《基因工程原理》教案(完整資料)0001

1、【最新整理，下載后即可編借】基因工程原理教案（二O 二年修訂稿）安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第一章緒論重點(diǎn)：基因工程的概念和內(nèi)容，基因工程技術(shù)在現(xiàn)代生物技術(shù)中 的地位和作用。難點(diǎn)：基因工程與遺傳工程的區(qū)別。（一）前言生物工程主要有基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程等4個(gè) 部分。（二）什么是基因、基因工程應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一 具有自我復(fù)制能力的DNA分子（復(fù)制子、重組體），繼而通過 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再 進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一 DNA分子拷貝或其表達(dá)產(chǎn)物。（三）基因工程的主要內(nèi)容目的基因的制備載體的選擇和制備 DNA分子的體外連接將

2、外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞目的基因的篩選和鑒定（四）基因工程的歷史及我國開展基因工程的現(xiàn)狀第二章 基因工程的基本操作技術(shù) 重點(diǎn)：PCR技術(shù)和基因定點(diǎn)誘變技術(shù)。包括PCR技術(shù)的原理，反向PCR與染色體步移，不對(duì)稱PCR與DNA序列測定，PCR 與RAPD, RT-PCR與RNA分析；基因定點(diǎn)誘變的原理，盒式 誘變，寡核昔酸引物誘變和PCR誘變。難點(diǎn)：酶學(xué)測序的原理和程序，基因化學(xué)合成的原理和程序。（一）凝膠電泳技術(shù)在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以 DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、 RNA放到電場中，它就會(huì)由負(fù)極一正極移動(dòng)。瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯

3、酰胺凝膠電泳脈沖場凝膠電泳 RNA電泳（二）細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化作用就是一種基因型細(xì)胞（感受態(tài)細(xì)菌）從周圍介質(zhì) 中吸收來自另一種基因型細(xì)胞的DNA,進(jìn)而使原來細(xì)胞的遺傳 基因和遺傳性發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。提供轉(zhuǎn)化ONA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的 寄主菌株則稱做受體菌株。常見轉(zhuǎn)化方法有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法；化學(xué)轉(zhuǎn)化法；電穿孔法（三）核酸雜交技術(shù)所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核昔酸序列的單鏈dna 或RNA,當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形 成雙鏈的結(jié)構(gòu)。 Southern blot ； Northern blotting;斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡 雜交；菌落原位雜交注意比較核酸分子雜

4、交法的技術(shù)路線比較菌落原位雜交斑點(diǎn)雜交Southern 印跡Northern 印跡將核酸固定在膜上T預(yù)雜交（消除非特異吸附位點(diǎn)）-加入 核素標(biāo)記探針進(jìn)行雜交T漂洗膜（洗去非待異結(jié)合探針）T 放射自顯影或顯色反應(yīng)示蹤（四）DNA序列分析技術(shù)（四）DNA測序分析 DNA鏈末端合成終止法：DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；該酶能夠用21, 3 雙脫氧核昔三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核昔酸鏈的3L末 端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測序反應(yīng)中，加入模板DNA, 引物（特異性引物,如T7, T3, M13等）,DNA聚合酶,dA, dT, dG, dC和一種ddNTPo常用

5、Klcnow大片段，無53,外 切酶活性。 Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法（哈佛大學(xué)）：該方法的基本原 理是用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成 堿基的特異性切割并產(chǎn)生一組具有不同長度的DNA鏈降解產(chǎn) 物，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測DNA 片段的核昔酸序列。 DNA 雜交測序法（SBH-Scqucncing by hybridization）:如 果一段較短的ONA探針能與較長的DNA片段雜交，并形成 完全的雙鏈結(jié)構(gòu)，我們就推測在靶DNA上存在著相應(yīng)的互補(bǔ) 序列，這就是DNA雜交測序法的基本原理。用一組已知系列 的寡核昔酸短序列做為探針，同某一較長的靶D

6、NA分子雜交, 從而測定其序列。（五）基因的化學(xué)合成（六）PCR技術(shù) PCR反應(yīng)體系的設(shè)立 PCR反應(yīng)程序設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)原理 PCR技術(shù)應(yīng)用(七) 基因定點(diǎn)誘變技術(shù)使已克隆基因或DNA片段中的任何一個(gè)特定堿基發(fā)生取代、 插入或缺失變化的過程叫作基因的定點(diǎn)誘變，是基因工程和蛋白 質(zhì)工程的重要手段。盒式誘變(cqsseu mutagenesis)包括盒式取代誘變和混合寡 核昔酸誘變兩種方式。寡核昔酸引物誘變應(yīng)用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核昔 酸短片投做引物，進(jìn)行DNA復(fù)制，使寡核昔酸引物成為新合 成的DNA子鏈的一個(gè)部分 PCR誘變：重組PCR定點(diǎn)誘變、大引物誘變(八) DNA與蛋白質(zhì)相互作用凝膠阻

7、滯實(shí)驗(yàn)(Gul wtardation assay),又稱DNA遷移率變化 試驗(yàn)(DNA mobility shift assay, DMSA): DNA 與蛋白質(zhì)結(jié)合后 分子量變大，改變了遷移率，由此判斷DNA是否與蛋白質(zhì)發(fā) 生結(jié)合 DNasel印跡試驗(yàn)(DNasel foot printing)用于檢測與蛋白結(jié) 合的DNA序列的部位及特性，形象地展示出一種特殊的蛋白 質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。甲基化干擾實(shí)驗(yàn)：根據(jù)DMS （硫酸二甲酯）能夠使G殘基甲 基化，而六氫毗唳又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理。 這種技術(shù)可以檢測靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對(duì)于此 后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究

8、竟會(huì)有什么效應(yīng)，從而更加詳細(xì)地揭示 DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用的模式。DMS化學(xué)干擾的主要局 限性時(shí)，它只能使G殘基甲基化，但仍不愧為足跡實(shí)驗(yàn)的一種 有效的補(bǔ)充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質(zhì)相互作 用的精確位置。第三章基因工程的工具酶重點(diǎn)：限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和DNA聚合酶的生化特征、 作用原理和應(yīng)用領(lǐng)域。包括II型限制性內(nèi)切酶,T4DNA連接酶， 大腸桿菌DNA連接酶，大腸桿菌DNA聚合酶I, Klcnow酶， T4 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶，Taq DNA聚合酶， Pfu DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶。T4多核昔酸激酶、堿性磷酸酶和 末端轉(zhuǎn)移酶的作用原理和應(yīng)用領(lǐng)域

9、。難點(diǎn)：切口轉(zhuǎn)移與核昔酸標(biāo)記技術(shù)（一）限制性內(nèi)切酶和甲基化酶在DNA雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子，產(chǎn)生 鏈的斷裂。兩個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不 是彼此直接相對(duì)的因此，斷裂的結(jié)果形成的DNA片斷，也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。（二）DNA連接酶能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3 -輕基（OH）和5 -磷酸 基團(tuán)（-P）,在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二 酯鍵。只能連接切口（nick）,不能連接缺口（爐p）。而且被連接 的DNA鏈必需是雙螺旋DNA分子的一部分。（三）DNA聚合酶1、Kco/iPo I 的特點(diǎn)（1）具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，

10、 該酶分裂成兩個(gè)大小不同的片段，其中小片段具5 -3外切 酶活性，大片段具3 -5外切酶活性和聚合酶活性（大片段 亦稱為Klcnow片段）。（2）聚合酶活性5' 3，要求3' -OH引物和模板DNA,其延續(xù)性受反應(yīng) 條件的影響2、Klcnow 片段由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn) 生出來的大片段分子。仍具有5 一3的聚合酶活性和3 -5' 的外切酶活性，失去了全酶的5 一3外切酶活性。3、T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的DNA 聚合酶，具有5 一>3'的聚合酶活性和3' 5外切酶活性。5 &g

11、t;3聚合酶活性,1500 nt/min,為Poll的兩倍3' 5外切酶活性，可作用于ss DNA和ds DNA,其切除速度分別為40和4000nt/min4、反轉(zhuǎn)錄酶許多RNA腫瘤病毒中分離到這種酶，最常用的是來源于鳥 類骨髓母細(xì)胞瘤病毒的反轉(zhuǎn)錄酶（AMV） AMV具有oc鏈和卩鏈；住鏈具有聚合酶活性和RNase H活 性；卩鏈具有以RNA-DNA雜交分子為底物的5' ->3'脫 氧核酸外切酶活性5、T7DNA聚合酶 1978年，S. Tabor從感染了 T7噬菌體的大腸桿菌寄主細(xì)胞 中純化出來的一種聚合酶。加工形式的T7DNA聚合酶系：T7噬菌體編碼的基因5蛋

12、 白質(zhì)，另一種是大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白。基因5蛋白質(zhì)：具有聚合酶活性和3 -5'外切酶活性； 硫氧還蛋白：增強(qiáng)基因5蛋白質(zhì)與模板引物的結(jié)合力具有5 -3'的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的3->5，核酸外切酶活性。(四)DNA和RNA修飾酶1、末端脫氧核昔酸轉(zhuǎn)移酶與同聚物加尾末端脫氧核昔酸轉(zhuǎn)移酶(terminal dcoxynucl cotidyl transferase)，從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量的堿性 蛋白質(zhì)，在二甲腫酸緩沖液中，能催化脫氧核昔三磷酸進(jìn) 行5' -3'方向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核昔酸分子加 到線性DNA分子的3 -OH末端。

13、2、T4多核昔酸激酶由T4噬菌體的psuT基因編碼的一種蛋白質(zhì)，最初從T4噬菌 體感染的E. coli中分離出來。作用：催化丫-磷酸從ATP分子 轉(zhuǎn)移給DNA或者RNA的末端，不受底物分子鏈的長短限制。3、來自于大腸桿菌(bacterial alkaline phosphatase BAP)或小牛腸 (calf intestinal alkaline phosphatase CIP),用于脫去DNA (RNA) 5末端的磷酸基團(tuán)，使5 -P成為 5' -OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5'端同 位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊釪NA片段自身連接(或環(huán)化)時(shí)可進(jìn)行 脫磷酸反應(yīng)。(五)

14、核酸外切酶ss DNAdsDNA大腸桿留外切酶I (exo I)大腸桿闘外切son(exom)大腸桿菌外切酶W (exoVD)噬苗體核酸外切酶(0)T7噬菌體基因6核酸外切俾第四章原核生物基因工程的載體重點(diǎn):大腸桿菌質(zhì)粒載體，包括pBR322和pUC18/19載體構(gòu)建 原理和應(yīng)用領(lǐng)域，藍(lán)/白篩選，質(zhì)粒DNA的制備和純化；入噬菌 體載體，包括Xgtl()/ll和XEMBL3/4載體構(gòu)建原理和應(yīng)用領(lǐng)域，X 重組噬菌體的篩選；M13噬菌體載體，M13mpl8/19構(gòu)建原理和 應(yīng)用領(lǐng)域，單鏈DNA的制備；粘粒載體pJB8構(gòu)建原理和應(yīng)用領(lǐng) 域。難點(diǎn)：入重組DNA的轉(zhuǎn)移和篩選()質(zhì)粒質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)攜帶的

15、染色體外的ONA分子，是共價(jià)閉 合的環(huán)狀 DNA 分子(covalent closed circular, DNA cccDNA),大 小在12()()kb,能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制。1、氯化艷密度梯度離心 質(zhì)粒DNA占總DNA的1%2%;在細(xì)胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷 裂成線性片斷，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整 的狀態(tài)；染色劑澳化乙錠(EB)能摻入到DNA鏈的堿基中，導(dǎo)致鏈 的解旋；而且形成的EB-DNA復(fù)合物中，EB含量越高，密 度會(huì)越低。2、堿變性法根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷之間， 在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。在pH值12.012.5范圍

16、內(nèi)時(shí),線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià) 閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性。通過冷卻或恢復(fù)中性pH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速復(fù)性，通過離心去除線性染色 體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì) 粒DNA3、質(zhì)粒載體必須具備的基本條件具有復(fù)制起點(diǎn)自我增殖的基本條件，一般具一個(gè)復(fù)制子。協(xié)助維持細(xì)胞內(nèi)含有1()2()個(gè)左右的質(zhì)?？截惥哂锌咕乜剐岳硐氲馁|(zhì)粒載體具有兩種抗菌素抗性基因。以便為寄主細(xì)胞 提供易于檢測的表型性狀做為選擇信號(hào)，而且在有關(guān)的限制 酶位點(diǎn)上插入外源DNA后形成的質(zhì)粒有一個(gè)選擇標(biāo)記。具有若干限制酶切單一位點(diǎn)（MCS）;具有較小的分子量和較

17、高的拷貝數(shù)。低分子量的質(zhì)粒易于操 作，克隆外源片斷后（不超過15kb）仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體 細(xì)胞同時(shí)低分子量的質(zhì)粒對(duì)限制酶具有多重識(shí)別位點(diǎn)的幾率 也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因（二）噬菌體載體1、入噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)（1） COS位點(diǎn)線性雙鏈DNA分子兩端各有一條12皿組成的彼此完全互 補(bǔ)的5'突出單鏈注入宿主后，粘性末端互補(bǔ)形成雙鏈區(qū)，成為cos位點(diǎn)。2、插入式載體入噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來說，克隆片段較大，所以一 般用于cDNA文庫或基因組文庫的構(gòu)建。3、入替換型載體（取代型載體）外源DNA取代噬菌體染色體中對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制非必要的片段（20 kb）高感染效率（1

18、09轉(zhuǎn)化株/ug載體DNA,比質(zhì)粒高10（）倍）替換型噬菌體入是使用最廣泛的載體。4、體外包裝入重組體dna分子的轉(zhuǎn)染作用由于入噬菌體包裝時(shí)，當(dāng)DNA的長度短于野生型的75%或超 過1()5%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生 型DNA (48KB)的75%1()5%左右的DN A,要求入載體 DNA和外源DNA長度上限是51kb,必需基因?yàn)?8kb,外源 極限在23kbo(三) 噬菌粒由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列。具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便 DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在輔助噬菌體幫助下，可進(jìn) 行噬菌體

19、的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。(四) 柯斯質(zhì)粒載體(Cosmid vector ) cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記入噬菌體用于包裝的cos末端載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體 外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。 但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于 細(xì)胞內(nèi)。（五）單鏈DNA噬菌體載體M13、Fl、fd Ml3是一種含單鏈（+ ） DNA （ssDNA）的絲狀大腸桿菌 噬菌體，其基因組大小為6.4kbo這類載體主要用來獲得大 量的單鏈DNA片投，這種單鏈DNA片段在遺傳學(xué)研究 中主要用來測定DNA序列（sangtr雙

20、脫氧法）、基因的定 點(diǎn)突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。 M13噬菌體載體的寄主菌：由于M13噬菌體通過F因子編 碼的菌毛進(jìn)入宿主細(xì)胞，故只能用雄性細(xì)菌來增殖病毒。注意比較載體的特點(diǎn)：質(zhì)粒脛m體柯斯廣粒單體克隆DNA大片段+構(gòu)建基因組文庫+構(gòu)建DNA文庠+當(dāng)規(guī)的亞克隆化+構(gòu)建新型的DNA結(jié)構(gòu)+序列分析+單璉探針+外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)+（六）人工染色體隨著脈沖電泳技術(shù)的發(fā)展以及基因組研究的日益深入，對(duì)可插入 大片段DNA的克隆載體人工染色體的研究取得了迅速的發(fā) 展所謂人工染色體是一類能在生物細(xì)胞中獨(dú)立“穩(wěn)定存在和 遺傳的人工重組DNA分子”酵母人工染色體載體（yeast artificia

21、l chromosome, YAC, lOOOkb）酵母染色體DNA自主復(fù)制順序（ARS）酵母染色體的著絲粒順序（CEN）酵母染色體的端粒順序（TEL）:細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome, BAC , 3OOkb ）哺乳類人工染色體（MAC） Pl衍生人工染色體第五章基因的分離、重組和鑒定基因的克隆，實(shí)質(zhì)上包含著待研究的目的基因的分離與鑒定 兩個(gè)主要內(nèi)容，克隆步驟包括四個(gè)步驟用于基因克隆的DNA材料的選擇，及DNA分子的片段化外源DNA片段與載體分子的體外連接反應(yīng)將人工重組的DNA分子導(dǎo)入他們能夠進(jìn)行正常復(fù)制的寄 主細(xì)胞的程序?qū)χ亟M體分子的轉(zhuǎn)化子克

22、隆進(jìn)行篩選一、基因組DNA的片段化1、利用限制酶片段化基因組DNA(1) 鳥槍法(shotgun approch)(2) 隨機(jī)片段法構(gòu)建基因文庫時(shí)，最好采用隨機(jī)片段化的辦法制備克隆片段機(jī)械 切割法、限制酶局部消化法二、外源DNA片段同載體分子的重組主要依賴于核酸內(nèi)切酶與連接酶的作用，選擇外源DNA同 載體三、重組子分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑原核生物的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染：常用大腸桿菌K12突變體菌株(喪 失限制體系)四重組子分子的選擇與鑒定1、遺傳檢測法2、物理檢測法3、菌落或噬菌斑雜交篩選法4、免疫化學(xué)檢測法5、蛋白質(zhì)篩選法6、轉(zhuǎn)譯篩選法第六章基因克隆的策略從生物有機(jī)體中克隆某一特定DNA片段(或基因)的

23、實(shí)驗(yàn)程序1、cDNA基因克隆（cDNA文庫）2、基因組DNA克隆（DNA文庫）3、基因定位克?。ㄒ唬ヽDNA libraries 的構(gòu)建mRNA isolation,衛(wèi) unificationCheck thf RNA integrityFractionate and enrich mRNASynthesis of cDNA g MM. Treatment of cDNA endsLigation to vectoF（二）基因組DNA克隆基因文庫（gene libranO :用重組DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞 的總DNA或染色體DNA的所有片段隨機(jī)地連接在載體上, 然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中通過細(xì)

24、胞增殖而構(gòu)成各個(gè)片 段的克隆。當(dāng)制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部 基因都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就稱為某種 生物的基因文庫?！咀钚抡?，下載后即可編cukarv'otcs prog 基因組I）NA的片段化（物理切割和限制性內(nèi)切酵）(三) 克隆基因的分離1、應(yīng)用核酸探針可以將基因文庫或者cDNA文庫轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后， 用特異性的探針同噬菌斑或者菌落進(jìn)行雜交，可以篩選出 陽性克隆2、應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法差別雜交(differential hybridization ),又稱差別篩選 (differential screening )適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)

25、的 mRNA 的 eDNAo扣除雜交(subtractive hybridization),又叫扣除 cDNA 克隆 (subtractive cDNA cloning)，通過構(gòu)建扣除文庫得以實(shí)現(xiàn)。抑制性扣除雜交：以抑制PCR為基礎(chǔ)的DNA扣除雜交方 法3、應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)(DDRT-PCR) 一般用20種隨機(jī)引物和12種3 -端錨定引物組成的全部 240組引物對(duì)PCR擴(kuò)增后，所產(chǎn)生的大約20 ()()()條條帶， 基本涵蓋了在一定的發(fā)育階段某種類型細(xì)胞中所表達(dá)的全 部的mRNAo4、cDNA差式分析法(RDA)5、表達(dá)序列標(biāo)簽法(ESTs) ESTs (Expressed Sequence tags )是從已建好的 eDNA 庫中 隨機(jī)取出一個(gè)克隆，從5末端或3'末端對(duì)插入的eDNA 片段進(jìn)行一輪單向自動(dòng)測序，所獲得的約6()-5()()bp的一段 eDNA序列。6、基因表達(dá)系列分析法(SAGE)分離每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的特定位置的較短的單一的序列標(biāo)簽(約 9-14個(gè)堿基對(duì)，Sequence Ta