一胰島素抵抗指數(shù) (Homeostatic model assessment-insulimesistancc，HOMA-IR)=FINSX FBG225，改良銅試劑比色法測定血清 HA水平。(五)時(shí)間分辨熒光免疫分析測定血清E2-FAE、E：1、實(shí)驗(yàn)原理應(yīng)用TR-FIA同時(shí)測定皂化的血清E2-FAE、E2。本方法由一系列的層析法和 最后一步的TR-FIA組成。首先，采用有機(jī)溶劑萃取血清中的E2-FAE、E2。隨后， 采用層析法分離E2-FAE、E2。將E2一FAE皂化和洗滌，去

41、除血清中的可能脂質(zhì)干 擾物后，連同游離E2素一起測量。2、實(shí)驗(yàn)步驟(1)萃取質(zhì)量控制樣品包括lml的水和低、中、高濃度的對(duì)照樣品(添加 了雌二醇硬脂酸的男性血清，相應(yīng)的E2濃度為llOpmolL、257pmolL和598 pmolL)。取lml患者血清連同質(zhì)量控制樣品，加入氚標(biāo)記的雌二醇雙油酸內(nèi)參之后(2600-3500 dpm，以確定每個(gè)樣本的回收率)分別加入25ml的乙醚：乙酸乙酯(1：1，體積：體積)萃取，混合3分鐘后在干冰乙醇浴中將無機(jī)相凝固， 收集仍為液體的有機(jī)溶劑相。共萃取4次，所收集的有機(jī)溶劑相合并之后在真空 干燥機(jī)中干燥，一20保存到下一步分析。(2)葡聚糖凝膠LH-20柱層析

42、法分離E2一FAE、E2葡聚糖凝膠LH-20柱 (05emx5cm)，將萃取之后的樣品溶解于300 ul的己烷：氯仿(1：1，體積： 體積)混合液中，渦旋后上樣到LH一20柱層析上，盛樣品的試管用300ul的己烷： 氯仿混合液(1：1，體積：體積)洗兩次，洗滌液也加樣于I-1-20柱層析。用6ml 己烷：氯仿混合液(1：1，體積：體積)洗脫E2-FAE并收集。隨后，改為5ml 甲醛洗脫非酯化的游離E2。E2-FAE和游離E2分別在氮?dú)庀抡舭l(fā)至干燥，將所有 樣本溶解于lml甲醛溶液中，游離E2保存于4直到測量，E2一FAE則進(jìn)一步皂 化。(3)皂化在氮?dú)庀聦2一FAE蒸發(fā)至干燥，加入lml氫氧

43、化鉀(1 molL)，在60恒溫箱內(nèi)孵化2小時(shí)。加入lml蒸餾水，260ul鹽酸(4 molL)，混合后 在氮?dú)庀抡舭l(fā)至約lml液體剩余。(4)Sep-Pak C18柱SopPak C18柱預(yù)先用8ml甲醛以及l(fā)Oml水洗滌，加 lOml蒸餾水于皂化后的樣品中，混合后將其上樣于C18柱，先用15ml水清洗， 然后改為6ml甲醛洗脫并收集洗脫液，所得樣本在氮?dú)庀抡舭l(fā)至干燥，加入lml 甲醛后于4保存。(5)Lipidex 5000反相柱層析法應(yīng)用Lipidex 5000反相柱層析法(05em X5era)清洗樣品中的TC和其他脂質(zhì)雜質(zhì)。樣本被溶解于260ul甲醛：氯仿：水(8：2：2，體積：體積

44、：體積)混合液中，上樣于Lipidex 5000反相層析柱，試管用260ml甲醛：氯仿：水(8：2：2，體積：體積：體積)混合液洗滌2次，均上樣 于Lipidex 5000反相層析柱，隨后用4ml甲醛：氯仿：水(8：2：2，體積：體積： 體積)混合液中洗脫，收集所有的洗脫液，氮?dú)庀抡舭l(fā)至于燥后保存于lml甲醛(4)。(6)Sephadex LH-20柱層析方法基本與步驟(2)相同，葡聚糖凝膠LH一20 柱(O5cmX5cm)，將樣品溶解于300ul己烷：氯仿(1：1，體積：體積)混 合液中，渦旋后加樣到LH一加柱層析上，盛樣品的試管用300ul的己烷：氯仿(1：1，體積：體積)混合液洗兩次，洗

45、滌液也加樣于LIt-20柱層析。用6ml己烷： 氯仿(1：1，體積：體積)混合液洗脫脂溶性雜質(zhì)，隨后，改為5ml甲醛洗脫并 收集水解的E2-FAE。水解的E2一FAE在氮?dú)庀抡舭l(fā)至干燥后溶解于lml甲醛，保 存于4直到TRFIA測量。(7)TRFIA測定水解的E2一FAE和游離E2的濃度樣品蒸發(fā)至干燥后溶解于 實(shí)驗(yàn)緩沖液中，為了得到較好的精確性(所得的數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)域)， 相較于起始體積的樣品，游離E2稀釋100倍，而水解的E2一FAE不用稀釋。整個(gè) 實(shí)驗(yàn)過程的回收率由液體閃爍計(jì)數(shù)儀測得。標(biāo)準(zhǔn)品為1151836pmolL，由E2儲(chǔ)液經(jīng)實(shí)驗(yàn)緩沖液系列稀釋配制。E2儲(chǔ)液的濃度由分光光度測定

46、法確認(rèn)。TR-FIA 定量實(shí)驗(yàn)的步驟與試劑盒中的為商業(yè)時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑所校正的推薦步 驟相似，僅E2抗血清和銪示蹤劑溶液相較推薦步驟多稀釋50。(六)Western blot半定量法測定皮下脂肪HSL的蛋白表達(dá)141、脂肪組織中總蛋白的提取先用PBS洗去脂肪組織的血，約200rag脂肪組織加lml裂解液置于15ml離心管中，剪子剪碎，超聲充分粉碎，于412裂解30分鐘，然后再412，13，000×g，離心30分鐘。用注射器將脂肪塊和顆粒之間的上清液轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)離心管 中，即為蛋白樣品。2、蛋白含量的測定(1)從一20"C取出05mgmlBSA，室溫融化后，備用。

47、(2)將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加入到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(PBS)補(bǔ)足到20ul。 (3)加lul樣品到96孔板的樣品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(PBS)補(bǔ)足到20ul。各孔加入200ulBCA工作液，室溫放置2小時(shí)。酶標(biāo)儀測定597nm處OD值，繪 出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算濃度。3、SDSPAGE電泳 (1)清洗玻璃板，用蒸餾水沖洗玻璃板，并晾干。 (2)灌膠與上樣玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。先配制8分離膠15mh H20：69 ml，30 Acthis：4ml，15 M TrisHCI-38ml，10SDS：015 ml，APS：015

48、ml，TEMED：0009ml，加1-2cm水層，靜置30分鐘， 倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。配5的濃縮膠10ml，H20：68ml，30 Acrbis：17ml，10 M"Iris-HCh 125ml，10SDS：01ml，APS：01ml，TEMED：001ml，插入梳子。靜置20分鐘待膠完全凝固后，將凝膠按要求安放在電泳槽中。 將電泳緩沖液加入兩板膠之間，輕輕水平緩慢拔出梳子。上樣：Marker 5ul，每 孔70mg總蛋白。根據(jù)測得的蛋白濃度計(jì)算含70rag蛋白的溶液體積即為上樣量。 上樣前將樣品于金屬浴中100加熱5分鐘使蛋白變性?？沼嘤镜烙?X上樣緩沖 液補(bǔ)齊。(3)

49、電泳濃縮膠80伏，分離膠100伏，電泳時(shí)間為4"-5小時(shí)，至溴酚蘭 剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。4、轉(zhuǎn)膜(1)膜準(zhǔn)備預(yù)先裁好與膠條同樣大小PVDF膜，甲醇浸透5分鐘后轉(zhuǎn)膜緩 沖液浸透30分鐘；三明治裝置中的海綿墊，濾紙用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸透。(2)切膠按照Marker標(biāo)記的分子量切膠(72KD95KD，34KD-43KD)。 (3)轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))按照陰極一海綿一濾紙(2層)一凝膠一PVDF膜一濾紙 一海綿一陽極的順序鋪好膠和膜，注意不要有氣泡，安放好三明治的轉(zhuǎn)運(yùn)槽。轉(zhuǎn)膜條件為100伏，60分鐘。5、封閉將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，洗膜液稍加漂洗，HSL總蛋白和GAPDH內(nèi)參用5脫 脂奶粉封閉1小時(shí)

50、。6、一抗孵育用5脫脂牛奶按1：700比例稀釋HSL總蛋白抗體。GAPDH抗體用5脫脂奶 粉按1：10000比例稀釋，4搖晃過夜。7、二抗 (1)用1X洗膜液洗膜，洗滌5分鐘，共洗滌4次。 (2)根據(jù)說明書用TBST按1：2000比例稀釋加入辣根過氧化物酶標(biāo)記(Hl心)的二抗，室溫?fù)u晃1小時(shí)。8、化學(xué)發(fā)光 (1)用1X洗膜液洗膜，洗滌5分鐘，共洗滌4次。 (2)配發(fā)光液：A、B各取05毫升充分混勻。 (3)將膜放于玻璃板上，置于發(fā)光儀中，A、B混合液滴于PVDF膜上，熄燈，可調(diào)放光時(shí)間為3分鐘，10分鐘，可出現(xiàn)目的條帶。9、凝膠圖象分析圖片掃描保存為電腦文件，并用Image J分析軟件將圖片上

51、每個(gè)特異條帶灰 度值的數(shù)字化。目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDH的灰度值以校正誤差，所得 結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。16三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSSl70統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s) 表示，兩組問比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析。以P<005為差異有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、臨床資料、生化指標(biāo)、血清E2-FAE及E：比較GDM組的FFA、FINS、HOMA-IR均明顯高于正常對(duì)照組(P<O05)，而 年齡、孕周、孕前BMI、孕期體重增長、SBP、DBP、TG、TC、LDL、HDL、ApoAl、 ApoB、FBG在兩組差異無顯

52、著性(P>o05)，E2一FAE、E2、E2-FAE與E2的比率在兩組差異無顯著性(P>o05)，詳見表1。表1，GDM孕婦與正常對(duì)照組孕婦一般情況及生化指標(biāo)比較(x±s)17二、血清E2_FAE及E：濃度與血清生化指標(biāo)的相關(guān)性血清F_a-FAE水平與HOMA-IR水平呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r-O43，P=O02)。 血清E2水平與FBG水平呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=O鈞，P=003)，詳見表2。表2，血清E2-FAE及E2與糖、脂代謝指標(biāo)的相關(guān)性分析三、皮下脂肪HSL在兩組間的表達(dá)GDM組皮下脂肪中HSL蛋白表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組(P<005)，詳見表3 及圖118表3,

53、GDM組與正常對(duì)照組皮下脂肪組織中HSL蛋白表達(dá)(x士s夕乞 5·_HSL(84KDa)2L 5GAPDH(36KD)1一-·吼 5正常組GDM組*棚傅袈暈皿嘲-l冒景匿0圖1，GDM組與正常對(duì)照組皮下脂肪組織HSL蛋白表達(dá)四、皮下脂肪HSL蛋白表達(dá)與血清生化指標(biāo)的相關(guān)性皮下脂肪組織HSL蛋白表達(dá)與FFA、FINS、HOMA-IR及E2一FAE均呈負(fù)相 關(guān)(P<005)，詳見表4。表4，皮下脂肪組織HSL蛋白表達(dá)與糖、脂代謝指標(biāo)的相關(guān)性分析19討論一、E：在GDM孕婦的可能作用GDM是妊娠期間最常見的內(nèi)科合并癥之一，近年來發(fā)病率有逐年升高的趨 勢。GDM的發(fā)病機(jī)制還不是很清楚。由于妊娠期各種激素的抗胰島素作用，以及 孕婦體質(zhì)量增加、體內(nèi)脂類集聚，妊娠期出現(xiàn)生理性瓜狀態(tài)，這種抵抗作用于孕24_28周快速增強(qiáng)，32-34周達(dá)到高峰，有助于胎兒的營養(yǎng)供