流式細胞儀數(shù)據(jù)分析

1、流式細胞儀數(shù)據(jù)分析5.1 數(shù)據(jù)采集及顯示 光信號轉(zhuǎn)換成電壓脈沖后，再通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成為計算機能夠儲存處理的數(shù)字信號。 流式細胞儀的數(shù)據(jù)以FSC標準格式存儲，該標準由“分析細胞學(xué)協(xié)會”制定。根據(jù)FSC標準，數(shù)據(jù)存儲格式應(yīng)包括三個文件：樣本獲取文件，數(shù)據(jù)設(shè)置文件和數(shù)據(jù)分析結(jié)果。 4參數(shù)（FSC，SSC，F(xiàn)ITC和PE）的單細胞分析會生成8位數(shù)據(jù)。當單個樣品累計收集到10000個細胞時，F(xiàn)CS數(shù)據(jù)文件為80kB。 數(shù)據(jù)采集存儲完畢后，細胞亞群可以幾種不同格式顯示。單參數(shù)如FSC或FITC（FL1）可使用直方圖，橫軸表示熒光通道。縱軸表示在該通道內(nèi)收集到的細胞數(shù)量（如圖5-1）。處在同一通道的每一

2、細胞均符合該通道的信號值，而且具有相同的信號密度。通道右側(cè)信號的熒光強度明顯高于左側(cè)，越靠右側(cè)熒光亮度越強。 圖5-1 流式數(shù)據(jù)分析圖雙參數(shù)可在二維散點圖中同時顯示，X軸顯示通道1（FL1），Y軸顯示通道2（FL2）。3維圖通過X，Y，Z三個軸分別顯示每個通道的細胞量（如圖5-1）。 習(xí)題：數(shù)據(jù)采集及顯示 1 在直方圖中橫軸和縱軸分別表示 。 2 二維點圖用于顯示 參數(shù)。 3 在CellQuest軟件中3維圖中Z軸代表 。5.2 設(shè)門 通過設(shè)門的方法可以定義細胞亞群的區(qū)域。如：血樣本是混合細胞群，如果想單獨分析淋巴球細胞，可根據(jù)FSC或細胞大小，在FSC，SSC的散點圖中設(shè)門，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映

3、淋巴細胞亞群的熒光特性。 圖5-2 全血樣本中淋巴細胞亞群的數(shù)據(jù)分析圖 習(xí)題：設(shè)門 1 設(shè)門的方法通常用于分析樣本內(nèi)的指定細胞。（對 錯）5.3 細胞亞群的數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析包括從點圖中的list-mode文件中顯示數(shù)據(jù),然后統(tǒng)計點圖中的細胞分布情況。如前所述，分別有幾種形式的點圖用于顯示數(shù)據(jù)，而且可通過設(shè)門的方法區(qū)分指定的細胞亞群。 如圖5-3所示，在淋巴細胞亞群周圍設(shè)門，以單獨分析或分選該亞群細胞。 圖5-3 選定淋巴細胞亞群設(shè)門 門內(nèi)細胞的數(shù)據(jù)結(jié)果可在隨后的圖中顯示。在下面的實例中，我們將詳盡闡述細胞亞群百分含量的不同分析方法。 我們可以通過單參數(shù)直方圖，二維點圖和三維圖來分析結(jié)果。單參

4、數(shù)直方圖可定位邊界，二維點圖可設(shè)置象限標志。如果需要，還可以建立數(shù)據(jù)統(tǒng)計表以輸出結(jié)果。 直方圖可直觀單個參數(shù)的細胞數(shù)量。陰性對照用于決定直方圖中單參數(shù)的左右邊界（見圖5-4）。左圖中M1為陰性對照峰。右圖中M2為CD3 FITC陽性峰。圖5-4 陰性對照峰M1（NORM001）和CD3 FITC陽性峰M2（NORM002） 圖5-5的統(tǒng)計結(jié)果表明，整個事件共記錄了6000個細胞，門內(nèi)淋巴細胞2891個。其中M1（陰性）細胞619個，M2（CD3陽性）細胞2272個細胞。淋巴細胞亞群CD3陽性百分含量的統(tǒng)計結(jié)果為：M2：2272/2891=78.59%。 圖5-5 直方圖統(tǒng)計結(jié)果 二維點圖以雙參

5、數(shù)顯示結(jié)果，每個點表示一個或多個細胞。圖5-6為陰性對照圖，用于設(shè)定陰性對照邊界，全圖劃分為四個象限，以區(qū)分陰性細胞、單陽性細胞以及雙陽性細胞。左下象限（LL）為雙陰性細胞，左上象限（UL）為Y軸陽性細胞（CD19 PE），左下象限（LR）為X軸陽性細胞（CD3 FITC），右上象限（UR）為雙陽性細胞（CD19+/CD3+）。 圖5-6 陰性對照組(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE雙染樣本(NORM002) 如圖5-7所示，淋巴細胞亞群雙陽性細胞（CD19+/CD3+）的百分含量為：296/2839=10.43%。 圖5-7 散點圖統(tǒng)計結(jié)果 另一個分析方法是劃定區(qū)域，也就是

6、設(shè)門。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區(qū)域（如圖5-8所示）；然后統(tǒng)計該區(qū)域內(nèi)指定細胞亞群的百分含量。在圖5-9中，R4門內(nèi)為CD4陽性，CD3陰性的淋巴細胞亞群，其結(jié)果為：40/2866=1.40%。圖5-8 CD3 FITC/CD4 PE 雙染樣本分析圖 圖5-9 CD3 FITC/CD4 PE 雙染樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果 這種方法在分析不同的供體細胞時存在一個缺陷，因為如果事先定義好細胞亞群的區(qū)域或邊界，在隨后的文件中，下一個樣本的細胞亞群位置會發(fā)生變化，這就需要操作者重新調(diào)整區(qū)域或邊界位置。 為避免這種情況的發(fā)生，我們采用一種稱為集群分析（cluster analysis）的新方法。BD

7、公司的MultiSETTM 和AttractorsTM軟件就屬于集群分析軟件。該軟件的特點是會隨著整個細胞亞群的移動而移動，自動變換區(qū)域或邊界到相應(yīng)的細胞亞群位置（見圖5-10）。 圖5-10 使用Attractors分析軟件時二維點圖的前后變化對比 5.4 流式細胞儀的其它應(yīng)用以及數(shù)據(jù)分析 這些分析方法通常適用于計算離散細胞群的百分含量，對于分析單克隆細胞株分子是否呈陽性并不適用。因為單克隆細胞株是單個細胞群，在大多數(shù)情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽性，所以我們通過幾何均值法和中位法統(tǒng)計細胞熒光密度和陽性率。如果樣本的統(tǒng)計結(jié)果遠遠大于陰性對照組，那么我們認為其結(jié)果是陽性的，兩者間

8、的差異越大，說明細胞的表達越高，陽性率越高。 如圖5-11所示，左圖為單細胞群的散射光信號，右圖為陰性對照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個峰的幾何均值分別為2，5和20（從左至右）。圖5-11 單細胞株分析圖 除檢測陽性率，幾何均值法和中位法還用于分子（接合子）定量分析。QuantiCALCTM軟件就是使用中值法計算每個細胞的抗體結(jié)合位點數(shù)。如圖5-12所示，Y軸上的圓圈代表從標準曲線獲取的信息，用于計算每個細胞的接合點位數(shù)。 圖5-12 使用QuantiCALC軟件計算每個細胞的抗體結(jié)合位點數(shù) 我們使用ModFit LTTM軟件進行DNA定量分析。因為DNA峰（G0/G1期，S期和G

9、2M期）不是離散的，所以我們對曲線以下的面積進行積分，以得到每個細胞亞群的百分含量結(jié)果。 圖5-13 細胞周期的DNA直方圖 習(xí)題：數(shù)據(jù)分析 1二維點圖和一維直方圖的作用分別是什么？ 2 見圖5-4和圖5-5，CD3陰性和陽性的百分含量分別是多少。 3 LL象限代表雙陽性細胞亞群。（對 錯） 4 見圖5-6和圖5-7，淋巴細胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。 5 只能使用矩形設(shè)定細胞區(qū)域范圍。（對 錯） 6 使用區(qū)域設(shè)定法分析樣本有哪些不足。 7 避免細胞亞群移動的分析方法是什么。 8 在定量分析中我們使用哪些分析方法檢測陽性率。5.5 CellQuest和CellQuest Pro

10、軟件使用 CellQuest和CellQuest Pro軟件是目前運用最為廣泛的流式細胞儀采集及分析軟件。它運行于蘋果電腦上，優(yōu)質(zhì)的矢量圖顯示使得操作界面特別優(yōu)美?，F(xiàn)最新的微軟公司的Vista軟件也是仿蘋果操作系統(tǒng)界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro時的強大功能及視覺質(zhì)感。CellQuest和CellQuest Pro軟件主安裝在BD FACSCalibur型流式細胞儀上。1軟件數(shù)據(jù)流程 在CellQuest和CellQuest Pro軟件的數(shù)據(jù)流分為二個部分：方案和數(shù)據(jù)包。方案是指用戶可以建立采集或分析所需的直方圖或散點圖、設(shè)門并定義門與門、門與圖之間的邏輯關(guān)

11、系。可以使用方案進行數(shù)據(jù)采集或分析以往已有的數(shù)據(jù)。每個采集方案分析樣本后會生成數(shù)據(jù)包，該數(shù)據(jù)包中包括了樣本中每個顆粒在各個檢測參數(shù)上的數(shù)值，格式為FCS2.0或FCS3.0。CellQuest和CellQuest Pro方案文件的圖標CellQuest和CellQuest Pro數(shù)據(jù)文件的圖標CellQuest和CellQuest Pro軟件中還會有關(guān)于儀器設(shè)置的文件，保存所有的實驗條件。它只能由CellQuest和CellQuest Pro軟件打開。數(shù)據(jù)包必須由方案文件打開，無法單獨顯示，或者可由第三方軟件進行分析，如WinMDI。2.軟件與儀器的連接 流式細胞儀需要加電開啟后會向計算機發(fā)出

12、信息，所以如要進行實驗需要先開啟流式細胞儀，然后再開啟計算機。1、 先開儀器后開計算機，以確保儀器和計算機之間的正常通訊。2、 在蘋果菜單下點擊CellQuest和CellQuest Pro軟件。3、 從Aquire菜單下選擇connet to cytometer。3方案與數(shù)據(jù)之間的關(guān)系CellQuest和CellQuest Pro軟件的方案與數(shù)據(jù)相互獨立保存，數(shù)據(jù)包可以由任一方案文件進行分析，分析后不改變數(shù)據(jù)包中的任何數(shù)據(jù)。CellQuest和CellQuest Pro軟件中方案內(nèi)的直方圖或散點圖有三種狀態(tài)：Acquire，Analysis和Acquire-Analysis。當圖的屬性為Ac

13、quire時，此圖只限于采集下用，即只當進行檢測時它才能顯示顆粒；當圖的屬性為Analysis時，此圖只限于分析已保存的數(shù)據(jù)包，它不能用于采集數(shù)據(jù)。當圖的屬性為Acquire-Analysis時，此圖即可用于采集數(shù)據(jù)也可用于分析已有數(shù)據(jù)。所以方便起見，我們一般將方案中的直方圖或散點圖全部設(shè)為Acquire-Analysis屬性。CellQuest Pro CellQuest4方案的建立A選擇實驗參數(shù)默認情況下，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀開機后只打開一根激光器，及五個參數(shù)供選擇使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3。當我們要使用第二根激光器及FL4通道時需要勾選FL4的選項，儀器自動打開

14、633nm激光器。選擇Four Color后，儀器自動打開第二根激光器，且此時FL4可用。B,建立散點圖或直方圖，命名坐標CellQuest Pro軟件主要工作界面，軟件類似于Office word的工作面，可在A4大小的頁面上進行編輯建立各種直方圖或散點圖。使用工具條可以建立散點圖、直方圖并在圖上設(shè)立各種門。在CellQuest Pro軟件中，如果Inspector窗口開著的話，選中任意直方圖或散點圖就會出現(xiàn)該圖的屬性，其中包括有X、Y軸的參數(shù)、是否多色顯示、圖的分析或采集屬性等等。 在CellQuest軟件下，需在選擇Plot菜單，選擇Format來打開圖的屬性對話框，其中包括了關(guān)于該圖所

15、有選項。建立好直方圖或散點圖后，我們需要對所選的參數(shù)進行命名，如不修改軟件自動命名為FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4。在菜單上選擇Acquire欄目，選擇Parameter Description，可出現(xiàn)關(guān)于文件存儲和參數(shù)命名的對話框。在這個對話框中用P字母來代表每個參數(shù)，并在此對每個采集參數(shù)進行命名，F(xiàn)L1為CD3FITC，F(xiàn)L2為CD4PE。C,設(shè)門并建立門與圖之間的關(guān)系在工具欄上有左側(cè)幾個按鈕可分別矩形門、自由門、線性門、圓形門和自動門。本處重點介紹Snap-To門，它可根據(jù)細胞群體的分布自動調(diào)整門的形狀適應(yīng)細胞群體。R與G的關(guān)系R是Region的首個字母，Region一般是指

16、一個閉合形的區(qū)域，如矩形區(qū)、自由區(qū)和圓形區(qū)。區(qū)域與區(qū)域之間可以進行邏輯運算，如AND、OR、NOT等關(guān)系。當區(qū)域進行運算時軟件引進了算術(shù)公式的管理概念：Gate實際了個代數(shù)式，簡稱G，其運算式默認如下：G1 = R1，或G2=R2當我們要進行邏輯運算時，可變更為G1=R1 AND R2。此時G1就成了一個算術(shù)結(jié)果了。G1=R1 AND R2G2=R1 NOT R2G3=R1 OR R2Region List管理門，可以重命名或刪除門。Gate List是對門進行邏輯運算和標識顏色的工具。建立門與圖之間的關(guān)系打開要編輯的直方圖或散點圖的屬性對話框，選擇Gate選項，選擇門即可。D，顯示統(tǒng)計參數(shù)如何編輯這些統(tǒng)計參數(shù)選擇統(tǒng)計參數(shù)框，在Stats菜單下的Edit Statistic會變得可用，點出后出現(xiàn)統(tǒng)計參數(shù)編輯對話框。選擇任意直方圖或散點圖，在Stats下拉菜單下會有更種統(tǒng)計參數(shù)選項。對應(yīng)于不同的圖出現(xiàn)不同的統(tǒng)計參數(shù)。5儀器的操作當計算機與流式細胞儀聯(lián)機后便會出現(xiàn)以下采集控制框：在有關(guān)儀器操作所有控制選項框都在Cytometer下拉菜單下，同時按住“蘋果”鍵及1、2、3、4便可調(diào)取所有控制框： 6文件的保存及調(diào)用實驗或分析過程中所建的方